仔豬致瀉性大腸桿菌毒力因子多重PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

畢斕婷，冀亞路，襲恒豫，張 昊，陳椿樺，姜秋杰，付殿國，牛 偉，孫長江，馮 新，呂 偉，顧敬敏*，韓文瑜* (.吉林大學 動物醫(yī)學學院，吉林 長春 006;.吉林省動物疫病預(yù)防控制中心,吉林 長春 006；.吉林農(nóng)業(yè)科技學院 動物科技學院，吉林 吉林市 0；.吉林省公主嶺市鑫源木業(yè)，吉林 公主嶺 600)

仔豬的腸道微生態(tài)系統(tǒng)尚未穩(wěn)定建立，易受病原微生物侵襲，主要癥狀為仔豬腹瀉，特別是在斷奶仔豬則更為明顯。細菌性腹瀉大多由致病性大腸桿菌引起，可引起腹瀉的致病性大腸桿菌包括腸道致病性大腸桿菌(EPEC)、腸道產(chǎn)毒素性大腸桿菌(ETEC)、腸道侵襲性大腸桿菌(EIEC)、腸道出血性大腸桿菌(EHEC)、腸聚集性大腸桿菌(EAEC)，以及腸產(chǎn)志賀樣毒素同時具有一定侵襲力的大腸桿菌(ESIES)和腸道集聚性的黏附大腸桿菌(EAggEC)[1]。其中以ETEC為主， ETEC產(chǎn)生的毒力因子中腸毒素和黏附素起著重要的作用。腸毒素一般可分為耐熱腸毒素(ST)和熱敏腸毒素(LT)，兩種腸毒素既可單獨產(chǎn)生，又可同時產(chǎn)生，且與LT相比，ST在由ETEC引起的幼畜腹瀉性疾病中具有重要地位。ST又分為耐熱腸毒素Ⅰ型(STa)和耐熱腸毒素Ⅱ型(STb)[2]。腸凝集性大腸桿菌耐熱腸毒素Ⅰ(EAST1)最早發(fā)現(xiàn)于EAggEC中，后又在EPEC、ETEC、EHEC和EAEC中被發(fā)現(xiàn)[3]，其主要毒力基因為astA。為探究常見毒力因子在導(dǎo)致仔豬腹瀉的大腸桿菌中的檢出率，通過對反應(yīng)退火溫度、酶和引物添加量的優(yōu)化，建立一種針對仔豬致瀉性大腸桿菌(DEC)常見毒力因子的多重PCR檢測方法，并應(yīng)用于吉林省各豬場常見毒力因子的快速檢測及分子流行病學調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 主要材料大腸桿菌參考菌株ATCC-35401，2020年分離自吉林省31個豬場腹瀉仔豬肛拭子的881株大腸桿菌。G1000基因擴增儀(杭州博日科技有限公司)；DYY-8C型電泳儀(北京市六一儀器廠)；瓊脂糖(bioweste regular agarose G-10)；50×TAE,DL500 DNA Marker；DL1000 DNA Marker均購自TaKaRa公司。

1.2 引物的設(shè)計與合成根據(jù)GenBank中公布的大腸桿菌EAST1[4]、LT、STa[5]和STb基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 PCR引物信息

1.3 DNA模板的制備將豬場采集的樣品，通過麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美藍選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑取單個菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，采用煮沸法提取待檢菌株的DNA為模板[6]。

1.4 單一PCR方法的建立以大腸桿菌參考菌株ATCC35401為模板分別對4種毒力因子建立PCR方法。反應(yīng)體系為25 μL：上、下游引物(1 μmol/L)各0.5 μL，模板1 μL，rTaq酶12.5 μL，加ddH2O至25 μL。將反應(yīng)中退火溫度設(shè)置梯度(51.0，51.7，52.6，53.9，55.4，57.2，58.9，60.1，61.1，61.7℃)，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性20 s，梯度退火溫度20 s，72℃延伸40 s，35個循環(huán)；72℃終延伸5 min。擴增產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，90 V電泳30 min。

1.5 多重PCR方法的建立以大腸桿菌參考菌株ATCC35401為模板對4種毒力因子建立多重PCR方法。反應(yīng)體系為25 μL：上、下游引物(1 μmol/L)各0.5 μL，模板1 μL，rTaq酶12.5 μL，加ddH2O至25 μL。按照建立的單一PCR反應(yīng)進行擴增，擴增產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，90 V電泳30 min。

1.6 多重PCR方法的優(yōu)化以大腸桿菌參考菌株ATCC35401為模板，對已建立的多重PCR方法進行優(yōu)化。分別通過改變酶和引物加入量以及退火溫度來實現(xiàn)。rTaq酶添加量的優(yōu)化：反應(yīng)體系中rTaq酶添加量依次為10.0，10.5，11.0，11.5，12.0，12.5，13.0 μL。引物加入的量的優(yōu)化：反應(yīng)體系中引物添加量依次為0.25，0.50，0.75，1.00，1.25 μL。退火溫度的優(yōu)化：退火溫度依次設(shè)置為51.0，51.7，52.6，53.9，55.4，57.2，58.9，60.1，61.1，61.7℃。

1.7 多重PCR方法的特異性測試為驗證上述建立的多重PCR方法的特異性，按建立好的多重PCR反應(yīng)，以大腸桿菌參考菌株ATCC35401、李斯特菌標準菌株ATCC1911、沙門菌標準菌株ATCC14028、金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC26003和ATCC44515及大腸桿菌功能菌株DH5α的細菌基因組DNA為模板進行擴增反應(yīng)。

1.8 多重PCR方法的敏感性測試為驗證上述建立的多重PCR方法的特異性，按建立好的多重PCR反應(yīng)，以大腸桿菌參考菌株ATCC35401為模板，10倍倍比稀釋DNA模板濃度，使模板質(zhì)量濃度為132.90～1.33×10-5mg/L，進行擴增反應(yīng)。

1.9 吉林省仔豬DEC常見毒力因子的分子流行病學調(diào)查應(yīng)用建立的多重PCR方法對2020年從吉林省31個豬場腹瀉仔豬肛拭子中分離的881株大腸桿菌進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 單一PCR方法的建立使用表1的引物分別對攜帶4種毒力因子的大腸桿菌參考菌株ATCC35401的基因組DNA進行單一PCR擴增。結(jié)果顯示，4種毒力因子均能在大腸桿菌參考菌株ATCC35401的基因組DNA中擴增出目的條帶，且均與預(yù)期相符(毒力因子EAST1、STa、STb和LT產(chǎn)物長度分別為111，158，216，348 bp)(圖1)。

A.EAST1單一PCR方法的建立；B.STa單一PCR方法的建立；C.STb單一PCR方法的建立；D.LT單一PCR方法的建立。M.DL1000 DNA Marker；1～10.退火溫度分別為51.0，51.7，52.6，53.9，55.4，57.2，58.9，60.1，61.1，61.7℃

2.2 多重PCR方法的建立使用表1的引物對攜帶4種毒力因子的大腸桿菌參考菌株ATCC35401的基因組DNA進行多重PCR擴增。結(jié)果顯示，在111，158，216，348 bp處出現(xiàn)4條特異性目的條帶。4種毒力因子均能在大腸桿菌參考菌株ATCC35401的基因組DNA擴增出目的條帶，目的條帶與預(yù)期大小符合，條帶清晰且無非特異性擴增(圖2)。

2.3 多重PCR方法的優(yōu)化對多重PCR方法酶添加量的優(yōu)化見圖3A，不同添加量的rTaq酶均可擴增出目的條帶，根據(jù)目的條帶的明暗可以看出，rTaq酶的添加量在12.5～13.0 μL最為合適；對多重PCR引物添加量的優(yōu)化見圖3B，不同添加量的引物均可擴增出目的條帶，根據(jù)目的條帶的明暗可以看出，引物的添加量在0.25～0.50 μL最為合適；對多重PCR退火溫度的優(yōu)化見圖3C，退火溫度為51.0～61.7℃ 時，4種毒力因子均可擴增出與預(yù)期大小相符的目的條帶，且在61.1℃時，擴增出的目的條帶最明亮。

2.4 多重PCR方法的特異性檢測用所建立的多重PCR方法進行特異性檢測， 結(jié)果顯示(圖4) ，所建立的多重PCR方法只能特異性擴增大腸桿菌參考菌株ATCC35401，而其他菌擴增結(jié)果均為陰性，說明所建立的方法特異性良好。

2.5 多重PCR方法的敏感性檢測用所建立的多重PCR方法進行敏感性檢測，結(jié)果顯示(圖5)，在模板質(zhì)量濃度為13.29 mg/L時有特異性擴增條帶，因此該方法檢測的最低檢出質(zhì)量濃度為13.29 mg/L。

M.DL1000 DNA Marker；1～10.按照單一PCR反應(yīng)進行10次重復(fù)試驗

A.rTaq酶添加量的優(yōu)化(1～7.10.0,10.5,11.0,11.5,12.0,12.5,13.0 μL)；B.引物添加量的優(yōu)化(1～5.0.25,0.50,0.75,1.00,1.25 μL)；C.退火溫度的優(yōu)化(1～10.退火溫度分別為51.0,51.7,52.6,53.9,55.4,57.2,58.9,60.1,61.1,61.7℃)。M.DL1000 DNA Marker

M.DL1000 DNA Marker；1.大腸桿菌參考菌株ATCC35401；2.李斯特菌標準菌株ATCC1911；3.沙門菌標準菌株ATCC14028；4.金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC26003；5.金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC44515；6.大腸桿菌功能菌株DH5α

M.DL1000 DNA Marker;1.132.9 mg/L;2.13.29 mg/L;3.1.33 mg/L;4.0.13 mg/L；5.1.33×10-2mg/L;6.1.33×10-3 mg/L;7.1.33×10-4 mg/L;8.1.33×10-5 mg/L

2.6 吉林省仔豬DEC的分子流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，從31個豬場采到的881株大腸桿菌中，有317株存在所測的4種毒力因子，其中ESAT1占32.01%，LT占3.29%，STa占4.43%，STb占12.03%。EAST1每個豬場都可以檢測到且S豬場高達87.50%；LT只在A、C、E、F、G、Z共6個豬場檢測到，Z豬場占比最高為18.18%；STa在A、E、F、G、I、K、S、W、Y、LG共10個豬場檢測到，E豬場占比最高為27.27%；STb在20個豬場可以檢測到，Y豬場占比最高為40.00%。

表2 吉林省各豬場大腸桿菌毒力因子分子流行病學結(jié)果 %

3 討論

臨床上導(dǎo)致仔豬腹瀉的致病菌主要為DEC，其中以ETEC為主[7]，且仔豬腹瀉多為混合感染所致，因此鑒定腹瀉仔豬攜帶的毒力因子可為防控該病提供依據(jù)。單一PCR方法過程繁瑣且工作量大，不適用于多種毒力因子的檢測[8]。本研究建立的多重PCR方法可以快速便捷地鑒定DEC攜帶的毒力因子，為疾病診斷和分子流行病學研究提供有效措施。

多重PCR反應(yīng)中影響反應(yīng)特異性和穩(wěn)定性的因素有很多，本研究通過選取常見的4種毒力因子作為目標產(chǎn)物建立多重PCR方法并通過改變反應(yīng)引物添加量、酶添加量和退火溫度對該方法進行優(yōu)化[9]。通過對引物添加量的優(yōu)化，既可以避免引物濃度過高導(dǎo)致的錯配和非特異性，又可以避免引物濃度過低導(dǎo)致的假陰性[10]；通過對酶添加量的優(yōu)化避免rTaq酶活性過強導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性擴增片段[11]；通過對退火溫度的優(yōu)化提高PCR擴增的特異性，且在退火溫度允許的范圍內(nèi)，較高的退火溫度特異性較強[12]；還有其他條件的優(yōu)化，比如為避免出現(xiàn)多重PCR的擴增產(chǎn)物在低濃度凝膠中難以分離的情況，將凝膠濃度優(yōu)化為3%[13]。最終確定反應(yīng)體系為25 μL：上、下游引物(1 μmol/L)各0.5 μL，模板1 μL，rTaq酶12.5 μL，加ddH2O至25 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min;95℃變性20 s，61℃退火20 s，72℃延伸40 s，35個循環(huán)；72℃終延伸5 min。

本研究建立的多重PCR方法檢測的最低檢出質(zhì)量濃度為13.29 mg/L，適用于大多數(shù)采集到的大腸桿菌的基因組DNA模板。特異性測試顯示該方法對李斯特菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌功能菌株DH5α的細菌基因組DNA擴增效果均為陰性，說明該方法具有較高的特異性。為評估該方法的可行性和準確性，從豬場采集的大腸桿菌樣品中隨機選取100株進行單一PCR和多重PCR檢測，2次檢測到的毒力因子結(jié)果一致，說明該多重PCR方法的檢測結(jié)果可靠[6]。

本研究從881株大腸桿菌中，檢測出317株大腸桿菌至少攜帶1種毒力因子，檢出率為35.98%，高于張敏等[14]得出的四川省DEC檢出率(29.6%)和李月華等[15]得出的西南地區(qū)檢出率(26.92%)，這可能與豬場的衛(wèi)生防疫和生物安全有關(guān)。檢出率高的豬場要建立豬場生物安全體系，落實各項防控措施，做好消毒[16]與免疫管理[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌常見的毒力因子中EAST1檢出率最高甚至在S豬場中高達87.50%，鑒于EAST1毒力因子是多種DEC的共同毒力因子,結(jié)合本研究檢測的另外3種毒力因子的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)仔豬腹瀉大多是由多種DEC混合感染所致。

綜上所述，本研究建立的多重PCR檢測方法可以同時檢測DEC攜帶的4種毒力因子且具有較好的特異性與準確性，適用于大量樣本的檢測且成本較低、操作簡單。在后續(xù)深入研究中將著力引物特異性提升，提高該方法的敏感性避免模板濃度低導(dǎo)致的假陰性。