Ⅳ型禽腺病毒Fiber-2(knob)蛋白的表達(dá)及免疫效力評價(jià)

程慧敏，劉小曉，林 健，劉立新，趙際成，段會娟，王小蕾，范 維，劉月煥，錢 泓,張 強(qiáng)，楊志遠(yuǎn)* (.北京市農(nóng)林科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，北京00097；2.浙江海隆生物科技有限公司，浙江 紹興 32300；3.浙江理工大學(xué)，浙江 杭州3008)

禽腺病毒(fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)Ⅰ群屬于腺病毒科，禽腺病毒屬，共有12個(gè)血清型。這12個(gè)血清型均可引起包涵體肝炎(inclusion body hepatitis，IBH)，一般情況下不表現(xiàn)出臨床癥狀，但在一定條件下會繼發(fā)感染，可引起雞群的發(fā)病和死亡。其中Ⅳ型禽腺病毒(FAdV-4)本身可致病，引起心包積水綜合征(hydropericardiura syn-drome，HS)和心包積水-肝炎綜合征(hydropericardium hepatitis syndrome,HHS)[1-2]，F(xiàn)AdV-4是我國目前的優(yōu)勢流行血清型[3]。在2014年以前，F(xiàn)AdV臨床表現(xiàn)以IBH為主，死亡率較低，2014年江蘇省暴發(fā)FAdV-4，隨后FAdV在我國大面積流行[4-5]，造成雞群產(chǎn)蛋下降，死亡率20%～80%，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

Ⅰ群FAdV為二十面體對稱，包括240個(gè)六鄰體和12個(gè)五鄰體。五鄰體由2種蛋白構(gòu)成，一個(gè)錨定在衣殼上的五鄰體基體蛋白(penton)，一個(gè)伸向外側(cè)的纖細(xì)的纖突蛋白(Fiber)。其中短纖突蛋白(Fiber-2)可能與受體結(jié)合相關(guān)。纖突蛋白球形(knob)為功能區(qū)可與宿主細(xì)胞受體結(jié)合，纖維蛋白具有型和亞群特異性抗原決定簇，能誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性抗體。本研究選?、袢篎AdV-4短纖突蛋白球形區(qū)截短體蛋白，使用大腸桿菌進(jìn)行可溶性蛋白表達(dá)，將蛋白抗原與油佐劑按比例混合制備疫苗免疫接種雞，利用膠體金試紙條檢測血清抗體并進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，觀察Ⅰ群FAdV-4 Fiber-2(knob)亞單位疫苗免疫保護(hù)效果。

1 材料與方法

1.1 病毒和菌種病毒雞胚肝組織毒(FAdV-BP-ELF2 105.5ELD50/0.1 mL、FAdV-BP-ELF3 105.9ELD50/0.1 mL)，由北京農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離保存；大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)、大腸桿菌(E.coli)JM109，由浙江海隆生物科技有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物70只14～21日齡SPF雞，購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。

1.3 載體及試劑Q5?超保真 2×Master Mix、NEBuilder?高保真 DNA 組裝預(yù)混液、限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；膠回收試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；T4DNA酶連接Kit購自寶生物工程(大連)有限公司；Plasmid Mini KitⅠ購自O(shè)MEGA公司；原核表達(dá)載體pET28a(+)購自Novogen；Marcol 52白油佐劑購自埃索公司；吐溫-80、司本-80、硬脂酸鋁，由天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司提供；FAdV-4檢測試紙條及配套讀數(shù)儀購自標(biāo)馳澤惠生物有限公司。

1.4 目的片段的擴(kuò)增根據(jù)FAdV-4 BP毒株短纖突蛋白(Fiber-2)的knob核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，上游引物序列為FP5′-CAGCCATGGGCATTGCG-ACCTTCGTTAGC-3′，下游引物序列為5′- GTGCTCGAGTTAGTGGTGGTG-3′(引入NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn))。提取病毒核酸擴(kuò)增目的片段，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度為591 bp。反應(yīng)條件為98℃預(yù)變性30 s；98℃變性10 s，68℃退火10 s，72℃延伸50 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。通過1%瓊脂糖凝膠反應(yīng)確定產(chǎn)物大小，大小正確后切膠回收目的片段。

1.5 pET28a-Fiber-2(knob)重組質(zhì)粒的構(gòu)建將回收的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳確定大小正確后回收片段，酶切后將目的片段連接到pET28a原核表達(dá)載體，得到重組表達(dá)載體 pET28a-Fiber-2(knob)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞中，提取JM109質(zhì)粒后進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定，酶切位點(diǎn)為EcoRⅠ和EcoRⅤ。選擇插入片段正確的克隆送測序公司測序。

1.6 Fiber-2(knob)蛋白表達(dá)與純化通過熱激法將pET28a(+)-Fiber-2(knob)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，將BL21(DE3)接種于無抗性LB培養(yǎng)液中37℃ 220 r/min搖菌1 h，挑取菌懸液于卡那抗性LB平板(50 mg/L)上劃線，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆至卡那抗性LB培養(yǎng)基中，37℃ 220 r/min 搖菌5～6 h，當(dāng)D600值達(dá)到0.5～0.8時(shí)取菌液，12 000 r/min離心5 min進(jìn)行SDS-PAGE。剩余菌液置于冰水浴10 min，加入2 μL 1 mol/L IPTG(終濃度0.2 mmol/L)，20℃搖菌誘導(dǎo)9 h后測D600值， 12 000 r/min離心5 min收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE檢測。向構(gòu)建的工程菌體中加入裂解液裂解菌體，12 000 r/min，4℃離心30 min去除菌體碎片，取上清經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾后進(jìn)行鎳柱純化。將上清與鎳柱填料混合后收集流穿液，按照操作說明分別去除內(nèi)毒素、Triton X-114等，純化后的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析純度及質(zhì)量濃度。

1.7 FAdV Fiber-2亞單位疫苗的配制為了驗(yàn)證Fiber-2(knob)蛋白的免疫原性，制備不同F(xiàn)iber-2(knob)蛋白含量的亞單位疫苗，F(xiàn)iber-2(knob)蛋白含量分別為100，50，25，0 mg/0.5 L(Marcol-52佐劑對照)，對疫苗效力進(jìn)行初步探討。用PBS對蛋白進(jìn)行稀釋，按照質(zhì)量比為4%的比例在稀釋蛋白中加入滅菌吐溫-80，升溫至33℃攪拌，吐溫完全溶解后作為水相抗原。分別按照2%和6%的比例，在Marcol-52白油中加入硬脂酸鋁和司本-80，將司本-80、硬脂酸鋁和Marcol-52白油佐劑混合，在260℃條件下攪拌，混合均勻制成油相。按照抗原和油佐劑體積比為1∶3的比例進(jìn)行乳化，設(shè)置Marcol-52佐劑對照。按照上述步驟，另制備4批Fiber-2(knob)亞單位疫苗，F(xiàn)iber-2(knob)含量為24 mg/0.5 L，進(jìn)一步對不同批次該疫苗進(jìn)行臨床效力檢驗(yàn)。

1.8 攻毒保護(hù)試驗(yàn)將20只SPF雞分為A、B、C、D共4組，每組5只雞，各組分別經(jīng)腿部肌肉注射免疫Fiber-2蛋白含量為100，50，25，0 mg/0.5 L的亞單位疫苗。免疫后24 d后攻毒，將病毒液(FAdV-BP-ELF2,105.5ELD50/0.1 mL)用無菌PBS進(jìn)行50倍稀釋后，經(jīng)胸部肌肉注射感染動物，0.5 mL/只，(即攻毒劑量為104.5ELD50)每組試驗(yàn)SPF雞隔離飼養(yǎng)，每日觀察雞的精神、采食、發(fā)病和死亡情況。比較不同免疫劑量攻毒保護(hù)效果。將50只SPF雞分為201801，201802，201803，201804和對照組共5組，每組各10只。經(jīng)胸部肌肉注射進(jìn)行2點(diǎn)免疫，0.15 mL/點(diǎn)，0.3 mL/只(Fiber-2蛋白含量14.4 μg/只)。免疫后28 d采集全血分離血清，利用膠體金試紙條測定血清抗體水平。上樣70 μL后等待10～15 min，通過配套儀器讀取灰度值，測定抗體水平。免疫后28 d攻毒，將病毒液(FAdV-BP-ELF3、105.9ELD50/0.1 mL)用無菌PBS進(jìn)行100倍稀釋后，經(jīng)胸部肌肉注射感染動物，0.5 mL/只(攻毒劑量為5×103.9ELD50)，所有試驗(yàn)SPF雞隔離飼養(yǎng)，每日觀察雞的精神、采食、發(fā)病和死亡情況。比較不同疫苗批次攻毒保護(hù)效果。發(fā)病標(biāo)準(zhǔn):攻毒后觀察14 d，臨床表現(xiàn)為采食量明顯下降、精神萎靡、羽毛蓬松、排綠色稀便，剖檢見明顯肝部病變，肝臟腫大、色澤變黃，心包積液、胸腺有出血點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 pET28a-Fiber-2(knob)重組質(zhì)粒的構(gòu)建對pET28a-Fiber-2(knob)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證， EcoRⅠ/EcoRⅤ雙酶切后可見大小約4 191 ，660 bp 條帶，與預(yù)期大小一致，質(zhì)粒酶切正確，核酸測序結(jié)果與GenBank發(fā)布的Fiber-2 knob基因序列同源性為100%，成功構(gòu)建pET28a-Fiber-2(knob)重組質(zhì)粒(圖1)。

M.DL10000 DNA Marker;1,2.pET28a-Fiber-2(knob)質(zhì)粒EcoRⅠ/EcoRⅤ雙酶切

2.2 Fiber-2(knob)蛋白表達(dá)與純化結(jié)果SDS-PAGE結(jié)果表明，未誘導(dǎo)表達(dá)前上清中Fiber-2(knob)僅有少量表達(dá)，胞內(nèi)未見表達(dá)，小量誘導(dǎo)表達(dá)后上清中可見大量可溶性表達(dá)(圖2)。純化后的目的蛋白雜帶很少，凝膠薄層掃描蛋白純度可達(dá)90%，質(zhì)量濃度可達(dá)3 269 mg/L(圖3)。

M.蛋白Marker；1.誘導(dǎo)前上清；2.誘導(dǎo)前沉淀；3.誘導(dǎo)后上清；4.誘導(dǎo)后沉淀

M.蛋白Marker；1.Fiber-2(knob)目的蛋白

2.3 不同免疫劑量攻毒保護(hù)試驗(yàn)攻毒后2 d，對照組全部發(fā)病，且死亡1只，剖檢可見典型腺病毒感染病變，心包積液、肝臟腫大、胸腺有出血點(diǎn)。攻毒后3 d ，對照組全部死亡，免疫組未見明顯異常。攻毒后7 d健活率為100%，撲殺后剖檢觀察臟器組織，均未見明顯異常(表1)。

表1 不同劑量Fiber-2(knob)蛋白亞單位疫苗免疫效力

2.4 不同疫苗批次攻毒保護(hù)試驗(yàn)利用膠體金免疫層析方法測定4個(gè)免疫組血清FAdV抗體水平，免疫組灰度平均值為(551.37±111.89)，對照組平均值為(21.97±4.77)，其中201801，201802，201803，201804組灰度平均值分別為(571.22±116.14)，(532.46±129.86)，(549.29±70.42)，(552.53±112.91)，結(jié)果表明不同批次疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體水平一致性較好(圖4)。免疫組觀察至攻毒后14 d，觀察期內(nèi)未見明顯異常，且4個(gè)免疫組攻毒保護(hù)率均為100%。對照組攻毒后2 d未見顯著異常，攻毒后3 d 死亡2只雞， 4 d死亡5只，5 d 死亡1只，觀察至攻毒后14 d死亡率為80%(8/10)，發(fā)病率為90%(9/10)。

圖4 不同批次Fiber-2(knob)蛋白亞單位疫苗抗體水平

3 討論

FAdV-4自2014年暴發(fā)后，在我國快速傳播蔓延，發(fā)病呈逐年上升趨勢，死淘率可以高達(dá)80%，給我國的養(yǎng)雞業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。該病傳播和發(fā)病迅速，精準(zhǔn)免疫是一種阻止該病傳播蔓延的有效手段。相較于傳統(tǒng)滅活疫苗或減毒疫苗，亞單位疫苗具有更好的安全性，使用FAdV-4接種雞胚或原代雞腎臟細(xì)胞來制備疫苗，可降低生產(chǎn)成本，解決滅活疫苗存在滅活不徹底的隱患。但由于是選取病毒的部分蛋白區(qū)域進(jìn)行表達(dá)，因此表達(dá)蛋白的免疫原性是疫苗研制的關(guān)鍵。研究表明，Ⅰ群FAdV-4短纖突蛋白與病毒的毒力密切相關(guān)[6-7]，具有較好的抗原活性[8-9]，誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答反應(yīng)比油乳佐劑疫苗更加強(qiáng)烈[10]。

本研究選取Fiber-2蛋白球形區(qū)(knob)截短體蛋白從氨基酸283位到479位的抗原決定簇進(jìn)行Fiber-2(knob)蛋白表達(dá)。將Ⅰ群FAdV-4短纖突蛋白球形區(qū)截短體蛋白核苷酸序列克隆到載體中，再將重組載體轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)表達(dá)、純化后得到抗原蛋白，最后將抗原蛋白與佐劑乳化后得到疫苗。結(jié)果表明，F(xiàn)AdV Fiber-2(knob)亞單位疫苗免疫SPF雞后均取得很好效果，最小免疫劑量為14.4 μg Fiber-2蛋白時(shí)，攻毒保護(hù)率也可以達(dá)到100%，不同批次制備的Fiber-2亞單位疫苗均刺激機(jī)體產(chǎn)生較高水平抗體，批次間差異較小。