視網(wǎng)膜新生血管鼠模型的研究進展

徐千惠 綜述 陳俊 邵毅 審校

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，南昌 330006

建立視網(wǎng)膜新生血管(retinal neovascularization，RNV)動物模型有助于研究者更加全面深入了解某些疾病，例如糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)和脈絡(luò)膜新生血管等的生物學(xué)特性，同時也可應(yīng)用于新型治療方法的測試和新技術(shù)的開發(fā)[1]。這些基因工程模型鼠概括了RNV在人類中的許多臨床表現(xiàn)，但RNV的發(fā)展時間、病情進展、病變的大小和外觀在不同模型鼠中各不相同。本文介紹RNV阻塞小鼠模型、RNV氧誘導(dǎo)模型和RNV轉(zhuǎn)基因小鼠模型優(yōu)缺點以及在臨床病理研究上的前景，以期為醫(yī)務(wù)人員和相關(guān)領(lǐng)域研究者提供有關(guān)基因工程模型鼠相對全面的介紹，評估這些疾病的新治療方法，為研究人員進一步闡明RNV的生物學(xué)特性和病理機制研究提供參考。

1 RNV概述

近年來RNV疾病受到越來越多的關(guān)注。RNV的形成起源于視網(wǎng)膜血管，具有雙血供特性。RNV通常是由于內(nèi)界膜延伸到玻璃體，在一些情況下，血管向反方向生長進入視網(wǎng)膜下間隙，許多研究已經(jīng)表明缺血是RNV形成的主要原因[2]。RNV所致疾病的共同特征是視網(wǎng)膜血管的衰減導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血，DR、ROP、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞和視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞被稱為缺血性視網(wǎng)膜病變。

RNV是由多種病因引發(fā)的脈絡(luò)膜新生血管芽穿越Bruch膜并在視網(wǎng)膜色素上皮上、下增生形成的纖維血管組織，常伴有視網(wǎng)膜下的漿液性滲出乃至出血，是導(dǎo)致多種眼底疾病視功能損害的主要原因[3]。研究顯示，RNV形成過程中涉及多種信號分子表達水平的改變，如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、組織蛋白酶B、堿性成纖維細胞生長因子、白細胞介素8、腫瘤壞死因子以及單核細胞趨化因子等[4-7]。

RNV形成是缺血、缺氧性視網(wǎng)膜疾病發(fā)展到終末階段的特征性表現(xiàn)，如增生性DR和ROP[8]。DR是糖尿病嚴重的眼部并發(fā)癥之一，其血管增生階段,異常的血液沿視網(wǎng)膜血管進入玻璃體。目前還沒有模型能完全概括出糖尿病每個階段發(fā)生的神經(jīng)和血管變化的病理生理學(xué)過程[9]。其常用的模型為大鼠腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)，利用硝基脲衍生物鏈脲霉素的致糖尿病作用誘導(dǎo)大鼠發(fā)生糖尿病從而研究DR的特征[10]。氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(oxygen-induced retinopathy，OIR)模型中常見的用于研究DR的是通過激光或光動力誘導(dǎo)RNV形成并伴有視網(wǎng)膜靜脈阻塞。

此外，隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，可以利用分子生物學(xué)手段在小鼠體細胞或生殖細胞內(nèi)實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因或目的基因的敲入或敲除，如表達Kras并敲除Smad5的小鼠以及Kras突變和/或Trp53突變的小鼠成為胰腺癌研究常用的動物模型[11]。淀粉樣前體蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠模型可被用于研究阿爾茨海默病的病理機制[12]。由此可見。基因工程小鼠模型可以用于探討特定基因型與疾病表型的關(guān)聯(lián)，極大地豐富了對宿主基因功能和疾病特征的研究。

2 RNV阻塞模型

通過激光和光動力造成小鼠靜脈阻塞已成為RNV的有效模型[13]。小鼠視網(wǎng)膜靜脈阻塞引起的微血管改變與臨床上視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞相似，包括靜脈擴張、血管迂曲和視網(wǎng)膜血管滲出液。激光和光動力可以誘導(dǎo)視網(wǎng)膜或虹膜內(nèi)血流減少、視網(wǎng)膜缺血和隨后新生血管的形成。根據(jù)模型制作時影響視網(wǎng)膜靜脈數(shù)量的改變，該模型可以是視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞或中央靜脈阻塞模型。

模型制作過程如下：當小鼠麻醉結(jié)束后，通過尾靜脈注射玫瑰孟加拉染料，或腹腔內(nèi)注射熒光素鈉，并在主要靜脈選擇激光點。如果激光過弱則不會發(fā)生閉塞，而過于強烈則會廣泛損害視網(wǎng)膜其他區(qū)域或引起靜脈出血，因此需要調(diào)整適宜的激光參數(shù)，實現(xiàn)靜脈閉塞。當RNV形成發(fā)生在單個視網(wǎng)膜或多個視網(wǎng)膜靜脈，并用氬激光凝固或光動力方式阻塞后，小鼠可出現(xiàn)視網(wǎng)膜水腫、出血和視網(wǎng)膜靜脈閉塞，然后可發(fā)現(xiàn)在視網(wǎng)膜缺血區(qū)域前后有新生血管形成。

3 RNV氧誘導(dǎo)模型

OIR小鼠模型已成為研究缺血引起的病理性血管生成類疾病的重要模型[14]。該模型的基本機制為視網(wǎng)膜在早期發(fā)育過程中暴露于高氧狀態(tài)下會導(dǎo)致正常視網(wǎng)膜血管發(fā)育的阻滯。當模型動物回到正常體溫時，在神經(jīng)組織有充分營養(yǎng)支持的條件下，模型處于相對缺氧狀態(tài)同時視網(wǎng)膜缺乏正常的血管系統(tǒng)。而這種不受控制、異常的RNV生成與ROP一致。此類OIR小鼠模型優(yōu)點在于當暴露在高氧環(huán)境下時視網(wǎng)膜周圍血管消失[15]，當氧氣從室內(nèi)空氣中去除，會導(dǎo)致血管與血管之間的新生血管生長至視網(wǎng)膜中周部無血管區(qū)域。盡管ROP后期OIR小鼠模型未發(fā)生視網(wǎng)膜脫離，但這種缺血介導(dǎo)病理性新生血管形成的OIR模型對于研究DR也十分有用，同時也已經(jīng)應(yīng)用到相關(guān)抗血管生成的一般研究。此外，小鼠模型的成本和手術(shù)時間與其他動物相比是有利的，并且小鼠的視網(wǎng)膜能夠相對順利地發(fā)展成病理性血管閉塞和新生血管的合格模型。

4 RNV轉(zhuǎn)基因小鼠模型

4.1 rho/VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠

有研究者觀察由視紫紅質(zhì)啟動子驅(qū)動的VEFG轉(zhuǎn)基因小鼠(rho/VEGF小鼠)視網(wǎng)膜內(nèi)和視網(wǎng)膜下新生血管的發(fā)育，提出VEGF在視網(wǎng)膜光感受器中過度表達，表明新生血管起源于視網(wǎng)膜深毛細血管床，延伸至視網(wǎng)膜下間隙。rho/VEGF轉(zhuǎn)基因模型可能與視網(wǎng)膜血管瘤增生患者的疾病實體更密切相關(guān)[8]。

4.2 rho/rtTA-TRE/VEGF或IRBP/rtTA-TRE/VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠

使用反向四環(huán)素置換激活子(reverse tetracycline replacement activator，rtTA)誘導(dǎo)啟動子系統(tǒng)，與視網(wǎng)膜紫質(zhì)蛋白或視網(wǎng)膜受體結(jié)合蛋白(interphotoreceptor retinoid-binding protein，IRBP)啟動子耦聯(lián)來控制VEGF轉(zhuǎn)基因表達在視網(wǎng)膜中開始的時間。在沒有多西環(huán)素的情況下，成年轉(zhuǎn)基因小鼠的VEGF表達很少。在小鼠體內(nèi)添加多西環(huán)素后，VEGF表達明顯增多，表達范圍更廣，并顯示與更廣泛的新生血管形成有關(guān)。

4.3 VEGF165高表達小鼠模型

VEGF165(hVEGF)過度表達轉(zhuǎn)基因小鼠模型可表現(xiàn)為輕度到重度RNV形成。這些轉(zhuǎn)基因小鼠模型通過顯微注射含有hVEGF基因的DNA結(jié)構(gòu)，隨后hVEGF基因被截斷的小鼠視網(wǎng)膜紫質(zhì)啟動子驅(qū)動。低hVEGF的轉(zhuǎn)基因系表現(xiàn)出輕度改變，如熒光素滲漏、小動脈瘤和靜脈曲張；高hVEGF的轉(zhuǎn)基因系表現(xiàn)出嚴重表型和廣泛的新生血管形成、出血以及視網(wǎng)膜脫離[16]。

4.4 Nrl-/-Grk1-/-雙基因敲除小鼠

Nrl-/-Grk1-/-雙基因敲除小鼠是從G蛋白耦聯(lián)受體信息傳導(dǎo)通路著手研究，G蛋白耦聯(lián)受體激酶(G protein-coupled receptor kinase 1，Grk1)參與視錐細胞的失活和正常復(fù)蘇，神經(jīng)視網(wǎng)膜亮氨酸拉鏈基因敲除的小鼠(Nrl-/-)視網(wǎng)膜在生物化學(xué)中被稱為“全視錐細胞型”。研究顯示缺乏Grk1將導(dǎo)致與年齡和光線相關(guān)的錐體細胞營養(yǎng)不良。在1月齡小鼠的視網(wǎng)膜全層可觀察到新生血管形成，而這些均為炎癥通路介導(dǎo)[17]。

5 小結(jié)與展望

視網(wǎng)膜周圍新生血管的2種類型是脈絡(luò)膜新生血管以及RNV，RNV起源于視網(wǎng)膜循環(huán)，延伸至玻璃體后、玻璃體面或是進入玻璃體，由于血管生成細胞因子擴散到玻璃體，RNV通常會以一種更為隨意、迅速的方式增長。RNV是由視網(wǎng)膜大面積毛細血管閉塞、慢性缺血引起，與VEGF的生成和釋放有關(guān)。新生血管可起自視盤表面及視網(wǎng)膜小靜脈，沿視網(wǎng)膜表面生長，在有玻璃體粘連的部位可長入玻璃體內(nèi)，并含有數(shù)量不等的纖維組織。在小鼠模型中，誘導(dǎo)缺血的方法有缺氧、激光、炎癥和輻射。RNV小鼠模型可以通過激光光凝或光動力療法阻斷視網(wǎng)膜靜脈，誘導(dǎo)RNV和視網(wǎng)膜靜脈阻塞。其他小鼠模型包括過表達VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠模型以及炎癥相關(guān)模型。本文介紹了經(jīng)尾靜脈注射玫瑰孟加拉染料或腹腔內(nèi)注射熒光素鈉，通過激光實現(xiàn)靜脈閉塞從而在缺血區(qū)域形成新生血管的RNV阻塞小鼠模型；通過制造高氧狀態(tài)使小鼠正常視網(wǎng)膜血管發(fā)育阻滯，從而誘導(dǎo)RNV形成的氧誘導(dǎo)RNV小鼠模型；還介紹了一系列基因工程小鼠模型，包括VEGF轉(zhuǎn)基因表達促進新生血管形成的誘導(dǎo)RNV小鼠模型、VEGF165高表達誘導(dǎo)RNV小鼠模型以及Nrl-/-Grk1-/-雙基因敲除影響視錐細胞發(fā)育的誘導(dǎo)RNV小鼠模型。因此在RNV主要致病因素和治療方式的研究過程中發(fā)現(xiàn)小鼠模型有良好的特征，更易于量化和重現(xiàn)，因此對小鼠模型研究更為普遍。

成功的RNV模型關(guān)鍵在于以不同方式誘導(dǎo)視網(wǎng)膜發(fā)生缺血等病理表現(xiàn)，缺血在RNV的發(fā)育中起著重要作用。RNV小鼠模型建成的要點是在于尋找各種不同的方式使視網(wǎng)膜缺血，減少血流量，進而通過病理生理機制產(chǎn)生RNV。通過研究模型小鼠的視網(wǎng)膜更有利于詳細研究病理血管的生長情況。由于視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)在出生后發(fā)育，血管的形成和退化都可以在嚴格控制的環(huán)境下進行研究。大量使用小鼠視網(wǎng)膜的研究強調(diào)了使用出生后小鼠視網(wǎng)膜的各種活體模型的重要性，以及對我們理解一些威脅視力的疾病背后的血管生成病理機制有重要貢獻。RNV小鼠模型對生物機制、轉(zhuǎn)基因和基因敲除模型的研究也有一定作用，對于藥物開發(fā)研究人員來說，RNV的動物模型提供了藥物實驗的基礎(chǔ)。

不同RNV小鼠模型的形成機制不同，誘導(dǎo)得到的小鼠模型也展現(xiàn)不同的RNV病理形態(tài)和產(chǎn)生機制。在未來的研究中，研究者在選取動物模型前應(yīng)當充分了解RNV形成的機制，根據(jù)測試的假設(shè)，以及可用資金和實驗方向來選擇最合適的小鼠模型。使用不同類型模型鼠有助于我們了解視網(wǎng)膜血管生成性病變的一些最明顯特征以及后續(xù)臨床應(yīng)用治療的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突