鑒別牛腸道病毒感染復合PCR方法的建立及初步應用

章 凡,常曉冉,王浴光,楊茗葳,米日古麗買吐送，董 坤,胡俊英,王新平,2* (.吉林大學 動物醫(yī)學學院，吉林 長春 30062；2.吉林大學 人獸共患病研究所 教育部人獸共患病研究重點實驗室,吉林 長春 30062)

腸道病毒(enterovirus,EV)為小核糖核酸病毒科腸道病毒屬成員[1-2]，其所引起的感染嚴重危害人類健康和畜牧業(yè)的發(fā)展。該病毒為無囊膜單股正鏈RNA病毒，病毒粒子大小為20～30 nm,具有典型的二十面體結構[3]。根據(jù)國際病毒分類委員會(ICTV)的最新分類，腸道病毒屬分為12個腸道病毒種(A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L)與3個鼻病毒種(A、B、C)[4],其中E種(EV-E)和F種(EV-F)主要感染牛，G種主要感染豬， H、J種主要感染靈長類動物，I種主要感染單峰駱駝，K、L為新的腸道病毒種。

牛腸道病毒(bovine enterovirus,BEV)感染于1959年首次由MOLL等[5]報道，之后許多國家也先后報道有本病的發(fā)生與流行[6-11]。李英利等[12]于2011年報道從內(nèi)蒙古腹瀉犢牛體內(nèi)分離到我國第1株EV-F，確定我國牛群存在EV-F感染。本實驗室于2012年從吉林省長春市某牛場發(fā)病牛群中分離獲得首株EV-E HY12毒株[1-2]，進而確定國內(nèi)牛群存在EV-E感染。由于EV-E和EV-F屬于兩個不同的腸道病毒種,兩者間的核苷酸差異很大，屬于不同的血清型/基因型,因而常規(guī)方法難以將其區(qū)別[12]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)許多地區(qū)牛群存在EV-E或EV-F腸道病毒感染，且某些牛群存在不同腸道病毒種的混合感染[13-15]。雖然有關檢測EV-E或EV-F的研究逐年增加，但鑒別EV-E和EV-F感染的方法尚未見有報道。因此,迫切需要建立一種快速鑒別EV-E和EV-F的方法。本研究根據(jù)GenBank收錄的EV-E和EV-F的全基因組序列比對分析結果，合成了2對特異性引物，建立了鑒別EV-E和EV-F的復合PCR方法，并初步用于臨床樣品的檢測。

1 材料與方法

1.1 病毒株和臨床樣品牛細小病毒、牛病毒性腹瀉病毒、EV-E HY12毒株、EV-F SD-S67毒株等病毒由本實驗室鑒定保存。待檢牛糞便樣本采自長春地區(qū)牛場，共計32份,樣品按常規(guī)方法處理、保存。

1.2 主要試劑和儀器TRIZol試劑、反轉錄試劑盒、TaqDNA聚合酶、DL2000 DNA Marker均購自TaKaRa公司;DNA凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司； ETC811 基因擴增儀為北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司產(chǎn)品；EPS300 電泳儀、4600SF紫外成像儀為上海天能科技有限公司產(chǎn)品； NanoDrop2000紫外可見分光光度計購自美國Thermo Forma公司；D1524R高速冷凍離心機購自北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司。

1.3 引物設計與合成根據(jù)GenBank收錄的EV-E(D00214、DQ092792、DQ092786、KU17-2420、JQ690748、KF748290)和EV-F(DQ0-92770、DQ092795、DQ092794、AY462106、LC038-188)的基因組序列，以Meg Align(DNAStar)軟件進行序列分析，利用Premier 5.0軟件設計、合成2對引物，預計擴增EV-E和EV-F的基因片段大小分別為604，288 bp。引物由生工生物科技有限公司合成，引物信息見表1。

1.4 EV-E和EV-F單一PCR方法的建立應用提取的EV-E和EV-F感染細胞的RNA,合成cDNA，并以合成的cDNA為模板，進行病毒基因片段的PCR擴增。PCR反應體系為25 μL，即于反應體系中加入2×rTaq酶12.5 μL，模板0.5 μL，上、下游引物至終濃度為10 μmol/L，最后以ddH2O補至25 μL。反應程序:95℃ 5 min;95℃ 30 s,51℃ 30 s,72℃ 30 s,共35個循環(huán);最后72℃ 10 min。同時以未加模板作為陰性對照。在此基礎上進行EV-E和EV-F單一PCR的特異性及敏感性試驗，PCR擴增產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定。

應用DNA凝膠回收試劑盒，純化和回收目的產(chǎn)物，并將其克隆到pMD18-T載體中,構建重組質粒 pMD18-EV-E和pMD18-EV-F。鑒定出的陽性重組質粒序列測定后，以紫外分光光度計測定濃度,并計算其拷貝數(shù)，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 復合PCR引物信息

1.5 復合PCR檢測方法的建立條件優(yōu)化以單一PCR擴增的條件為參考,利用梯度PCR程序對復合PCR反應體系進行優(yōu)化。以不同的退火溫度(50～60℃)和反應體系(10～30 μL)等條件進行PCR擴增。

1.6 特異性試驗應用優(yōu)化后的復合PCR方法，對混合感染EV-E和EV-F病料的cDNA及實驗室保存的陽性牛細小病毒、牛病毒性腹瀉病毒的核酸進行檢測。

1.7 敏感性試驗以不同稀釋濃度的陽性質粒為模板，進行PCR擴增,確定出PCR擴增特異性片段所需要的最低拷貝數(shù)，即PCR的敏感性。

1.8 重復性試驗以混合的EV-E和EV-F的cDNA為模板,應用建立的PCR方法重復檢測3次,確定該方法的可靠性和重復性。

1.9 應用性試驗應用建立的復合PCR方法，檢測吉林省長春地區(qū)疑似BEV感染的32份臨床樣本,并與ELISA檢測結果進行比較，計算兩者符合率。

2 結果

2.1 單一PCR擴增結果利用P1/P2和P3/P4引物分別對EV-E和EV-F陽性DNA模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳后可檢測到 604 bp(EV-E)和 288 bp(EV-F) 大小片段(圖1,2)。特異性結果均僅能擴增出EV-E或EV-F。敏感性結果顯示，擴增出的EV-E和EV-F最低拷貝數(shù)為 3.67×102，5.21×103拷貝/μL。序列測定結果顯示，大小為 604，288 bp 的片段分別為EV-E和EV-F。

A.EV-E單一PCR擴增結果(1.陰性對照;2.EV-E 擴增產(chǎn)物);B.EV-E特異性試驗(1.陰性對照;2.EV-E;3.BVDV);C.EV-E敏感性試驗(1～10.3.67×109～0拷貝;11.陰性對照); M.DL2000 DNA Marker

A.EV-F單一PCR擴增結果(1.陰性對照;2.EV-F擴增產(chǎn)物)；B.EV-F特異性試驗(1.陰性對照;2.EV-F;3.BVDV);C.EV-F敏感性試驗(1～10.3.67×109～0拷貝;11.陰性對照);M.DL2000 DNA Marker

2.2 復合PCR的擴增及條件優(yōu)化結果優(yōu)化確定出的最終反應體系為10 μL，包括2×rTaq酶5 μL；引物P1、P2、P3、P4各為0.5 μL；模板0.5 μL；去離子水2.5 μL。最佳反應程序：95℃ 5 min； 95℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 30 s ，共35個循環(huán)； 72℃ 10 min(圖3,4)。以優(yōu)化后的復合PCR的反應條件，將EV-E和EV-F的混合cDNA作為模板，進行PCR擴增，同時設陰性對照。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，可見混合cDNA組同時擴增出2條帶，其大小與單一cDNA組擴增條帶相同(圖5)。

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對照;2.5 μL;3.10 μL;4.15 μL;5.20 μL;6.25 μL;7.30 μL

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對照;2.51℃;3.52℃;4.53℃;5.54℃;6.55℃;7.56℃;8.57℃;9.58℃;10.59℃;11.60℃

2.3 復合PCR特異性結果應用復合PCR方法分別擴增EV-E和EV-F混合cDNA、牛細小病毒cDNA、牛病毒性腹瀉病毒cDNA。除EV-E和EV-F混合cDNA組擴增出2條特異性條帶，其余均未擴增出條帶，表明復合PCR具有良好的特異性(圖6)。

2.4 復合PCR的敏感性試驗結果將紫外分光光度計測定的pMD18-EV-E和pMD18-EV-F質粒充分混勻后，確定出pMD18-EV-E和pMD18-EV-F的初始拷貝數(shù)約為 3.67×1010， 5.21×1010拷貝/μL。以10-1～10-10的梯度進行稀釋，進行PCR擴增。建立的復合PCR方法檢測EV-E和EV-F的最低檢測滴度為 3.67×102，5.21×103拷貝/μL(圖7)。

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對照;2.復合PCR擴增EV-E和EV-F混合cDNA產(chǎn)物;3.EV-E PCR產(chǎn)物;4.EV-F PCR產(chǎn)物

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對照;2.EV-E和EV-F混合cDNA擴增結果;3～4.復合PCR擴增牛細小病毒和牛病毒性腹瀉病毒結果

2.5 復合PCR的重復性結果以復合PCR分別對3份樣品進行3次重復性檢測,結果EV-E和EV-F均為陽性,且陰性對照正常(圖略),說明試驗方法重復性良好。

2.6 復合PCR的初步應用結果用建立的復合PCR方法和ELISA方法對32份臨床樣品進行檢測。所建立的復合PCR方法檢測出的EV-E陽性數(shù)為9份(陽性率28.13%)，EV-F陽性數(shù)為11份(陽性率34.38%),混合感染率為15.63%。與ELISA檢測結果符合率為100.0%(圖8,表2)。

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對照;2～11.pMD18-EV-E和pMD18-EV-F混合質粒作10-1～10-10稀釋后的復合PCR結果

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對照;2～11.部分糞便樣品的復合PCR結果

表2 RT-PCR和ELISA檢測臨床樣品結果

3 討論

BEV感染為國內(nèi)新發(fā)的傳染病，有關本病的研究近年來雖然取得了一些進展，但其診斷方法與流行病學研究仍然缺乏。目前，國內(nèi)檢測 BEV感染的方法主要有病毒分離、RT-PCR、實時熒光定量PCR、雙抗體夾心ELISA等方法[16-18]，這些方法雖然在確定國內(nèi)牛群存在新發(fā)EV-E和EV-F感染方面發(fā)揮了重要作用，但由于它們只針對單一病毒血清型或基因型，因而在診斷 BEV感染中，難以揭示出牛群中的真實感染情況。本課題組前期對國內(nèi)不同地區(qū) BEV感染進行流行病學研究，發(fā)現(xiàn)國內(nèi)許多地區(qū)的牛群同時存在EV-E和EV-F病毒混合感染的情況[13-15]，導致 BEV感染的診斷與防控更加復雜。為了能夠迅速同時確定出牛群中感染BEV的基因型或血清型，本研究基于對EV-E和EV-F的基因組的比對分析結果，分別設計了特異性擴增EV-E和EV-F的引物，并以此建立了可以依據(jù)擴增片段的大小進而鑒別EV-E和EV-F感染的復合PCR方法。特異性試驗結果表明，建立的復合PCR僅能夠檢測出 BEV，具有較高的特異性；敏感性和重復性試驗結果顯示，該方法具有較高的敏感性和良好的重復性，且快速簡便，可用于 BEV基因型/血清型的鑒別及診斷與流行病學調查研究。

本試驗同時將2對引物的GC含量控制在50%～59%，以盡量降低GC含量差異對復合PCR的影響。在進行PCR反應體系及條件的優(yōu)化中，發(fā)現(xiàn)應用25 μL體系進行復合PCR反應時，EV-E的擴增效率明顯高于EV-F的擴增效率，導致EV-F檢測結果呈現(xiàn)假陰性。而在10 μL反應體系下，兩種引物擴增效率都比較高，從而使同時高效檢測EV-E和EV-F成為可能。