表達(dá)FAdV-8b Fiber蛋白重組FAdV-4的構(gòu)建與鑒定

王白玉，黃 慶，喬麒龍，楊盼盼，李永濤，王 增，楊 霞，苗玉和，趙 軍* (.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046；.福建圣維生物技術(shù)有限公司，福建 南平 35400)

我國(guó)是世界養(yǎng)殖大國(guó)，養(yǎng)殖業(yè)在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占據(jù)重要地位，畜禽疫病是嚴(yán)重阻礙養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要瓶頸之一。禽腺病毒(fowl aviadenovirus，F(xiàn)AdV)屬于腺病毒科、禽腺病毒屬，F(xiàn)AdV屬目前包括5個(gè)種共12個(gè)血清型，即A(FAdV-1)、B(FAdV-5)、C(FAdV-4，10)、D(FAdV-2，3，9，11)和E(FAdV-6，7，8a，8b)[1-2]。FAdV在養(yǎng)殖場(chǎng)廣泛存在，臨床上與FAdV感染相關(guān)的疫病主要包括由FAdV-4引起的肝炎-心包積液綜合征(hepatitis-hydropericardium syndrome,HHS)及FAdV-8b和FAdV-11引起的包涵體肝炎(inclusion body hepatitis,IBH)[3-5]。HHS主要影響3～6周齡肉雞，發(fā)病雞以心包充滿淺黃色透明液體，肝臟褪色、腫大、密布出血點(diǎn)和壞死為特征，死亡率高達(dá)20%～90%[6-7]；IBH主要影響3～5周齡雞，以肝壞死和肝細(xì)胞中出現(xiàn)嗜酸性或嗜堿性核內(nèi)包涵體為主要特征，死亡率可達(dá)到10%[8]。近年來， HHS和IBH臨床病例在世界各地不斷增多，給世界養(yǎng)禽業(yè)造成很大損失[9-12]。自2015年起由FAdV-4新基因型引起的HHS在我國(guó)河南、山東、浙江、安徽、吉林、河北、遼寧、江蘇、山西和湖北等省區(qū)雞群中大面積流行，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[13-14]。鑒于臨床上不同血清型的FAdV常出現(xiàn)混合感染，且我國(guó)目前尚未有正規(guī)商品化防控FAdV感染的多聯(lián)疫苗，研發(fā)針對(duì)FAdV-4和FAdV-8b中國(guó)流行株的高效多聯(lián)疫苗具有現(xiàn)實(shí)意義。

FAdV的纖維蛋白(Fiber)是組成病毒衣殼的主要蛋白，突出于病毒粒子表面，構(gòu)成病毒衣殼的頂端。研究表明Fiber蛋白在介導(dǎo)病毒感染、病毒與細(xì)胞相互作用和誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生病毒中和抗體等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。前期研究證明FAdV-8b Fiber亞單位疫苗能提供針對(duì)FAdV-8b的良好保護(hù)[15-16]。本課題組和其他科研團(tuán)隊(duì)前期研究表明，在中國(guó)流行的FAdV-4新基因型基因組中存在1 966 bp的自然缺失，且該缺失區(qū)可以作為外源基因的插入位點(diǎn)[17-18]。本研究利用前期建立的FAdV-4反向遺傳技術(shù)平臺(tái)將FAdV-8b的Fiber基因插入到FAdV-4中國(guó)流行株的1 966-bp缺失區(qū)，構(gòu)建出能夠表達(dá)FAdV-8b Fiber蛋白的重組FAdV-4，以期為研制防控FAdV-8b與FAdV-4混合感染的多聯(lián)疫苗提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與病毒雞肝癌細(xì)胞(LMH)購自美國(guó)ATCC，使用含有10% Gibco胎牛血清(FBS)DMEM/F12培養(yǎng)基、置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；FAdV-4中國(guó)流行株CH/HNJZ/2015 (GenBank ID：KU558760)、FAdV-8b分離株SW2021由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究所分離、鑒定及保存。

1.2 細(xì)菌與質(zhì)粒帶有RecE/RecT重組酶系統(tǒng)的大腸桿菌(E.coli)GB05-dir由山東大學(xué)微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室王海龍教授惠贈(zèng)；p15A-cm-HNJZ-1966-amp-ccdB質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，該質(zhì)粒含有FAdV-4中國(guó)流行株CH/HNJZ/2015全長(zhǎng)基因組，并在1 966 bp自然缺失區(qū)插入氨芐青霉素抗性基因(Amp)和自殺基因(ccdB)表達(dá)盒amp-ccdB。

1.3 主要試劑T4DNA連接酶、T4DNA聚合酶、EcoRⅠ、PacⅠ、PmeⅠ和XbaⅠ限制性內(nèi)切酶均購自New England Biolabs公司；QIAquick膠回收試劑盒購自QIAGEN公司；L-阿拉伯糖、氯霉素均購自Sigma-Aldrich公司；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒購自Thermo Fisher Scientific 公司；小鼠抗HIS標(biāo)簽單克隆抗體、FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG抗體購自Abcam公司；Western blot ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒購自Solarbio公司。

1.4 含有FAdV-8b Fiber基因的FAdV-4感染性克隆的構(gòu)建與鑒定利用LMH細(xì)胞培養(yǎng)FAdV-8b，用酚-氯仿抽提法提取病毒基因組DNA作為擴(kuò)增模板，以5′端帶有EcoRⅠ限制性酶切位點(diǎn)的EcoRⅠ-8bFiber-F(5′-CCGGAATTCGCCACCATGGCGA-CCTCGACTCCTCAC-3′)和5′端帶有XbaⅠ限制性酶切位點(diǎn)的XbaⅠ-his-8bFiber-R(5′-TG-CTCTAGATCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGA-GGAGCGTTGGCGGTGCTTAGGGCGGGACA-3′)為PCR引物擴(kuò)增FAdV-8b Fiber基因，擴(kuò)增的FAdV-8b Fiber基因3′端帶有六聚組氨酸標(biāo)簽，以便于后期重組病毒的鑒定。利用瓊脂糖凝膠電泳和QIAquick膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，使用EcoRⅠ和XbaⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切處理，使用T4DNA連接酶將PCR產(chǎn)物克隆入經(jīng)EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切的pCI-neo真核表達(dá)載體中，構(gòu)建pCI-neo-FAdV-8b-Fiber質(zhì)粒。以pCI-neo-FAdV-8b-Fiber質(zhì)粒為擴(kuò)增模板，利用帶有1 966 bp自然缺失區(qū)兩側(cè)同源臂的特異性引物擴(kuò)增FAdV-8b-Fiber真核表達(dá)盒CMV-FAdV-8b-Fiber-PolyA ，上游引物為1966-8bFiber-F(5′-AACATAAGAATCAGGGGTGGCCCGTATACTAATCCC-GTCACTGACGACACTCAATATTGGCCATTA-GCCA-3′)，下游引物為1966-8bFiber-R(5′-CACTCGAGAAGGAGCCTCTGAGCCGTACTC-TATGCATTGCGTGATTGTGGTACCACATTT-GTAGAGGTTT-3′)，利用瓊脂糖凝膠電泳和QIAquick膠回收試劑盒純化CMV-FAdV-8b-Fiber-PolyA。利用 ExoCET同源重組技術(shù)構(gòu)建p15A-cm-HNJZ-Fiber/FAdV-8b感染性克隆[19]，具體步驟如下：使用PacⅠ限制性內(nèi)切酶37℃過夜酶切p15A-cm-HNJZ-1966-amp-ccdB質(zhì)粒，通過T4DNA聚合酶將線性化的p15A-cm-HNJZ-1966-amp-ccdB載體與CMV-FAdV-8b-Fiber-PolyA片段進(jìn)行聚合反應(yīng)，聚合體系為200 ng 的CMV-FAdV-8b-Fiber-PolyA、2 μg的線性化p15A-cm-HNJZ-1966-Amp-ccdB、2 μL 的10×NEB Buffer 2.1,0.2 μL的T4DNA聚合酶、加入雙蒸水補(bǔ)足體系至20 μL，反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 1 h,75℃ 20 min,50℃ 30 min；將反應(yīng)體系電轉(zhuǎn)化至10%L-阿拉伯糖誘導(dǎo)的GB05-dir感受態(tài)細(xì)胞中，復(fù)蘇1 h后涂布至帶有氯霉素抗性的LB平板，37℃過夜培養(yǎng)；從平板上挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后用XbaⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，將正確的重組克隆命名為p15A-cm-HNJZ-Fiber/FAdV-8b(圖1)。

圖1 表達(dá)FAdV-8b Fiber基因的FAdV-4感染性克隆構(gòu)建流程圖

1.5 重組病毒的拯救將p15A-cm-HNJZ-Fiber/FAdV-8b質(zhì)粒用PmeⅠ限制性內(nèi)切酶線性化，并進(jìn)行酚-氯仿抽提和乙醇沉淀；將LMH細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板內(nèi)，每孔細(xì)胞數(shù)量為2×106個(gè)，過夜培養(yǎng)至細(xì)胞豐度約為80%時(shí)，將5 μg線性化的p15A-cm-HNJZ-Fiber/FAdV-8b按Lipofectamine 3000試劑盒說明書轉(zhuǎn)染至LMH細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染后6 h棄去轉(zhuǎn)染液，加入含有2% FBS的DMEM/F12維持液，培養(yǎng)至細(xì)胞出現(xiàn)葡萄串樣病變，收獲病變的細(xì)胞，凍融3次，10 000 r/min離心1 min收取上清中的重組病毒，命名為rHNJZ-Fiber/ FAdV-8b。

1.6 重組病毒的鑒定

1.6.1重組病毒的PCR鑒定和遺傳穩(wěn)定性分析 用酚-氯仿抽提法提取病毒基因組DNA，以FAdV-4中國(guó)流行強(qiáng)毒株HNJZ 1 966 bp自然缺失區(qū)兩側(cè)的特異性引物1966-F(5′-TATTTACAGCACGGTCTAGAAGAACAAATA-3′)和1966-R(5′-GTGTCTGTTAATATTTTACGAAAGCTGTGT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和序列測(cè)定。

1.6.2重組病毒的Western blot分析 為檢驗(yàn)重組病毒rHNJZ-Fiber/FAdV8b中FAdV-8b Fiber蛋白的表達(dá)，將LMH細(xì)胞鋪至6孔細(xì)胞板中，使用第2，5，10代rHNJZ-Fiber/FAdV-8b分別感染LMH細(xì)胞，待細(xì)胞病變至80%時(shí)，使用預(yù)冷的細(xì)胞裂解液收取蛋白，同時(shí)設(shè)立HNJZ感染LMH細(xì)胞裂解液為陰性對(duì)照、LMH細(xì)胞裂解液為空白對(duì)照、pCI-neo-Fiber/FAdV8b轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞裂解液為陽性對(duì)照進(jìn)行SDS-PAGE，然后將蛋白電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，以小鼠抗HIS標(biāo)簽抗體為一抗，HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG抗體為二抗進(jìn)行Western blot，采用化學(xué)發(fā)光法顯色后拍攝圖像。

1.6.3重組病毒和親本毒在LMH細(xì)胞上的生長(zhǎng)特性比較 將LMH細(xì)胞鋪于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)量為2×106個(gè)，按MOI=0.001 接種FAdV-4流行株CH/HNJZ/2015和第10代重組病毒，分別于感染后12，24，36，48，60，72，84，96 h收獲病毒液，按照常規(guī)方法測(cè)定兩種病毒不同時(shí)間點(diǎn)的半數(shù)組織感染量(TCID50)，以收毒時(shí)間為橫坐標(biāo)，lg(TCID50/100 μL)為縱坐標(biāo)繪制病毒一步生長(zhǎng)曲線。

1.6.4重組病毒的間接免疫熒光鑒定 將LMH細(xì)胞鋪于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)量為2×106個(gè)，按MOI=0.01 接種FAdV-4流行株CH/HNJZ/2015和第2，5和10代重組病毒，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照和轉(zhuǎn)染pCI-neo-Fiber/FAdV-8b的陽性對(duì)照。待細(xì)胞病變至50%后棄去培養(yǎng)基，無菌PBS洗滌細(xì)胞2遍，加入預(yù)冷的無水乙醇于-20℃固定細(xì)胞30 min，加入1% TritonX-100透化15 min，PBST洗滌細(xì)胞3遍，加入1∶2 500稀釋的小鼠抗HIS標(biāo)簽抗體，置于37℃孵育1 h，PBST洗滌細(xì)胞3遍，加入1∶500稀釋的FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體，置于37℃孵育1 h，PBST洗滌細(xì)胞3遍，在熒光顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)FAdV-8b Fiber基因的重組FAdV-4拯救本研究利用前期建立的FAdV-4中國(guó)流行株反向遺傳技術(shù)平臺(tái)，采用基因無縫替換技術(shù)和大腸桿菌自殺基因/氯霉素抗性高效雙標(biāo)記篩選技術(shù)，將FAdV-8b Fiber基因克隆入FAdV-4中國(guó)流行株HNJZ基因組中1 966 bp自然缺失區(qū)，通過酶切鑒定和序列測(cè)定，結(jié)果顯示成功構(gòu)建感染性克隆p15A-cm-HNJZ-Fiber/FAdV-8b(圖2)。將線性化的重組質(zhì)粒p15A-cm-HNJZ-Fiber/FAdV-8b轉(zhuǎn)染至LMH細(xì)胞中進(jìn)行病毒拯救，于轉(zhuǎn)染后7 d細(xì)胞出現(xiàn)葡萄串狀的特征病變，成功拯救出重組病毒rHNJZ-Fiber/FAdV-8b(圖3)。

2.2 重組病毒rHNJZ-Fiber/FAdV-8b PCR檢測(cè)提取重組病毒rHNJZ-Fiber/FAdV-8b的基因組DNA，利用針對(duì)1 966 bp缺失區(qū)兩側(cè)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示PCR能夠擴(kuò)增出約為3 200 bp 的CMV-FAdV-8b-Fiber-PolyA表達(dá)盒條帶(圖4)。通過序列測(cè)定分析，結(jié)果顯示FAdV-8b Fiber基因被成功插入HNJZ基因組1 966 bp缺失區(qū)。

M.1 kb DNA Ladder Marker；A．重組質(zhì)粒酶切結(jié)果(泳道3～7為正確重組質(zhì)粒)；B.SnapGene預(yù)測(cè)重組質(zhì)粒XbaⅠ酶切圖譜

A．未轉(zhuǎn)染的LMH細(xì)胞對(duì)照；B.p15A-cm-HNJZ-Fiber/FAdV-8b轉(zhuǎn)染的LMH細(xì)胞

M.250 bp DNA Ladder Marker；1.重組病毒rHNJZ- Fiber/FAdV-8b PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2.FAdV-4親本株HNJZ的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3.LMH細(xì)胞基因組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3 重組病毒rHNJZ-Fiber/FAdV-8b的Western blot分析為了檢驗(yàn)重組病毒rHNJZ-Fiber/FAdV-8b的穩(wěn)定性和FAdV-8b Fiber蛋白的表達(dá)，將收獲的第2，5，10代rHNJZ- Fiber/FAdV-8b和親本株HNJZ感染的LMH細(xì)胞裂解液、未感染LMH細(xì)胞裂解液和pCI-neo-Fiber/FAdV8b轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞裂解液進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果顯示在第2，5，10代的rHNJZ-Fiber/FAdV-8b感染LMH細(xì)胞裂解液中均可以檢測(cè)到相對(duì)分子質(zhì)量約為60 kDa的蛋白條帶(圖5)，與預(yù)測(cè)的FAdV-8b Fiber蛋白相對(duì)分子質(zhì)量相符，證明重組病毒rHNJZ-Fiber/FAdV-8b可以正確并穩(wěn)定地表達(dá)FAdV-8b Fiber蛋白。

2.4 重組病毒在LMH細(xì)胞上復(fù)制動(dòng)態(tài)為確定表達(dá)FAdV-8b Fiber蛋白的重組病毒rHNJZ-Fiber/FAdV-8b在LMH細(xì)胞上的復(fù)制動(dòng)態(tài)，本研究將MOI=0.001的重組病毒和親本株HNJZ接種于LMH細(xì)胞上，分別于感染后12，24，36，48，60，72，84,96 h收取病毒，測(cè)定病毒滴度。結(jié)果顯示重組病毒rHNJZ-Fiber/FAdV-8b的病毒滴度達(dá)到105.6TCID50/100 μL，與其親本株HNJZ在LMH細(xì)胞上保持相似的高滴度生長(zhǎng)特性和復(fù)制動(dòng)態(tài)(圖6)。

2.5 重組病毒的遺傳穩(wěn)定性分析利用PCR和間接免疫熒光評(píng)價(jià)了重組病毒rHNJZ-Fiber/FAdV-8b的遺傳穩(wěn)定性，PCR和測(cè)序結(jié)果顯示，F(xiàn)AdV-8b的Fiber基因穩(wěn)定存在于重組病毒rHNJZ-Fiber/FAdV-8b基因組中；間接免疫熒光結(jié)果表明，不同代次的重組病毒均可以穩(wěn)定表達(dá)FAdV-8b的Fiber蛋白(圖7)。

M.蛋白Marker；1～3.第2，5,10代rHNJZ-Fiber/FAdV-8b感染的LMH細(xì)胞裂解液； 4.FAdV-4 親本株HNJZ感染的LMH細(xì)胞裂解液；5.未感染LMH細(xì)胞裂解液；6.pCI-neo-Fiber/FAdV-8b轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞裂解液

圖6 重組病毒rHNJZ-Fiber/FAdV-8b和HNJZ的復(fù)制動(dòng)態(tài)對(duì)比

3 討論

近年來，由FAdV-4新基因型引發(fā)的HHS和FAdV-8b引發(fā)的IBH在我國(guó)呈增多趨勢(shì)[6,15,20-25]，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。不同血清型FAdV混合感染的情況在養(yǎng)殖場(chǎng)普遍存在，而不同血清型FAdV之間是否能提供交叉保護(hù)的研究尚不多見。國(guó)外研究顯示，F(xiàn)AdV-8b和FAdV-11的二聯(lián)活疫苗和滅活疫苗能夠?qū)煞N血清型毒株導(dǎo)致的包涵體肝炎提供同等保護(hù)[26-27]。疫苗是有效防控疫病的重要手段之一，目前我國(guó)尚無正規(guī)的用于同時(shí)防控HHS和IBH的商品化疫苗，研制用于防控FAdV-4和FAdV-8b感染的多聯(lián)疫苗將有助于我國(guó)乃至世界養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。

1～3.第2，5,10代rHNJZ-Fiber/FAdV-8b感染的LMH細(xì)胞； 4.HNJZ感染的LMH細(xì)胞；5.LMH細(xì)胞對(duì)照；6.pCI-neo-Fiber/FAdV-8b轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞

本課題組與國(guó)內(nèi)其他團(tuán)隊(duì)的前期研究表明，引起我國(guó)HHS暴發(fā)的FAdV-4新基因型在基因組右端存在1 966 bp的自然缺失，在該缺失區(qū)插入外源基因不影響病毒的致病性和病毒復(fù)制，利用FAdV-4中國(guó)流行株制備的滅活疫苗能夠有效防控HHS[28-29]。前期研究證明FAdV-8b-Fiber亞單位疫苗能提供針對(duì)FAdV-8b的良好保護(hù)[15-16]?；谏鲜鲅芯炕A(chǔ)，本研究利用前期建立的基于FAdV-4新基因型的反向遺傳技術(shù)平臺(tái)在國(guó)內(nèi)外首次將FAdV-8b的Fiber基因插入到FAdV-4中國(guó)流行株的1 966-bp缺失區(qū)，構(gòu)建出能夠表達(dá)FAdV-8b Fiber蛋白的重組FAdV-4。研究結(jié)果顯示，重組病毒能夠高水平穩(wěn)定表達(dá)FAdV-8b的Fiber蛋白，重組病毒滴度可達(dá)到105.6TCID50/100 μL，病毒復(fù)制在72 h達(dá)到高峰，其復(fù)制動(dòng)態(tài)與親本株HNJZ保持一致，并且具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

目前國(guó)內(nèi)外研制的用于FAdV感染的疫苗主要包括全病毒弱毒活疫苗和滅活疫苗，以及基于Fiber蛋白的亞單位疫苗[16,30]。在制備多聯(lián)疫苗過程中需要培養(yǎng)多種病毒或表達(dá)多種蛋白，存在生產(chǎn)成本高、工藝繁瑣等缺陷。本研究成功構(gòu)建的表達(dá)FAdV-8b 流行株Fiber蛋白的重組FAdV-4，有望實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)一種病毒即可制備防控FAdV-4和FAdV-8b感染的二聯(lián)疫苗，在降低制苗成本、簡(jiǎn)化制苗工藝和實(shí)現(xiàn)“一苗多防”等方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。另外，本研究所采用的外源基因快速插入和重組體篩選技術(shù)為研制基于FAdV-4載體的新型基因工程多聯(lián)疫苗提供了技術(shù)平臺(tái)和新思路?？傊?，本研究成功構(gòu)建了表達(dá)FAdV-8b Fiber蛋白的重組FAdV-4，為基于FAdV-4載體的多聯(lián)疫苗研究奠定了基礎(chǔ)，有關(guān)重組病毒的免疫原性和免疫效力研究正在進(jìn)行中，本研究或能為同時(shí)防控HHS和IBH提供一種低廉和高效率的新途徑。