納米雄黃對MCF-7乳腺癌干細(xì)胞的體外抑制作用

鄔俊 王貴 陳毅 王唯婷 姜爽 王曉波

中圖分類號 R285.5;R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）04-0473-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.04.15

摘 要 目的 研究納米雄黃對乳腺癌干細(xì)胞的體外抑制作用。方法 以人乳腺癌MCF-7親本細(xì)胞為對象，采用無血清培養(yǎng)法培養(yǎng)獲得乳腺癌干細(xì)胞。以阿霉素（1 mg/L）為陽性對照，以相同質(zhì)量濃度的水飛雄黃為參照，采用CCK-8法檢測納米雄黃對MCF-7親本細(xì)胞及干細(xì)胞增殖的影響;借助懸浮球形成及分化實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀檢測納米雄黃對乳腺癌干細(xì)胞懸浮球形成及分化能力、遷移及侵襲能力、CD44+/CD24-細(xì)胞亞群比例的影響;采用Western blot法檢測乳腺癌干細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化通路相關(guān)蛋白（上皮鈣黏著蛋白、波形蛋白）的表達(dá)水平。結(jié)果 水飛雄黃、納米雄黃1、5、10、40、60、80 mg/L組MCF-7親本細(xì)胞及其干細(xì)胞（兩者1 mg/mL組乳腺癌干細(xì)胞除外）的存活率均顯著低于空白對照組（P<0.01）;水飛雄黃、納米雄黃1、2.5、5、10 mg/L組的多細(xì)胞懸浮球（>20個細(xì)胞）數(shù)量均顯著少于空白對照組（P<0.01），且懸浮球體積有所縮小，分化的貼壁細(xì)胞有所減少，其劃痕愈合率、相對侵襲率（水飛雄黃1 mg/L組除外）、CD44+/CD24-細(xì)胞亞群比例均顯著低于空白對照組（P<0.01）;水飛雄黃、納米雄黃2.5、10 mg/L組細(xì)胞中上皮鈣黏著蛋白的表達(dá)水平均顯著高于空白對照組，波形蛋白的表達(dá)水平均顯著低于空白對照組（P<0.01）。納米雄黃的上述作用普遍優(yōu)于相同質(zhì)量濃度的水飛雄黃（P<0.01）。結(jié)論 與相同質(zhì)量濃度的水飛雄黃比較，納米雄黃可更明顯地抑制乳腺癌干細(xì)胞的增殖、懸浮球的形成及分化能力，并可降低CD44+/CD24-細(xì)胞亞群比例。這種作用可能與納米雄黃通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化通路相關(guān)蛋白的表達(dá)而抑制乳腺癌干細(xì)胞的遷移和侵襲有關(guān)。

關(guān)鍵詞 雄黃;納米雄黃;水飛雄黃;乳腺癌干細(xì)胞;人乳腺癌MCF-7親本細(xì)胞;侵襲;轉(zhuǎn)移

In vitro inhibitory effects of realgar nanoparticles on MCF-7 breast cancer stem cells

WU Jun1，2，WANG Gui2，CHEN Yi2，WANG Weiting2，JIANG Shuang1，WANG Xiaobo1（1. Dept.of Pharmacy，No. 967 Hospital of Joint Logistics Support Force of the Chinese People’s Liberation Army， Liaoning Dalian 116021， China; 2. School of Pharmacy， Dalian Medical University， Liaoning Dalian 116044， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To study in vitro inhibitory effects of realgar nanoparticles on breast cancer stem cells. METHODS Human breast cancer MCF-7 parent cells were selected as subjects and cultured by serum-free culture to obtain breast cancer stem cells. Using adriamycin （1 mg/L） as positive control， same concentration of water-processed realgar as reference， the effects of realgar nanoparticles on the proliferation of MCF-7 parent cells and stem cells were detected by CCK-8 method. The effects of realgar nanoparticles on the formation of mammosphere， the ability of differentiation， migration and invasion， the proportion of CD44+/CD24- subgroup in breast cancer stem cells were detected by mammosphere formation and differentiation experiment， scratch experiment， Transwell invasion experiment and flow cytometry. Western blot assay was used to detect the expression of proteins related to epithelial mesenchymal transformation pathway （E-cadherin and vimentin） in breast cancer stem cells. RESULTS The survival rates of MCF-7 parent cells and stem cells （except for breast cancer stem cells in both 1 mg/mL groups） in 1， 5， 10， 40， 60， 80 mg/L groups of water-processed realgar and realgar nanoparticles were significantly lower than blank control group （P<0.01）. The number of mammosphere （>20 stem cells） in 1， 2.5， 5， 10 mg/L groups of water-processed realgar and realgar nanoparticles was significantly lower than blank control group （P<0.01）;the volume of mammosphere decreased and the differentiated adherent cells decreased; the healing rate of wound， relative invasion rate （except for water-processed realgar 1 mg/L group） and the proportion of CD44+/CD24- subgroup were significantly lower than blank control group （P<0.01）. The expressions of E-cadherin in 2.5， 10 mg/L groups of water-processed realgar and realgar nanoparticles was significantly higher than blank control group， and the expressions of vimentin was significantly lower than those in blank control group （P<0.01）. The above effects of realgar nanoparticles were generally better than those of water-processed realgar with the same mass concentration （P<0.01）. CONCLUSIONS Compared with water-processed realgar with the same mass concentration， realgar nanoparticles can significantly inhibit the proliferation of breast cancer stem cells， the formulation and differential ability of mammo-? ? ? sphere， and reduce the proportion of CD44+/CD24- subgroup. The effect may be associated with the inhibition of migration and invasion of breast cancer stem cells by inhibiting the expression of proteins related to epithelial mesenchymal transformation pathway.

KEYWORDS? ?realgar; realgar nanoparticles; water-processed realgar; breast cancerstem cell; human breast cancer MCF-7 parent cell; invasion; metastasis

2003年，Al-hajj等[1]從乳腺腫塊中分離出少量抗原表型為CD44+/CD24-的乳腺癌干細(xì)胞，首次證實(shí)乳腺癌組織中也存在干細(xì)胞。隨后的研究表明，乳腺癌干細(xì)胞具有對化療、放療及缺氧環(huán)境的抵抗性和高致瘤性、高侵襲轉(zhuǎn)移性等特征，在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[2-3]。如何在乳腺癌的治療中根除干細(xì)胞，進(jìn)而防止其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是學(xué)界目前亟待解決的科學(xué)問題[4-5]。

雄黃，其主要成分為二硫化二砷。研究表明，雄黃在造血系統(tǒng)腫瘤特別是急性早幼粒細(xì)胞白血病中具有巨大的治療潛力[6-7]。筆者所在醫(yī)院研制的復(fù)方黃黛片（由青黛、雄黃、太子參及丹參組方而成）用于治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的緩解率高、不良反應(yīng)少且無骨髓抑制性，在臨床上應(yīng)用廣泛[8-9]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，將水飛雄黃納米化（以下簡稱“納米雄黃”）是提高雄黃溶解度和生物利用度的有效途徑，也是增強(qiáng)其對肺癌、肝癌、乳腺癌等多種實(shí)體瘤細(xì)胞抑制活性的重要手段[10-11]。目前，納米雄黃對白血病干細(xì)胞、肺癌干細(xì)胞的增殖抑制、誘導(dǎo)分化作用已有報(bào)道[12-13]，但其對乳腺癌干細(xì)胞是否有抑制作用尚不清楚。因此，本研究在分析納米雄黃抑制人乳腺癌MCF-7親本細(xì)胞的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索其對無血清培養(yǎng)乳腺癌干細(xì)胞增殖、懸浮球形成及分化能力、遷移及侵襲能力、CD44+/CD24-細(xì)胞亞群比例、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化通路相關(guān)蛋白表達(dá)等的影響，以探討其可能的作用機(jī)制，為乳腺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及有效治療提供新的理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括：BNP-150CDF1型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（蘇州貝因醫(yī)療器械有限公司），IX73型倒置顯微鏡（日本Olympus公司），Anthos 2010型全自動酶標(biāo)儀（英國Biochrom公司），C6型流式細(xì)胞儀（美國BD公司），PAC300型電泳儀（美國Bio-Rad公司），TS 2000A型脫色搖床（海門市分析儀器廠），Amersham Imager 600型凝膠成像系統(tǒng)（美國General Electric公司），TGL-16M型高速臺式冰凍離心機(jī)（湘潭湘儀儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

藥用雄黃（批號140408，主要成分為二硫化二砷，約200目，粒徑小于76 μm，純度98%，產(chǎn)自湖南常德）購自長沙醫(yī)藥公司，經(jīng)解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第967醫(yī)院藥劑科主任藥師王曉波鑒定為真品;阿霉素對照品（批號2468183，純度99%）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司;RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM-F12培養(yǎng)基、胎牛血清、B27添加劑、BCA試劑盒均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;人堿性成纖維細(xì)胞生長因子、人表皮生長因子購自蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司;人工基底膜（matrigel）、脫脂奶粉均購自美國BD公司;青霉素和鏈霉素、結(jié)晶紫、吐溫20（Tween 20）乳化劑、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS，pH7.4）、磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate buffer saline with Tween 20，PBST）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠和濃縮膠緩沖液均購自北京索萊寶科技有限公司;異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的人抗小鼠CD44單克隆抗體、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標(biāo)記的人抗小鼠CD24單克隆抗體均購自Biolegend（北京）生物科技有限公司;兔源上皮鈣黏著蛋白單克隆抗體、兔源波形蛋白單克隆抗體和兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體均購自美國Cell Signaling公司;聚偏氟乙烯膜購自美國Bio-Rad公司;CCK-8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗及ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒均購自合肥志宏生物技術(shù)有限公司;其余試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 細(xì)胞

人乳腺癌MCF-7親本細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

2 方法

2.1 納米雄黃、水飛雄黃及其混懸液的制備

參考文獻(xiàn)[10]，制備納米雄黃和水飛雄黃，并按如下方法制備混懸液：稱取已滅菌的納米雄黃和水飛雄黃5 mg于離心管中，加入已滅菌的PBS 5 mL，超聲振蕩30 min使混勻，配制成質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L的混懸液;取上述混懸液，用PBS分別稀釋至不同質(zhì)量濃度（800、600、400、100、50、25、10 mg/L，以二硫化二砷計(jì)，下同）[9]，于4 ℃下保存，備用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及觀察

MCF-7親本細(xì)胞血清培養(yǎng)：采用血清培養(yǎng)法，將MCF-7親本細(xì)胞按密度1×105 mL-1接種于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基（以下簡稱“SSM”）中，置于37 ℃、5%CO2、100%相對濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同），使用倒置顯微鏡觀察其形態(tài)，每3天傳代1次，取對數(shù)生長期的MCF-7親本細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。MCF-7親本細(xì)胞無血清培養(yǎng)：采用無血清培養(yǎng)法，將上述對數(shù)生長期的MCF-7親本細(xì)胞按密度5×104 mL-1接種于含20 ng/mL人堿性成纖維細(xì)胞生長因子、20 ng/mL人表皮生長因子、2%B27、1%青鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基（以下簡稱“SFM”）中，置于37 ℃、5%CO2、100%相對濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同），使用倒置顯微鏡觀察其形態(tài)，每3天進(jìn)行半量換液，待細(xì)胞增殖成致密的懸浮球時，機(jī)械吹打制成單細(xì)胞懸液，每7天傳代1次，取第5代對數(shù)生長期的懸浮球細(xì)胞作為乳腺癌干細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 細(xì)胞增殖檢測

采用CCK-8法進(jìn)行檢測。取“2.2”項(xiàng)下對數(shù)生長期的MCF-7親本細(xì)胞及干細(xì)胞，分別用SSM和SFM重懸并制成密度均為5×104 mL-1的單細(xì)胞懸液，按每孔90 μL接種于96孔板中，培養(yǎng)12 h后，將細(xì)胞分為空白對照組和納米雄黃、水飛雄黃不同質(zhì)量濃度組（均為1、5、10、40、60、80 mg/L）、阿霉素1 mg/L組（陽性對照），給藥濃度參考文獻(xiàn)[10]及前期預(yù)實(shí)驗(yàn);同時，設(shè)置含相應(yīng)質(zhì)量濃度藥液和相應(yīng)培養(yǎng)基、不含細(xì)胞的藥物空白組以及不含藥物和細(xì)胞的空白培養(yǎng)基組，每組設(shè)置3個復(fù)孔。空白對照組加入PBS 10 μL，各給藥組加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的藥液10 μL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK-8試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測各孔的光密度（optical density，OD）值并計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=[給藥組OD450 nm-藥物空白組OD450 nm]/[空白對照組OD450 nm-空白培養(yǎng)基組OD450 nm]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 細(xì)胞懸浮球形成及分化能力檢測

采用懸浮球形成及分化實(shí)驗(yàn)。取“2.2”項(xiàng)下第5代對數(shù)生長期的乳腺癌干細(xì)胞，用SFM重懸并制成密度為1×104 mL-1的單細(xì)胞懸液，按每孔1 800 μL接種于6孔板中，培養(yǎng)12 h后，將細(xì)胞分為空白對照組、阿霉素1 mg/L組（陽性對照）和納米雄黃、水飛雄黃不同質(zhì)量濃度組（均為1、2.5、5、10 mg/L，給藥濃度參考“2.3”項(xiàng)下結(jié)果并排除高質(zhì)量濃度致細(xì)胞毒性的影響），每組設(shè)置3個復(fù)孔。空白對照組加入PBS 200 μL，各給藥組加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的藥液200 μL。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，于倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形成懸浮球的體積并統(tǒng)計(jì)多細(xì)胞懸浮球（>20個細(xì)胞）的數(shù)量。收集各組懸浮球細(xì)胞，以3 000 r/min離心5 min，用SSM重懸并制成密度為1×104 mL-1的單細(xì)胞懸液，按每孔1 000 μL接種于6孔板中，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。3 d后，收集貼壁細(xì)胞，用SFM重懸并制成密度為1×104 mL-1的單細(xì)胞懸液，按每孔1 000 μL接種于6孔板中，對各組細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察并拍照，以考察干細(xì)胞的分化能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 細(xì)胞遷移能力檢測

采用劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測。取“2.2”項(xiàng)下第5代對數(shù)生長期的乳腺癌干細(xì)胞，用SFM重懸并制成密度為2×105 mL-1的單細(xì)胞懸液，按每孔1 000 μL接種于背面劃有2條橫線的24孔板中，待細(xì)胞鋪滿孔底后，用10 μL的槍頭在24孔板底垂直于橫線劃痕，PBS清洗后，將細(xì)胞分為空白對照組、阿霉素1 mg/L組（陽性對照）和納米雄黃、水飛雄黃不同質(zhì)量濃度組（均為1、2.5、5、10 mg/L，濃度設(shè)置依據(jù)同“2.4”項(xiàng)），每組設(shè)置3個復(fù)孔。各組均加入無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基900 μL，隨后空白對照組加入PBS 100 μL，各給藥組加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的藥液 100 μL，混勻。分別培養(yǎng)0、24 h后，于倒置顯微鏡下觀察劃痕愈合情況并拍照，計(jì)算劃痕愈合率：劃痕愈合率（%）=（1-劃痕寬度24 h/劃痕寬度0 h）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 細(xì)胞侵襲能力檢測

采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測。將matrigel與預(yù)冷的DMEM-F12培養(yǎng)基（兩者體積比1 ∶ 8）混勻后，取50 μL均勻包被Transwell小室上膜，放入培養(yǎng)箱中孵育4 h。取“2.2”項(xiàng)下第5代對數(shù)生長期的乳腺癌干細(xì)胞，用SFM重懸，以3 000 r/min離心5 min，用PBS清洗2次，隨后將細(xì)胞用無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸并制成密度為1×106 mL-1的單細(xì)胞懸液，按每孔90 μL加入小室內(nèi)，小室外加入SSM 700 μL。培養(yǎng)4 h后，將細(xì)胞分為空白對照組、阿霉素1 mg/L組（陽性對照）和納米雄黃、水飛雄黃不同質(zhì)量濃度組（均為1、2.5、5、10 mg/L，濃度設(shè)置依據(jù)同“2.4”項(xiàng)），每組設(shè)置3個復(fù)孔?？瞻讓φ战M加入PBS 10 μL，各給藥組加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的藥液10 μL。培養(yǎng)24 h后，取出小室，棄上層液體，用3.7%甲醛溶液固定5 min，PBS清洗;用甲醇固定20 min，PBS清洗;最后用0.1%結(jié)晶紫乙醇溶液染色15 min，PBS清洗，用棉棒輕輕擦去小室內(nèi)未穿過小室膜的細(xì)胞，晾干，于倒置顯微鏡下觀察小室膜外層細(xì)胞并拍照，隨后將小室放入含33%乙酸溶液400 μL的24孔板中，使細(xì)胞中的結(jié)晶紫全部溶解于乙酸中。將含有結(jié)晶紫的乙酸溶液移入96孔板中，用酶標(biāo)儀在570 nm波長處檢測各孔的OD值并計(jì)算相對侵襲率：相對侵襲率（%）=（給藥組OD570 nm/空白對照組OD570 nm）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 細(xì)胞中 CD44+/CD24-細(xì)胞亞群比例檢測

采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。取“2.2”項(xiàng)下第5代對數(shù)生長期的乳腺癌干細(xì)胞，用SFM重懸并制成密度為6×105 mL-1的單細(xì)胞懸液，按每孔1 800 μL接種于6孔板中。培養(yǎng)12 h后，將細(xì)胞分為空白對照組、阿霉素1 mg/L組（陽性對照）和納米雄黃、水飛雄黃不同質(zhì)量濃度組（均為1、2.5、5、10 mg/L，劑量設(shè)置依據(jù)同“2.4”項(xiàng)），每組設(shè)置3個復(fù)孔?？瞻讓φ战M加入PBS 200 μL，各給藥組加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的藥液200 μL。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集各組乳腺癌干細(xì)胞，用PBS 1 mL清洗1次，并用PBS 100 μL重懸，加入FITC標(biāo)記的CD44單克隆抗體5 μL、PE標(biāo)記的CD24單克隆抗體5 μL，混勻，4 ℃避光孵育30 min，用PBS清洗3次，再用PBS 200 μL重懸，并于1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測各組CD44+/CD24-細(xì)胞亞群比例。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測

采用Western blot法進(jìn)行檢測。取“2.2”項(xiàng)下第5代對數(shù)生長期的乳腺癌干細(xì)胞，用SFM重懸并制成密度為3×105 mL-1的單細(xì)胞懸液，按每孔1 800 μL接種于6孔板中。培養(yǎng)12 h后，將細(xì)胞分為空白對照組和納米雄黃、水飛雄黃不同質(zhì)量濃度組（均為2.5、10 mg/L，濃度設(shè)置參考前期Western blot預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果），每組設(shè)置3個復(fù)孔。空白對照組加入PBS 200 μL，各給藥組加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的藥液200 μL。培養(yǎng)24 h后，收集并裂解細(xì)胞，提取總蛋白。采用BCA法檢測蛋白濃度，加入上樣緩沖液并煮沸使蛋白變性。根據(jù)蛋白濃度，計(jì)算電泳上樣量。使用5%的濃縮膠和10%的分離膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上。用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入上皮鈣黏著蛋白、波形蛋白、GAPDH一抗（稀釋比例均為1 ∶ 1 000）中，4 ℃孵育過夜;用PBST洗膜3次，每次10 min，隨后加入相應(yīng)二抗（稀釋比例為1 ∶ 3 000），孵育2 h;再用PBST洗膜3次，每次10 min，最后加入ECL化學(xué)發(fā)光液反應(yīng)5 min，使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影。采用Image J 1.8.0軟件，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Graphpad Prism 8.0軟件作圖。計(jì)量資料滿足正態(tài)分布以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞形態(tài)及生長方式觀察結(jié)果

當(dāng)使用SSM培養(yǎng)，MCF-7親本細(xì)胞呈類似多邊形單層貼壁生長。而使用SFM培養(yǎng)，部分MCF-7親本細(xì)胞可于培養(yǎng)1～3 d后形成若干體積、形態(tài)不等的細(xì)胞懸浮球，且培養(yǎng)液呈懸浮狀態(tài)，細(xì)胞間連接較松散;培養(yǎng)5～7 d后懸浮球體積逐漸增大，數(shù)量增多，球內(nèi)細(xì)胞結(jié)合緊密，折光性強(qiáng)。當(dāng)7 d后進(jìn)行傳代，細(xì)胞可繼續(xù)呈懸浮球狀生長，表明在連續(xù)的無血清培養(yǎng)條件下，部分MCF-7親本細(xì)胞仍能存活并增殖形成具有自我更新能力的腫瘤干細(xì)胞懸浮球。結(jié)果見圖1。

3.2 納米雄黃對MCF-7親本細(xì)胞及其干細(xì)胞增殖的影響

與空白對照組比較，水飛雄黃、納米雄黃各給藥組MCF-7親本細(xì)胞及其干細(xì)胞（兩者1 mg/L組乳腺癌干細(xì)胞除外）的存活率均顯著降低（P<0.01），且有隨藥物質(zhì)量濃度增加而降低的趨勢;與相同質(zhì)量濃度的水飛雄黃組比較，納米雄黃5～80 mg/L組MCF-7親本細(xì)胞及其干細(xì)胞的存活率更低（P<0.01）。結(jié)果見表1。

3.3 納米雄黃對乳腺癌干細(xì)胞懸浮球形成及分化能力的影響

與空白對照組比較，水飛雄黃、納米雄黃各給藥組形成的多細(xì)胞懸浮球數(shù)量均顯著減少（P<0.01），且懸浮球體積縮小;與相同質(zhì)量濃度的水飛雄黃組比較，納米雄黃組對細(xì)胞懸浮球形成能力的抑制作用更強(qiáng)（P<0.01）。結(jié)果見表2、圖2。

a：與空白對照組比較，P<0.01;b：與相同質(zhì)量濃度的水飛雄黃組比較，P<0.01

對各組懸浮球細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，培養(yǎng)24 h后，可見細(xì)胞開始貼壁，形態(tài)呈類似多邊形，與SSM條件下培養(yǎng)的MCF-7親本細(xì)胞（圖1A）形態(tài)無明顯差異;與空白對照組比較，各給藥組貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯減少;與相同質(zhì)量濃度的水飛雄黃組比較，納米雄黃組貼壁細(xì)胞更少（圖3）。收集各組分化的貼壁細(xì)胞，重懸于SFM中，48 h后細(xì)胞可繼續(xù)呈懸浮球狀生長，但經(jīng)過高濃度藥物處理后所形成的懸浮球體積明顯小于空白對照組（圖4）。

3.4 納米雄黃對乳腺癌干細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

與空白對照組比較，水飛雄黃、納米雄黃各給藥組乳腺癌干細(xì)胞的劃痕愈合率均顯著降低（P<0.01），且有隨藥物質(zhì)量濃度增加而降低的趨勢;與相同質(zhì)量濃度的水飛雄黃組比較，納米雄黃組乳腺癌干細(xì)胞的劃痕愈合率（納米雄黃10 mg/L組除外）更低（P<0.01）。結(jié)果見表3、圖5。

a：與空白對照組比較，P<0.01;b：與相同質(zhì)量濃度的水飛雄黃組比較，P<0.01

與空白對照組比較，水飛雄黃、納米雄黃各給藥組均可呈劑量依賴趨勢地減少乳腺癌干細(xì)胞進(jìn)入小室下膜的數(shù)量，其相對侵襲率（水飛雄黃1 mg/L組除外）均顯著降低（P<0.01），且有隨藥物質(zhì)量濃度增加而降低的趨勢;與相同質(zhì)量濃度的水飛雄黃組比較，納米雄黃組的相對侵襲率（納米雄黃1 mg/L組除外）更低（P<0.01）。結(jié)果見表3、圖6。

3.5 納米雄黃對CD44+/CD24-細(xì)胞亞群比例的影響

與空白對照組比較，水飛雄黃、納米雄黃各給藥組干細(xì)胞懸浮球的CD44+/CD24-細(xì)胞亞群比例均顯著降低（P<0.01）;與相同質(zhì)量濃度的水飛雄黃組比較，納米雄黃組的CD44+/CD24-細(xì)胞亞群比例更低（P<0.01）。結(jié)果見圖7、表4。

3.6 納米雄黃對乳腺癌干細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組比較，水飛雄黃、納米雄黃各給藥組乳腺癌干細(xì)胞中上皮鈣黏著蛋白的表達(dá)水平均顯著升高，波形蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01），且有隨著藥物質(zhì)量濃度增加而升高或降低的趨勢;與相同質(zhì)量濃度的水飛雄黃比較，納米雄黃下調(diào)波形蛋白表達(dá)及上調(diào)上皮鈣黏著蛋白表達(dá)的作用更強(qiáng)（P<0.01）。結(jié)果見表5、圖8。

a：與空白對照組比較，P<0.01;b：與相同質(zhì)量濃度的水飛雄黃組比較，P<0.01

4 討論

目前，分離腫瘤干細(xì)胞較常用的方法有3種：流式與磁珠細(xì)胞分選法、側(cè)群細(xì)胞分選法、無血清培養(yǎng)法。前兩種方法對分選設(shè)備及細(xì)胞的要求較高，而無血清培養(yǎng)法成本相對較低，且可方便快捷地分離富集腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞[14]。因此，本研究以人乳腺癌MCF-7親本細(xì)胞為對象，采用無血清培養(yǎng)法培養(yǎng)出了乳腺癌干細(xì)胞并對其進(jìn)行性質(zhì)鑒定;并以水飛雄黃為參照，初步考察了納米雄黃對乳腺癌干細(xì)胞的抑制作用。在懸浮球培養(yǎng)期間，本研究對懸浮球細(xì)胞的自我更新能力進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)SFM培養(yǎng)所得的懸浮球細(xì)胞，在SSM培養(yǎng)條件下，可呈單層貼壁生長;將此貼壁細(xì)胞重懸于SFM中，細(xì)胞可繼續(xù)呈懸浮球樣增殖，說明干細(xì)胞懸浮球具有一定的自我更新能力。CD44+/CD24-細(xì)胞亞群比例是公認(rèn)的乳腺癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物[1]。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，第5代懸浮球細(xì)胞CD44+/CD24-細(xì)胞亞群比例為（96.57±1.81）%，所以本研究采用第5代懸浮球細(xì)胞作為乳腺癌干細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這也在一定程度上證實(shí)了無血清培養(yǎng)法是高度富集腫瘤干細(xì)胞的有效途徑之一。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，與水飛雄黃比較，納米雄黃對多種類型腫瘤細(xì)胞的抑制作用更強(qiáng)、生物利用度更高，且納米雄黃能通過抑制細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)凋亡等途徑對乳腺癌細(xì)胞發(fā)揮抑制作用，其還能通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化通路相關(guān)蛋白的表達(dá)而表現(xiàn)出抗侵襲轉(zhuǎn)移的潛力[15-18]。本研究以水飛雄黃為參照，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)、懸浮球形成及分化實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀等考察納米雄黃對無血清培養(yǎng)乳腺癌干細(xì)胞的影響，結(jié)果表明納米雄黃可抑制MCF-7親本細(xì)胞及其干細(xì)胞的增殖;且納米雄黃（1、2.5、5、10 mg/L）可有效抑制乳腺癌干細(xì)胞懸浮球的形成及分化，并可抑制細(xì)胞的遷移及侵襲，降低其CD44+/CD24-細(xì)胞亞群比例;Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，納米雄黃可能通過影響乳腺癌干細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而表現(xiàn)出抗轉(zhuǎn)移的潛力;同時，上述作用有劑量依賴趨勢。此外，本研究結(jié)果還顯示，與相同質(zhì)量濃度的水飛雄黃比較，納米雄黃對乳腺癌干細(xì)胞的抑制作用更強(qiáng)，具有更好的抗腫瘤潛能。

綜上所述，與相同質(zhì)量濃度的水飛雄黃比較，納米雄黃可更明顯地抑制乳腺癌干細(xì)胞的增殖、懸浮球的形成及分化能力，并可降低CD44+/CD24-細(xì)胞亞群比例。這種作用可能與納米雄黃通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化通路相關(guān)蛋白的表達(dá)而抑制乳腺癌干細(xì)胞的遷移和侵襲有關(guān)，提示其可能具有良好的抗乳腺癌干細(xì)胞潛能，并可能在治療乳腺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移方面具有一定的優(yōu)勢。

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（收稿日期：2021-08-23 修回日期：2021-11-19）

（編輯：舒安琴）