28株牛源分枝桿菌的耐藥基因突變分析

嚴 娜，王曉平，鄧可新，張 旭，鄧光存* (1.寧夏大學 生命科學學院，寧夏 銀川 750021；2.西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750021；.寧夏回族自治區(qū)第四人民醫(yī)院，寧夏 銀川 750021)

結核病(tuberculosis，TB)是一種人獸共患傳染病，嚴重威脅人類健康和公共衛(wèi)生安全。據(jù)世界衛(wèi)生組織報告，2019年全球新增約1 000萬結核病患者，其中，耐多藥結核病患者(multi-drug resistant tuberculosis，MDR-TB)約為38萬[1]。另據(jù)報道，全世界約3.1%的人TB是由牛分枝桿菌引起的[2]。由于牛和人類的密切關系，因此，預防和控制牛結核病對人類健康具有極其重要的意義。

隨著分子生物學的不斷發(fā)展，結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)耐藥分子機制逐漸被闡明，其主要有3種耐藥機制：細胞壁通透性改變，導致其滲透性或外排功能降低；耐藥質粒或轉座子介導的耐藥；由基因突變導致的耐藥[3]。研究表明，基因突變是MTB耐藥的常見機制[4]。MTB的rpoB、katG、rpsL和embB基因突變可能分別與MTB對利福平(rifampin，RFP)、異煙肼(isoniazid，INH)、鏈霉素(streptomycin，SM)和乙胺丁醇(ethambutol，EMB)的耐藥性密切相關[5]。因此，通過檢測耐藥基因的突變位點對于分析MTB的耐藥性具有重要的參考意義。

本研究擬對分離自寧夏、甘肅和新疆地區(qū)奶牛場的分枝桿菌分離株，采用16S rRNA、MPT64和多位點PCR方法對其進行菌種鑒定，采用L-J比例法對其進行藥敏試驗，隨后用DNA測序技術對10株耐藥菌和4株敏感菌進行耐藥基因檢測及突變分析，以期為我國西北地區(qū)奶牛場牛結核病的分子流行病學研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源28株牛源分枝桿菌分離自寧夏、甘肅和新疆的規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場，置于-80℃冰箱凍存。本研究納入1株MTB標準株H37Rv(ATCC27294)作為對照，由中國疾病預防控制中心國家結核病參比實驗室提供。

1.2 牛源分枝桿菌臨床分離株的培養(yǎng)及DNA提取將分離菌株均勻接種于酸性羅氏培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)，在37℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)4周后，培養(yǎng)基斜面上會出現(xiàn)菜花樣菌落，接著在羅氏(L-J)培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)4～8周，置于-80℃保存。使用柱式分枝桿菌DNA提取試劑盒(北京百奧萊博，中國)，按照說明書提取細菌基因組DNA，DNA采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。其余DNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR分析鑒定采用MTB復合種群鑒定基因16S rRNA、MPT64、Rv3349、Rv0577、Rv1510、Rv3877/8、Rv1970和Rv3120進行多位點PCR鑒定(引物序列見表1)。PCR反應體系(20 μL)：2×Power Taq MasterMix 10 μL(北京康為世紀，中國)，上游引物Forward(10 μmol/L)1 μL，下游引物Reverse(10 μmol/L)1 μL，DNA模板(10 μmol/L)1 μL，無核酸酶去離子水(ddH2O)7 μL。PCR擴增程序：95℃ 5 min 預變性；94℃ 1 min 變性，60℃ 1 min 退火，72℃ 1 min 延伸，反應35個循環(huán)；72℃ 10 min 延伸，產物4℃保存。 PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳30 min鑒定(80 V)。采用Image Lab軟件( BIO-RAD，美國)分析凝膠圖像，以標準菌株H37Rv基因組核酸作為陽性對照，結果判定依據(jù)標準見表2。

1.4 結核分枝桿菌復合菌(MTBC)藥物敏感性試驗采用L-J比例法藥敏試驗分析分離株對異煙肼、利福平、乙胺丁醇和鏈霉素4種抗結核藥物的耐藥表型，4種藥物在羅氏培養(yǎng)基中的終質量濃度分別為0.2，40.0，2.0，4.0 mg/L，以H37Rv標準菌株為陽性對照。4周后，統(tǒng)計培養(yǎng)基上菌落數(shù)量，接著根據(jù)公式進行藥敏結果判定。耐藥百分比=含藥培養(yǎng)基菌落數(shù)/對照培養(yǎng)基菌落數(shù)×100%。耐藥標準：若耐藥百分比>1%，則認為該受試菌對該抗結核藥耐藥，若耐藥百分比≤1%，則為敏感菌。

表1 MPT64基因和多位點引物序列

表2 多位點PCR鑒定依據(jù)

1.5 耐藥基因的測序驗證根據(jù)文獻檢索，篩選確定rpoB、katG、oxyR-ahpC間隔區(qū)、embB、rrs和rpsL基因的相關位點為MTB耐藥基因，通過NCBI檢索序列并設計引物(表3)。使用10株耐藥菌和4株隨機選取的全敏感菌株進行試驗。PCR反應體系(50 μL)：2×Taq Master Mix 25 μL，F(xiàn)orward(10 μmol/L)2 μL，Reverse(10 μmol/L)2 μL，ddH2O 17 μL，DNA模板4 μL。反應條件：94℃ 7 min 預變性；94℃ 1 min 變性，60℃ 1 min 退火，72℃ 1 min 延伸，35個循環(huán)；72℃ 延伸10 min，產物4℃保存?zhèn)溆?。將符合測序條件的PCR產物送至上海生工進行測序。

1.6 耐藥基因位點評價耐藥基因靈敏度與特異度計算公式如下：靈敏度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))。耐藥基因陽性預測值與陰性預測值計算公式如下：陽性預測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))；陰性預測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))。

2 結果

2.1 牛源分枝桿菌臨床株16Sr RNA及MPT64基因鑒定采用設計的分枝桿菌屬16S rRNA及MTB MPT64基因特異性引物，以MTB標準株H37Rv基因組核酸為陽性對照，ddH2O為陰性對照，對28株牛源分枝桿菌臨床株進行基因鑒定試驗，結果表明，28株臨床分離株均屬于MTB復合群(圖1)。

2.2 牛源分枝桿菌臨床株PCR鑒定結果采用多位點PCR鑒定方法通過Rv0577、Rv3349、Rv1510、Rv1970、Rv3877/8、Rv3120等6個位點進行亞型鑒定，結果表明，28株MTBC中，2株為人型MTB，26株為牛分枝桿菌(圖2)。

表3 抗一線結核藥相關耐藥基因的PCR引物序列

M.DL2000 DNA Marker；NC.陰性對照，以ddH2O為PCR模板；PC.陽性對照,以標準株H37Rv DNA為PCR模板；1～28.TB1～TB28號臨床株

2.3 MTBC藥物敏感性試驗結果通過藥敏試驗檢測了28株MTBC對4種一線抗結核藥物的表型耐藥情況。結果表明，18株MTBC對4種一線抗結核藥(SM、INH、RIF和 EMB)均敏感，10株對至少1種藥物耐藥，其中7株對INH、RIF和SM三重耐藥，2株對INH、RIF、SM和EMB四重耐藥。28株MTB對4種一線抗結核藥的耐藥率分別為30.0%(9/30),30.0%(9/30),33.3%(10/30),6.7%(2/30)(表4)。

2.4 MTBC耐藥基因突變分析異煙肼耐藥基因oxyR-ahpC在敏感株和耐藥株中均未發(fā)生突變；katG463在敏感株中突變率為25.0%(1/4)，在耐藥株中突變率為100.0%(9/9)，突變類型為精氨酸突變?yōu)榱涟彼?CGG→CTG)。利福平耐藥基因rpoB445在敏感株中未發(fā)生突變，耐藥株中突變率為10.0% (1/10)，突變類型為組氨酸突變?yōu)槔野彼?CAC→TAC)。鏈霉素耐藥基因rrs311在敏感株中未發(fā)生突變，在耐藥株中突變率為11.1%(1/9)，突變類型為絲氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?AGC→ ATC)；rpsL在敏感株和耐藥株中均未發(fā)生突變。乙胺丁醇耐藥基因embB378在敏感株中突變率為75.0%(3/4)，在耐藥株中突變率為100.0%(2/2)，突變類型為亮氨酸突變?yōu)榫彼?GAG→GCG)(表5)。

A.標準株H37Rv多位點PCR電泳；B.陰性對照多位點 PCR 電泳；C.牛型MTB多位點PCR電泳(24株之一)；D.人型MTB多位點 PCR 電泳(4株之一)。M.DL2000 DNA Marker；1～7.16S rRNA(543 bp)、Rv0577(786 bp)、Rv3349(943 bp)、Rv1510(1 033 bp)、Rvl970(1 116 bp)、Rv3877/8(999 bp)、Rv3120(404 bp)PCR產物

表4 28株MTBC對4種一線抗結核藥物的表型耐藥情況

2.5 耐藥基因與耐藥表型檢測結果以耐藥表型結果為標準評價檢測結果的符合情況。耐藥基因檢測結果：陽性PB(positive B)；陰性：NB(negative B)；耐藥表型檢測結果：陽性PA(positive A)；陰性：NA(negative A)。兩組檢測結果按照如下方式判讀得到最終檢測結果：PB-PA為真陽性，PB-NA為假陽性，NB-NA為真陰性，NB-PA為假陰性。兩組檢測結果按照如下方式判讀得到最終檢測結果：存在耐藥表型且發(fā)生了基因突變?yōu)檎骊栃?PB-PA)；無耐藥表型但發(fā)生了基因突變?yōu)榧訇栃?PB-NA)；既無耐藥表型也不發(fā)生基因突變?yōu)檎骊幮?NB-NA)；存在耐藥表型但不發(fā)生基因突變?yōu)榧訇幮?NB-PA)。根據(jù)以上判讀方式得到如下結果：異煙肼耐藥基因oxyR-ahpC假陰性9例，真陰性4例，不存在真陽性和假陽性；katG463真陽性9例，假陽性1例，真陰性3例，無假陰性；利福平耐藥基因rpoB445真陽性1例，假陰性9例，真陰性4例，無假陽性例數(shù)；鏈霉素耐藥基因rrs311真陽性1例，假陰性8例，真陰性4例，無假陽性；rpsL假陰性9例，真陰性4例，不存在真陽性和假陽性；乙胺丁醇耐藥基因embB378真陽性2例，假陽性3例，真陰性1例，無假陰性(表6)。

表5 10株MTBC耐藥株耐藥基因突變分析結果

表6 耐藥基因與耐藥表型檢測結果分布情況

2.6 耐藥基因突變預測表型耐藥的評價若以檢測結果為參照，以耐藥結果判斷菌株耐藥性的標準，oxyR-ahpC、rpsL耐藥基因突變且耐藥的菌株均為0，突變不耐藥的菌株均為100%，即通過DNA 測序分析方法檢測結核桿菌oxyR-ahpC、rpsL耐藥基因的敏感性均為0、特異性均為100%；katG463耐藥基因突變且耐藥的菌株占100%，突變不耐藥的菌株為7.7%，即通過DNA測序分析方法檢測結核桿菌katG463耐藥基因的敏感性為100%、特異性均為75%；rrs311基因突變位點突變且耐藥的菌株為11.1 %，突變不耐藥的菌株為0，即rrs311耐藥基因的敏感性為11.1%、特異性為100%；rpoB445基因突變位點突變且耐藥的菌株為10%，突變不耐藥的菌株為0，即rpoB445耐藥基因的敏感性為10%、特異性為100%；embB378耐藥基因突變且耐藥的菌株占100%，突變不耐藥的菌株為50%，即embB378耐藥基因的敏感性為100%、特異性為25%(表7)。

表7 耐藥表型與耐藥基因的相關性 %

3 討論

近年來，由于MTB耐藥率不斷增加，結核病的防控工作面臨嚴峻挑戰(zhàn)。新近研究表明，通過檢測MTB耐藥基因突變可預測耐藥表型[6]。本研究對寧夏、甘肅和新疆地區(qū)的28株分枝桿菌分離株采用多位點PCR進行鑒定，28株均屬于MTB復合群，其中2株(7.1%，2/28)為人型MTB，26(93%，26/28)株為牛分枝桿菌，提示采樣地區(qū)可能存在人與牛相互感染的情況。

MTB耐藥一直是研究熱點之一，然而目前關于牛源分枝桿菌表型耐藥的相關研究較少。本研究通過藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，28株分離株中，18株敏感，10株(35.7%，10/28)耐藥，且以耐多藥為主。耐藥基因突變位點檢測結果顯示，耐藥突變位點以katG463和embB378為主。katG基因是INH主要耐藥基因，MTB對INH產生耐藥性主要是由于katG基因發(fā)生點突變、堿基缺失或插入，導致編碼的過氧化氫酶-過氧化物酶活性降低或喪失無法活化INH[7-8]。有研究表明，在MTB耐INH臨床分離株中，最常見的是315位點密碼子突變，另外有30%～40%會發(fā)生katG基因密碼子463位的CGG-CTG突變，本研究與以往報道一致[9-10]，提示katG463位點突變可用于鑒定INH表型耐藥。在分離株中有5株耐EMB，MTB耐EMB與阿拉伯糖基轉移酶的編碼基因embABC操縱子突變或emb蛋白表達增高有關[11]。據(jù)報道，約60%的EMB耐藥菌株主要發(fā)生embB306突變，但在embB密碼子406，378，328處也存在突變[12]。在本研究中EMB耐藥菌株點突變的位置均為embB378，表明不同地區(qū)耐藥突變位點存在差異。同時分離株中有1株耐SM，MTB耐SM的主要分子機制與編碼核糖體蛋白S12的rpsL基因和編碼16S rRNA的rrs基因突變有關[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，在SM耐藥菌株中rrs和rpsL基因突變率大約分別為15%和41%[12]。本研究結果顯示rrs基因突變率為11.1%無rpsL突變，與車洋等[14]研究結果相似，研究指出SM耐藥菌株可能存在通過改變細胞壁的通透性導致耐藥。除此之外本研究中有1株耐RIF，RIF通過與菌體內RNA聚合酶的β亞基牢固結合，抑制RNA聚合酶活性，從而阻止轉錄，實現(xiàn)殺菌效果[15]。目前的研究表明，rpoB基因突變與RIF表型耐藥高度相關，通過對中國上海地區(qū)耐多藥菌株的rpoB基因進行測序分析，發(fā)現(xiàn)96.3%菌株存在rpoB點突變[16]。但本次研究顯示rpoB基因突變率為10%，可能是菌株的數(shù)量限制了突變率的穩(wěn)定性，也可能是牛源分枝桿菌耐藥性存在其他一些耐藥機制，這些耐藥機制并不是基因突變導致的耐藥，具體機制尚需進一步研究。

本研究表明，寧夏、甘肅和新疆地區(qū)奶牛場中MTB復合群主要以牛分枝桿菌為主，且存在耐多藥情況，耐藥突變位點以katG463和embB378為主。這一發(fā)現(xiàn)為我國西北地區(qū)奶牛場牛結核病的分子流行病學研究提供了一定的依據(jù)，但僅使用篩選和檢測結果進行應用還存在不足，在今后的研究中應擴大樣本數(shù)量和采樣地，篩選和驗證更多的突變位點，并進行相關機制研究。