長期神經(jīng)病理性疼痛行為學(xué)改變與突觸可塑性和邊緣回路改變的相關(guān)性研究：一項(xiàng)小鼠的對(duì)照觀察研究

長期的慢性疼痛會(huì)導(dǎo)致負(fù)責(zé)情緒和認(rèn)知的大腦區(qū)域發(fā)生細(xì)胞重組和功能改變。除了感覺功能障礙外，慢性疼痛或神經(jīng)病理性疼痛病人還可能出現(xiàn)情緒問題，包括抑郁、學(xué)習(xí)和記憶能力的下降等，其機(jī)制目前仍不清楚。有觀點(diǎn)認(rèn)為皮質(zhì)和邊緣系統(tǒng)結(jié)構(gòu)（如前額葉皮質(zhì)、杏仁核、海馬體和伏隔核）的可塑性改變與疼痛誘發(fā)的情緒行為有關(guān)。神經(jīng)炎癥和免疫機(jī)制等因素，被認(rèn)為也參與神經(jīng)病理性疼痛的病理生理學(xué)。在大腦中，固有免疫細(xì)胞釋放的促炎因子水平的增加可能參與神經(jīng)重組，并參與神經(jīng)病理性疼痛的感覺和情緒成分。

該研究采用多學(xué)科方法研究長期神經(jīng)病理性疼痛的情感和認(rèn)知變化。選用小鼠SNI 模型，該模型可以復(fù)制人類的神經(jīng)病理性疼痛和相關(guān)合并癥。SNI 后1 個(gè)月和12 個(gè)月對(duì)疼痛、抑郁樣行為和認(rèn)知能力進(jìn)行評(píng)估。

為了評(píng)估長期神經(jīng)病理性疼痛可能出現(xiàn)的大腦功能和結(jié)構(gòu)改變，該研究檢測(cè)了前額葉皮質(zhì)(prefrontal cortex, PFC)-伏隔核核心通路 (nucleus accumbens core, NAcore) 和內(nèi)嗅皮質(zhì) (lateral entorhinal cortex, LEC)-齒狀回 (dentate gyrus, DG) 通路的突觸可塑性（長時(shí)程增強(qiáng)long-term potentiation, LTP）水平。這些通路是控制情感行為和獎(jiǎng)賞機(jī)制的關(guān)鍵回路，最近被證實(shí)有可能參與慢性疼痛的發(fā)展。除此之外還研究了免疫系統(tǒng)在慢性疼痛中的作用：①分析在神經(jīng)炎癥反應(yīng)中PFC 和海馬組織免疫因子相關(guān)基因的表達(dá)；②分析在神經(jīng)病理性疼痛的小鼠中，具有免疫抑制作用的調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞亞群百分比。

該研究是第一篇研究神經(jīng)病理性疼痛行為學(xué)和電生理改變相關(guān)性的文章。結(jié)果顯示SNI 模型的特定行為缺陷與PFC 和邊緣回路功能障礙之間可能存在相關(guān)性。此外，研究證實(shí)了長期神經(jīng)病理性疼痛會(huì)引起大腦不同區(qū)域免疫相關(guān)基因表達(dá)的變化，這可能是神經(jīng)病理性疼痛新的分子機(jī)制通路。

1.方法

（1）構(gòu)建SNI 模型：選用8 周齡雄性小鼠，適應(yīng)環(huán)境1 周后，開始構(gòu)建SNI 模型。方法參考Decosterd 和Woolf 的文獻(xiàn)，SNI 組小鼠結(jié)扎脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)，對(duì)照組僅暴露不離斷。

（2）神經(jīng)病理性疼痛行為學(xué)檢測(cè)：觸誘發(fā)痛：采用一系列校準(zhǔn)von Frey 纖維絲法 (Ugo Basile, Varese,Italy)，縮足閾值顯著降低即定義為觸誘發(fā)痛陽性；低溫誘發(fā)疼痛：使用丙酮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)低溫誘發(fā)疼痛閾值，并按照小鼠對(duì)丙酮反應(yīng)的嚴(yán)重程度得分進(jìn)行分級(jí)；懸尾試驗(yàn)：小鼠沒有表現(xiàn)出任何身體運(yùn)動(dòng)，被動(dòng)懸掛、完全靜止，被定義陽性反應(yīng)的時(shí)間；濺水試驗(yàn)：超過5 分鐘的梳洗時(shí)間即被記錄下來。

（3）認(rèn)知能力的檢測(cè)：新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn) (novel object recognition, NOR)，采用大小和形狀不同、顏色相同（黑色）或顏色不同的塑料制品替換的方法，記錄NOR 判別指數(shù)。

Y 迷宮試驗(yàn)，記錄小鼠自發(fā)交替的次數(shù)和交替的百分比。

（4）電生理學(xué)檢測(cè)：對(duì)于LEC-DG 和PFC-NAcore信號(hào)通路電生理學(xué)檢測(cè)，分別放置刺激電極和記錄電極，然后進(jìn)行高頻刺激 (high-frequency stimulation, TBS) 記錄LTP 的變化，并采用重復(fù)測(cè)量的2-way 方差分析 (ANOVA) 進(jìn)行分析。

（5）微透析實(shí)驗(yàn)：微透析探針立體定向植入齒狀回，采用ACSF 透析液進(jìn)行透析，透析液通過高效液相色譜法分析氨基酸釋放量。

（6）基因表達(dá)分析：提取RNA 并合成cDNA 后，使用TaqMan 陣列小鼠免疫面板進(jìn)行基因表達(dá)定量分析，采用PANTHER 在線工具，對(duì)未知蛋白及其基因進(jìn)行分類，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析。

（7）調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞檢測(cè)：采集外周血樣本，并用調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞單克隆抗體混合物孵育，之后在FACS Canto 流式細(xì)胞儀上檢測(cè)，并使用Diva 軟件(BD Biosciences) 進(jìn)行分析。

2. 結(jié)果

（1）SNI 模型誘發(fā)行為學(xué)改變

觸誘發(fā)痛：與對(duì)照組相比，SNI 組小鼠在術(shù)后1 個(gè)月和12 個(gè)月對(duì)機(jī)械和溫度刺激的傷害感受閾值降低（SNI 組1 個(gè)月：0.04188±0.0092 g，對(duì)照組1個(gè)月：0.7275±0.134 g，P ＜ 0.0001；SNI 組12 個(gè)月0.0735±0.01374 g，對(duì)照組12 個(gè)月：0.8475±0.1428 g；P ＜ 0.001）。

低溫誘發(fā)痛：丙酮實(shí)驗(yàn)顯示與對(duì)照組相比，SNI 組小鼠揮足和舔足次數(shù)顯著增加（SNI 組1 個(gè)月：1.333±0.2，SNI 組12 個(gè)月 2.039±0.348；對(duì)照組1 個(gè)月：0.1667±0.10，對(duì)照組12 個(gè)月：0.5171±0.1；P = 0.0124，P = 0.0005），1 個(gè)月和12 個(gè)月SNI組小鼠的縮足反射潛伏期明顯縮短。

抑郁樣行為改變：懸尾實(shí)驗(yàn)中SNI 組小鼠1 個(gè)月和12 個(gè)月靜止時(shí)間明顯長于對(duì)照組（SNI 組1 個(gè)月： 88.21±6.3 s，SNI 組12 個(gè)月96.4±6.75 s；對(duì)照組1 個(gè)月：57.88±4.8 s，對(duì)照組12 個(gè)月：67.50±6.591 s；P = 0.0061，P = 0.0085），表明在長期的神經(jīng)病理性疼痛導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)主動(dòng)逃避行為的缺失。濺水實(shí)驗(yàn)中，SNI 組小鼠修飾活動(dòng)持續(xù)時(shí)間明顯減少（SNI 組1 個(gè)月：86.38±5.539 s，SNI 組12 個(gè)月53.00±5.9 s；對(duì)照組1 個(gè)月：123±9.2 s，對(duì)照組12 個(gè)月：89.30±7.1 s；P = 0.0019，P = 0.0125）。與1 個(gè)月對(duì)照組小鼠相比，12 個(gè)月對(duì)照組小鼠的修飾活動(dòng)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P = 0.0149)。

（2）SNI 影響小鼠的記憶能力

物體識(shí)別記憶能力：SNI 術(shù)后1 個(gè)月，SNI 組小鼠在短期和長期探索實(shí)驗(yàn)中都不能完全區(qū)分不同或相似的物體（1.5 小時(shí)SNI 組：0.1163±0.02，24 小時(shí)SNI 組：0.1213±0.02；1.5 小時(shí)對(duì)照組：0.3588±0.06，24 小時(shí)對(duì)照組0.3188±0.05；P = 0.0173, P =0.0379）。SNI 術(shù)后12 個(gè)月，小鼠能夠區(qū)分完全不同的物體（1.5 小時(shí)SNI 組：0.348±0.06，24 小時(shí)SNI 組：0.310±0.06；1.5 小時(shí)對(duì)照組：0.455±0.05，24 小時(shí)對(duì)照組0.348±0.06），但不能識(shí)別相似的物體（1.5 小時(shí)SNI 組：0.3238±0.02，24 小時(shí)SNI 組：0.1643±0.05；1.5 小時(shí)對(duì)照組：0.436±0.03，24 小時(shí)對(duì)照組0.3488±0.07；P = 0.06 和 P = 0.03）。

空間記憶能力：1 個(gè)月后，SNI 組小鼠Y 迷宮交替百分率顯著下降（對(duì)照組69.19±3.5%，SNI 組49.05±3.293%，P = 0.0002），但是12 個(gè)月后，與對(duì)照組相比(63.00±2.079%)，兩組Y 迷宮交替百分率(59.88±2.41%)無顯著變化(P = 0.8710)，表明SNI 后12 個(gè)月小鼠空間記憶能力基本恢復(fù)。

（3）SNI 影響PFC-NAcore 和LEC-DG 信號(hào)通路的突觸可塑性

PFC-NAcore 信號(hào)通路，在SNI 組1 個(gè)月和12個(gè)月的小鼠中，PFC 應(yīng)用TBS 未能誘導(dǎo)NAcore 的LTP（96.82±3.21%和94.39±4.95%）。

LEC-DG 信號(hào)通路，SNI 小鼠1 個(gè)月后應(yīng)用TBS后，振幅（30～60 分鐘：103.06±4.40%；P = 0.40,t21 = 0.84）和斜率（30～60 分鐘：103.7±6.2%，P =0.19，t21 = 1.33）沒有任何變化；而SNI 術(shù)后12 個(gè)月，應(yīng)用TBS，小鼠DG 場(chǎng)興奮性突觸后電位 (field excitatory postsynaptic potential, fEPSPs) 振幅(151.26%±20.39%，P ＜ 0.001，t21 = 36.63)和斜率(189.40%±15.09%，P ＜ 0.0001，t21 = 28)部分重建。

（4）SNI 對(duì)齒狀回細(xì)胞外氨基酸水平的影響

12 個(gè)月后，SNI 組小鼠γ-氨基丁酸 (GABA) 水平(14.53±2.1 pmol/μl)顯著高于對(duì)照組小鼠(5.669±0.71 pmol/μl) (P ＜ 0.001)。而SNI 組小鼠的細(xì)胞外L-谷氨酸(Glu)水平、D-天冬氨酸 (Asp)、 甘氨酸(Gly)水平與對(duì)照組相比無顯著變化（L-Glu，SNI 組小鼠：8.029±1.0 pmol/μl，對(duì)照組小鼠：9.625±0.3 pmol/μl；D-Asp，SNI 組小鼠：0.2073±0.04 pmol/μl，對(duì)照組小鼠：0.3127±0.04 pmol/μl；Gly, SNI 組小鼠：33.02±1.16 pmol/μl，對(duì)照組小鼠：28.58±2.039 pmol/μl）。

（5）SNI 影響海馬和PFC 促炎因子相關(guān)基因的表達(dá)

與1 個(gè)月對(duì)照組小鼠相比，12 個(gè)月對(duì)照組小鼠海馬和PFC 中有11 個(gè)基因顯著上調(diào)，這些基因主要涉及促炎和應(yīng)激相關(guān)的介質(zhì)，且以海馬組織為主。與1 個(gè)月對(duì)照組小鼠相比，1 個(gè)月SNI 組小鼠海馬有26 個(gè)基因顯著上調(diào)，主要是凋亡相關(guān)因子Bax和Bcl-2、內(nèi)皮標(biāo)志物CD34、巨噬細(xì)胞集落刺激因子-1 等。與1 個(gè)月對(duì)照組小鼠相比，1 個(gè)月SNI 組小鼠PFC，只有一個(gè)基因顯著下調(diào)，即轉(zhuǎn)錄因子TBX21。12 個(gè)月SNI 組小鼠中，只有少數(shù)同時(shí)在海馬和PFC 出現(xiàn)基因表達(dá)變化。

總之，在1 個(gè)月SNI 組小鼠的海馬中觀察到炎癥和免疫介質(zhì)的大量激活，從而恢復(fù)了對(duì)照組小鼠的基礎(chǔ)免疫結(jié)構(gòu)。此外，在1 個(gè)月和12 個(gè)月的SNI小鼠的PFC 中，只觀察到指向正向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的少數(shù)介質(zhì)表達(dá)有變化。

（6）SNI 不影響外周血調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的比例

SNI 組與對(duì)照組的相比，調(diào)節(jié)性CD4+CD25+CD127low/-T 淋巴細(xì)胞的百分比，以及CD4+CD251+T淋巴細(xì)胞總數(shù)的百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.討論

該研究利用SNI 模型，將行為學(xué)檢測(cè)和體內(nèi)電生理學(xué)檢測(cè)、PFC 和邊緣區(qū)域的特定回路功能障礙聯(lián)系起來，結(jié)合SNI 相關(guān)的參與免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的基因的調(diào)控，探討小鼠長期神經(jīng)病理性疼痛行為改變的機(jī)制。

前期研究證實(shí)，時(shí)間是影響慢性疼痛相關(guān)的情感/認(rèn)知障礙發(fā)展的關(guān)鍵因素。疼痛癥狀會(huì)在損傷后立即出現(xiàn)，而情感/認(rèn)知障礙會(huì)在受傷后幾周或幾個(gè)月才出現(xiàn)，有時(shí)甚至在疼痛超敏反應(yīng)消失后仍會(huì)持續(xù)。該研究的數(shù)據(jù)證實(shí)SNI 模型可誘發(fā)至少持續(xù)12 個(gè)月的機(jī)械刺激過敏，且都表現(xiàn)出類似于慢性疼痛病人經(jīng)常出現(xiàn)的缺乏動(dòng)機(jī)或抑郁行為，如保持不動(dòng)時(shí)間延長、梳理活動(dòng)減少、行為絕望的跡象等。在12 個(gè)月的SNI 小鼠中，有抑郁樣行為但不伴隨認(rèn)知障礙。在SNI 組小鼠中，認(rèn)知功能減退和記憶缺陷是疼痛病人的主要并發(fā)癥。周圍神經(jīng)損傷可能會(huì)導(dǎo)致負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)和空間記憶任務(wù)的特定腦回路的海馬突觸可塑性降低。既往的研究表明，SNI 持續(xù)30 天會(huì)導(dǎo)致LEC-DG 通路中LTP 的消失。LTP 的缺失，響應(yīng)單脈沖的更高的基底振幅和斜率，可能是由于齒狀回中谷氨酸水平的增加有關(guān)。這種功能和結(jié)構(gòu)的改變可能歸因于，至少部分歸因于神經(jīng)元的重組，類似于外周神經(jīng)病理性疼痛模型中前額葉皮質(zhì)錐體神經(jīng)元重組。SNI 皮質(zhì)和海馬的基部和頂端樹突的形態(tài)變化，可能反過來驅(qū)動(dòng)LTP的變化。

研究發(fā)現(xiàn)，12 個(gè)月SNI 組小鼠的空間記憶和辨別記憶基本恢復(fù)正常，海馬LTP 也基本恢復(fù)。細(xì)胞外谷氨酸水平?jīng)]有變化，而GABA 水平升高。神經(jīng)生化數(shù)據(jù)表明，在12 個(gè)月SNI 小鼠中，由于谷氨酸溢出導(dǎo)致的高敏狀態(tài)可能被GABA 活性的增加所抵消。

NOR 測(cè)試中采用完全不同或相似的物體檢測(cè)SNI 對(duì)小鼠識(shí)別能力的影響。神經(jīng)損傷后1 個(gè)月小鼠出現(xiàn)識(shí)別障礙，表現(xiàn)為NOR 記憶的紊亂。但SNI 后12 個(gè)月小鼠表現(xiàn)出正常的NOR 和空間記憶能力。這些發(fā)現(xiàn)說明，LEC-DG 的破壞可能至少部分地影響了神經(jīng)病理性疼痛的認(rèn)知能力。同時(shí)還應(yīng)考慮到辨別能力的下降有一部分原因是衰老。區(qū)分性能與成人DG 神經(jīng)功能相關(guān)，而新生DG 神經(jīng)元的產(chǎn)生隨著年齡的增長而顯著減少。因此，不能排除SNI 后12 個(gè)月可能是衰老加重了相關(guān)的缺陷，或者可能是衰老影響到了負(fù)責(zé)辨別能力的其他結(jié)構(gòu)（如皮質(zhì)）。

眾所周知，獎(jiǎng)賞機(jī)制可能參與抑郁和慢性疼痛的發(fā)生。刺激NAc 可以緩解慢性疼痛相關(guān)的抑郁癥狀。該研究發(fā)現(xiàn)SNI 后 1 個(gè)月和12 個(gè)月小鼠在PFC-Nacore 信號(hào)通路中均出現(xiàn)LTP 受損。這些數(shù)據(jù)與最近的研究結(jié)果一致，即小鼠PFC-Nacore 信號(hào)通路失活可導(dǎo)致SNI 感覺和厭惡表型的加重。因此，我們推測(cè)，PFC 投射到Nacore 信號(hào)通路的突觸可塑性降低可能在SNI 的負(fù)面情緒中發(fā)揮作用。

免疫系統(tǒng)與神經(jīng)病理性疼痛的病理生理學(xué)密切相關(guān)。既往的研究證實(shí)，促炎介質(zhì)啟動(dòng)的免疫-神經(jīng)元溝通可能參與神經(jīng)病理性疼痛的感覺成分和情緒成分。由固有小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化驅(qū)動(dòng)的神經(jīng)炎癥，觸發(fā)神經(jīng)元重組，該過程被認(rèn)為誘發(fā)周圍神經(jīng)損傷后認(rèn)知缺陷和抑郁的發(fā)生。此外，根據(jù)損傷的性質(zhì)，T 細(xì)胞可能有助于疼痛的發(fā)生或緩解。該研究的數(shù)據(jù)顯示，SNI 后1 個(gè)月或12 個(gè)月不會(huì)影響調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的百分比，但是海馬中免疫相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生變化，即在SNI 后1 個(gè)月的小鼠中，檢測(cè)到參與炎癥和凋亡信號(hào)通路基因的表達(dá)增強(qiáng)，而SNI 后12 個(gè)月沒有該變化。此外IL-1β 表達(dá)增加，同時(shí)伴有與神經(jīng)炎癥、腦損傷和衰老高度相關(guān)的其他底物（如NF-кb、C3、CD38、CD68 和Socs2）的表達(dá)上調(diào)。因此，不能排除IL-1β 的增加，可能至少部分地，通過損害記憶和學(xué)習(xí)過程，影響了 SNI 后1 個(gè)月小鼠LTP。

12 個(gè)月對(duì)照組小鼠，與1 個(gè)月的對(duì)照組小鼠相比，CD38 的表達(dá)明顯上調(diào)，表明M1 型極化巨噬細(xì)胞（促炎作用）和輔酶NAD 的減少可能與衰老有關(guān)。該研究發(fā)現(xiàn)CCR2（特異性CCL2 (MCP-1)趨化因子受體）的表達(dá)增加，既往的研究表明CCR2 在慢性疼痛的發(fā)展中至關(guān)重要，并與不同大腦區(qū)域的多巴胺能或膽堿能神經(jīng)元共定位，它調(diào)節(jié)單核細(xì)胞向炎癥部位的遷移。巨噬細(xì)胞集落刺激因子-1 的大量上調(diào)表明單核吞噬細(xì)胞對(duì)ECM 蛋白的刺激和隨后的激活的敏感性增加，這不僅是簡(jiǎn)單的促炎功能，可能與神經(jīng)損傷后再生有關(guān)。值得注意的是，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TFRC 誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵攝入量的相關(guān)增加，是一種損傷后的代謝重組。但在SNI 后12個(gè)月小鼠中沒有檢測(cè)到這種改變。這些結(jié)果可能與行為學(xué)（和電生理學(xué)）表型的部分恢復(fù)相一致。然而，相應(yīng)年齡的對(duì)照組小鼠神經(jīng)炎癥介質(zhì)基礎(chǔ)水平的增加可能會(huì)掩蓋SNI 后12 個(gè)月小鼠這些因子的變化。關(guān)于PFC，研究發(fā)現(xiàn)在近50 個(gè)失調(diào)基因中，SNI后1 個(gè)月小鼠中只有Tbx21 表達(dá)有顯著性差異，在SNI 后12 個(gè)月小鼠Ctla4 和Vcam 表達(dá)有顯著性差異。值得一提的是，對(duì)SNI 小鼠PFC 中差異DNA甲基化進(jìn)行詳細(xì)分析，發(fā)現(xiàn)時(shí)間特異性CpG 甲基化動(dòng)力學(xué)。盡管甲基化的基因不包括該研究中發(fā)現(xiàn)的3 個(gè)失調(diào)PFC 基因中的任何一個(gè)，但觀察到的甲基化提示可能是基于該研究發(fā)現(xiàn)的功能改變。在整個(gè)研究過程中，證實(shí)了神經(jīng)病理性疼痛過程有與炎癥和T 細(xì)胞適應(yīng)性免疫反應(yīng)有關(guān)的基因的特定富集，包括Toll 受體信號(hào)通路，以及一系列黏附分子的參與。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明了與該研究中討論的基因的功能聯(lián)系。

4.局限性

首先，該研究的分析不包括性別對(duì)SNI 后12個(gè)月小鼠的影響?？紤]到免疫細(xì)胞在疼痛處理過程中有性別差異，這可能是一個(gè)比較重要的問題。第二，基因表達(dá)分析組織來源是整個(gè)PFC 和海馬，而不是特定的亞區(qū)。因此，不能排除一些有意義的基因表達(dá)差異可能被稀釋。第三，SNI 表型涉及分子途徑，但尚未對(duì)分子機(jī)制進(jìn)行研究。在后續(xù)關(guān)于長期神經(jīng)性疼痛相關(guān)的功能改變的研究中，要解決這些問題。

5.結(jié)論

該研究的數(shù)據(jù)表明，SNI 后12 個(gè)月小鼠存在疼痛和抑郁樣行為，而認(rèn)知障礙基本恢復(fù)，這表明負(fù)責(zé)神經(jīng)病理性疼痛的疼痛成分和情緒成分可能是不同的腦區(qū)。此外，該研究提示海馬神經(jīng)炎癥可能影響神經(jīng)病理性疼痛情緒成分的發(fā)展。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)為以后研究周圍神經(jīng)損傷的遠(yuǎn)期損害奠定了基礎(chǔ)。（Guidaa F, Iannottaa M, Misso G, et al. Long-term neuropathic pain behaviors correlate with synaptic plasticity and limbic circuit alteration: a comparative observational study in mice. Pain, 2022, 163(8):1590-1602. 山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院疼痛科，李蕓 譯，孫濤 校）