鹽酸小檗堿抑制指狀青霉的作用機制

林 波，歐陽秋麗，余 婷，鄭佳佳，陶能國，李 路*

（湘潭大學化工學院，湖南 湘潭 411105）

柑橘是世界上重要的經(jīng)濟作物之一，具有重要的營養(yǎng)價值和藥用價值。據(jù)統(tǒng)計，2019年我國柑橘種植面積約277萬 hm2，柑橘總產(chǎn)量已達4365.57萬 t[1]。在柑橘貯運過程中，病原真菌通過橘皮表面?zhèn)诩肮俟そ唤缣幥秩竟麑?，引起果實腐爛，造成的經(jīng)濟損失不容忽視[2]。其中，由指狀青霉（Penicillium digitatum）引起的綠霉病是柑橘果實采后主要病害之一，在亞熱帶和干旱地區(qū)造成的損失可占柑橘采后總損失的90%[3-4]。目前，柑橘采后病害的防控手段以化學殺菌劑為主，但化學殺菌劑引起的環(huán)境、安全及病原菌耐藥性等問題日益嚴峻，因此篩選高效的綠色植物源殺菌劑具有重要意義[5]。

近年來，植物次生代謝產(chǎn)物生物堿對植物病原真菌的抑制作用引起了廣泛關注[6]。潘佳亮[7]發(fā)現(xiàn)苦參堿能有效抑制山核桃干腐病菌（Botryosphaeria dothidea）的孢子萌發(fā)，且抑制菌絲體生長的半抑制濃度（50%inhibitory concentration，IC50）為1.512 mg/mL。Zhao Zhongmin等[8]研究表明異喹啉類生物堿對植物病原真菌具有廣譜抑菌性，其中血根堿抑制灰葡萄孢（Botrytis cinerea）等8 種植物病原菌生長的抑制中濃度（median effective concentration，EC50）在6.96～59.36 μg/mL之間。Oliva等[9]從蕓香葉（Ruta graveolens）提取的喹諾酮生物堿對灰葡萄孢（B.cinerea）也具有高度抑菌活性。

小檗堿（berberine）又名黃連素，屬于異喹啉類生物堿，主要以鹽酸鹽形式廣泛存在于小檗科、毛莨科、蕓香科植物中。鹽酸小檗堿（berberine hydrochloride，BH）具有廣譜抑菌性，因其多靶位抑菌機制，使致病菌不易產(chǎn)生耐藥性，常作為抗腫瘤、抗炎、抗菌成分應用于臨床制劑中[10-13]。據(jù)報道，從黃連根中提取的小檗堿氯化物可有效抑制小麥白粉病菌（Blumeria graminis）、灰葡萄孢菌（B.cinerea）、葉銹病菌（Puccinia recondit）的生長，其半數(shù)致死濃度（half lethal concentration，LC50）分別為190、80、50 μg/mL[14]。譚婷等[15]從紫葉小檗果中提取的小檗堿在質量濃度為4 mg/mL時對尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）的抑菌率為89.23%。阮元等[16]在離體條件下測定BH對19 種植物病原菌的抑制作用，結果顯示100 μg/mL BH對尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）、蘋果斑點落葉病菌（A.alternata）的生長抑制率均高于75%。Hou Dongyao等[17]發(fā)現(xiàn)BH抑制桃褐腐病菌（Moniliniafructicola）生長的最低抑菌質量濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為46.9 μg/mL。

本研究擬通過離體實驗探究BH對指狀青霉的抑菌活性，利用活體實驗研究BH對柑橘果實綠霉病的防控作用；進一步從病原菌菌絲體表面形態(tài)、細胞壁完整性、細胞膜通透性、活性氧（reactive oxygen species，ROS）及能量代謝方面對BH抑制指狀青霉的作用機制進行初步探討，為柑橘采后綠霉病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

指狀青霉（Penicillium digitatum）菌株，分離于湘潭大學附近果園中自然發(fā)病的柑橘果實。柑橘果實品種為‘宮川’（Citrus unshiuMarc.cv.Miyagawa Wase）。

鹽酸小檗堿水合物（純度98%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鈣熒光白試劑（calcofluor white，CFW）、碘化吡啶（pyridine iodide，PI）、線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）檢測試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）試劑盒 南京建成生物工程研究所；2’,7’-二氯二氫熒光素-雙乙酸酯（2’,7’-dichlorodihyd rofluorescein diacetate，DCFH-DA）試劑盒 上海索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SPX-250B型生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司；SCW-CJ-1F型垂直流潔凈工作臺 蘇州安瑞凈化科技有限公司；DDSJ-308A電導儀 上海儀電科學儀器股份有限公司；RE-2000A型旋轉蒸發(fā)儀 上海雅榮生化設備儀器有限公司；UV-2450型紫外分光光度計、LC-20AT型高效液相色譜儀 日本SHIMADZU公司；ECLIPSE TS100型熒光顯微鏡 日本NIKON公司；JSM-6610LV型掃描電子顯微鏡 日本SANYO電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液制備

將指狀青霉接種于PDA平板上活化，（25±2）℃恒溫培養(yǎng)5～6 d，用接種環(huán)刮取PDA平板上的孢子于無菌水中，紗布過濾掉菌絲，用血球計數(shù)板計數(shù)，用無菌水配制成1×107、1×105個/mL的孢子懸浮液備用。

1.3.2 BH抑制指狀青霉生長情況的分析

采用液體倍半稀釋法[18]測定BH對指狀青霉菌絲生長的抑制作用。配制BH終質量濃度分別為0、0.02、0.04、00.8、0.16、0.32、0.64 g/L的PDB，加入孢子懸浮液后，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱（25±2）℃，160 r/min培養(yǎng)48 h。MIC定義為培養(yǎng)2 d能完全抑制病原菌生長的最低BH質量濃度，將BH質量濃度≥MIC的培養(yǎng)液涂布在PDA平板后繼續(xù)培養(yǎng)2 d，能完全抑制病原菌生長的最低BH質量濃度即最低殺菌質量濃度（minimum fungicidal concentration，MFC）。將濃度為1×107個/mL的孢子懸浮液加入BH質量濃度為0.5 MIC和MIC的PDB中，對照為孢子懸浮液加入不含BH的PDB中（25±2）℃、160 r/min分別培養(yǎng)6、9、12、15 h，統(tǒng)計孢子萌發(fā)率。

1.3.3 BH處理及柑橘果實綠霉病病斑平均直徑的測定

將采摘的柑橘果實于室內(nèi)放置1 d，自來水清洗，用2%（體積分數(shù)）NaClO浸泡2 min，蒸餾水漂洗3 次，自然風干。用小刀在柑橘果實赤道附近劃大小為3 mm×3 mm的傷口，接種10 μL濃度為1×105個/mL的孢子懸浮液。靜置4 h后將果實分別浸泡在1 MFC、5 MFC、10 MFC的BH溶液中1 min，對照組為無菌水處理的果實。隨后，將柑橘果實置于溫度為（23±2）℃、相對濕度為80%～90%的條件下貯藏，用十字測量法每天測量果實的病斑直徑，實驗重復3 次。采用下列公式計算病斑平均直徑[19]，以平均直徑表征病斑直徑。

1.3.4 菌絲體表面形態(tài)觀察

取0.5 mL濃度為1×105個/mL的孢子懸浮液加入50 mL PDB中，（25±2）℃振蕩培養(yǎng)2 d。用4 層紗布過濾得菌絲體，加入含不同質量濃度BH（0 MIC（對照組，下同）、0.5 MIC、MIC）的PDB中振蕩培養(yǎng)120 min，過濾后用蒸餾水清洗3 次。將收集的菌絲體用3%戊二醛溶液4 ℃固定24 h，用無菌水漂洗20 min，依次用30%、50%、70%、95%乙醇溶液分別處理20 min，最后用無水乙醇脫水45 min。將處理后的菌絲體冷凍干燥，噴金后用掃描電子顯微鏡觀察其表面形態(tài)[20]。

1.3.5 菌絲體細胞壁完整性分析

收集培養(yǎng)2 d的指狀青霉菌絲體，分別加入含不同質量濃度BH（0 MIC、0.5 MIC、MIC）的PDB中，于160 r/min、（25±2）℃分別振蕩培養(yǎng)0、30、60、120 min后過濾。分別收集上清液和菌絲體用于胞外AKP活力的測定及細胞壁完整性測定。取300 μL上清液，參考AKP試劑盒的方法測胞外AKP活力。取少量菌絲體加入10 μL CFW熒光染料處理10 s后加入等體積的10% NaOH溶液，在熒光顯微鏡下進行觀察[21]。

1.3.6 菌絲體細胞膜通透性分析

參照Tang Xu等[22]的方法觀察BH對細胞膜通透性的影響。稱取0.10 g上述菌絲體，加入1 mL PBS和10 μL 1 g/L PI染液，37 ℃水浴5 min后用PBS清洗3 次，用熒光顯微鏡進行觀察。將上述收集的上清液用電導儀測定電導率[23]。將上述上清液4 000 r/min離心10 min后，取0.5 mL上清加入0.5 mL蒸餾水，與5 mL考馬斯亮藍G-250染劑混勻，595 nm處測吸光度，根據(jù)蛋白質標準曲線方程計算可溶性蛋白的質量濃度[22]。

1.3.7 菌絲體活性氧水平及丙二醛濃度分析

用DCFH-DA試劑盒檢測菌絲體胞內(nèi)ROS水平，按照說明書處理待測菌絲體，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，用Image-J軟件分析熒光強度，以相對熒光值（與初始熒光強度的比值）表征ROS水平。根據(jù)丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒提供的方法測定菌絲體胞內(nèi)MDA的濃度。

1.3.8 線粒體膜電位及能量代謝水平的測定

參考MMP檢測試劑盒（JC-10染色法）說明書測定MMP的變化情況，在熒光顯微鏡下進行觀察，并用Image-J軟件分析熒光強度，以紅/綠熒光強度比值表征MMP。

參照Tang Xu等[22]的方法測定BH對指狀青霉ATP含量及胞內(nèi)能荷水平的影響。稱取0.50 g上述菌絲體，加入5 mL沸騰的2 mol/L MgSO4溶液混勻后于100 ℃水浴10 min，冰浴冷卻并研磨至勻漿狀。4 000 r/min離心10 min，取上清液于高效液相色譜測定胞內(nèi)ATP含量及能荷水平。實驗重復3 次，結果取平均值。

液相色譜條件：C18柱（5 μm×250 mm×4.60 mm）；柱溫：25℃；流動相為緩沖液：甲醇-緩沖液（含1 mmol/L乙二胺四乙酸-KH2PO4-K2HPO4緩沖液（50 mmol/L、pH 6））體積比為97.5∶2.5；流速：0.80 mL/min；進樣體積：20 μL；檢測波長：259 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

通過Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理，結果用平均值±標準差表示，采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析，采用Ducan多重比較進行組間差異性分析，P＜0.05表示差異顯著，用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 BH對指狀青霉生長情況的影響

不同質量濃度BH對指狀青霉生長情況的影響如表1所示，PDB培養(yǎng)2 d后，BH質量濃度為0.16 g/L時可完全抑制指狀青霉的生長，表明BH抑制指狀青霉菌絲體生長的MIC值為0.16 g/L；將BH質量濃度≥MIC的培養(yǎng)液涂布到PDA平板繼續(xù)培養(yǎng)2 d后發(fā)現(xiàn)，0.32 g/L BH可以完全抑制指狀青霉的生長，表明MFC為0.32 g/L。

表1 BH對指狀青霉菌絲體生長情況的影響Table 1 Effect of BH on the mycelial growth of P.digitatum

從圖1可以看出，不同質量濃度BH處理后，指狀青霉的孢子萌發(fā)率均有所下降。對照組指狀青霉孢子在6 h開始萌發(fā)，此時，BH處理組的孢子均不萌發(fā)。15 h時，對照組孢子萌發(fā)率達（92.48±3.35）%。而0.5 MIC和MIC BH處理組的孢子萌發(fā)率分別為（12.55±0.71）%和（4.40±1.05）%，顯著低于對照組（P＜0.05）。表明BH可顯著抑制指狀青霉孢子的萌發(fā)。

圖1 BH對指狀青霉孢子萌發(fā)率的影響Fig.1 Effect of BH on the spore germination of P.digitatum

2.2 BH對柑橘果實綠霉病發(fā)病進程的影響

BH對柑橘果實綠霉病發(fā)病進程的影響如圖2所示。接種指狀青霉3 d后，對照組柑橘果實開始發(fā)病，并表現(xiàn)出明顯病癥，貯藏5 d后全果腐爛。而經(jīng)5 MFC、10 MFC BH處理的柑橘果實第4天才開始發(fā)病，貯藏5 d后，10 MFC BH處理的果實病斑直徑為（1.13±0.02）cm，顯著小于對照組（（5.62±0.09）cm，P＜0.05）（表2）。說明BH處理延緩了柑橘果實綠霉病的發(fā)病進程，且抑制作用呈濃度依賴性。

表2 BH對柑橘果實綠霉病病斑直徑的影響Table 2 Effect of BH on the lesion diameter of green mold in citrus fruit

2.3 BH對指狀青霉菌絲體表面形態(tài)的影響

BH處理對指狀青霉菌絲體表面形態(tài)的影響如圖3所示。120 min時，對照組菌絲體表面形態(tài)飽滿完整，無褶皺凹陷（圖3A）；而0.5 MIC BH處理組部分菌絲體呈干癟、褶皺、扭曲狀（圖3B）；MIC BH處理組菌絲的損傷程度更加明顯（圖3C）。表明BH可破壞指狀青霉菌絲體表面形態(tài)，且處理質量濃度越大，菌絲體的損傷程度越大。

圖3 BH對指狀青霉菌絲體表面形態(tài)的影響Fig.3 Effect of BH on the mycelial morphology of P.digitatum

2.4 BH對指狀青霉菌絲體細胞壁完整性的影響

細胞壁在真菌的生長和存活中起重要作用，因此經(jīng)常作為真菌抑制劑的作用靶標[24]。CFW可以與真菌細胞壁成分幾丁質和β-葡聚糖結合產(chǎn)生藍色熒光，因此熒光強度的減弱則表明細胞壁完整性受損[25-26]。指狀青霉菌絲體經(jīng)CFW染色后，MIC BH處理組的熒光強度隨處理時間的延長逐漸減弱，而對照組菌絲體的熒光強度基本不變（圖4A）。其中，30 min時，MIC BH處理組的熒光值為初始值的0.93 倍，顯著低于對照組（P＜0.05，圖4B），說明此時細胞壁完整性已受損。AKP存在于細胞壁和細胞膜之間，細胞壁受損將導致AKP泄漏[24,27]，因此進一步測定胞外AKP活力的變化對細胞壁受損情況進行驗證。結果顯示，30 min時，MIC BH處理組的胞外AKP活力為（4.58±0.31）U/L，顯著高于對照組（（3.68±0.09）U/L，P＜0.05）（圖4C）。說明MIC BH處理30 min時，細胞壁完整性已受損，導致AKP從細胞周質空間釋放到胞外。

圖4 BH對指狀青霉菌絲體細胞壁完整性的影響Fig.4 Effect of BH on the cell wall integrity of P.digitatum mycelia

2.5 BH對指狀青霉菌絲體細胞膜完整性的影響

細胞膜的完整性和流動性對真菌的生存和生長至關重要，細胞膜的損傷可導致胞內(nèi)物質泄漏，同時膜滲透性的增加可促進抑菌物質對菌體的作用，加速細胞的凋亡[28-31]。PI是一種熒光染料，可穿過受損的細胞膜與核酸結合產(chǎn)生紅色熒光[20]。因此，本實驗先通過PI染色實驗研究BH對細胞膜通透性的影響。結果表明，30 min時MIC BH處理的菌絲體呈現(xiàn)明顯的紅色熒光，其熒光強度為初始值的（1.24±0.02）倍，顯著高于對照組（P＜0.05），且熒光強度隨處理時間的延長而增大，而對照組未觀察到紅色熒光（圖5A、B）。進一步測定胞外電導率及可溶性蛋白質量濃度對細胞膜通透性的影響進行驗證。30 min時，0.5 MIC BH和MIC BH處理組的胞外電導率相對初始增量和可溶性蛋白質量濃度均顯著高于對照組（P＜0.05），且隨處理時間延長，胞外電導率相對初始增量和可溶性蛋白質量濃度持續(xù)增加（圖5C、D）。說明0.5 MIC BH處理30 min時，指狀青霉菌絲體的細胞膜已受損，導致內(nèi)容物泄漏。

圖5 BH對指狀青霉菌絲體細胞膜通透性的影響Fig.5 Effect of BH on membrane permeability of P.digitatum mycelia

2.6 BH對指狀青霉菌絲體胞內(nèi)ROS和MDA水平的影響

許多真菌抑制劑的作用機制與脂質過氧化密切相關，脂質過氧化使細胞質膜功能發(fā)生改變，導致細胞死亡。MDA作為膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，其含量是衡量膜脂過氧化水平的重要指標[20]。為研究BH對指狀青霉菌絲體氧化應激反應的影響，測定了胞內(nèi)ROS和MDA的水平，結果如圖6所示。30 min時，BH處理組的胞內(nèi)ROS和MDA水平與對照組無顯著性差異；而60 min時，MIC BH處理組ROS水平為1.040±0.027，胞內(nèi)MDA濃度增加至（0.171±0.007）μmol/L，均顯著高于對照組（P＜0.05）。說明60 min時，MIC BH處理組的指狀青霉菌絲體胞內(nèi)ROS積累并發(fā)生膜脂過氧化反應。

圖6 BH對指狀青霉ROS（A）及MDA（B）水平的影響Fig.6 Effect of BH on the ROS (A) and malondialdehyde (B) contents of P.digitatum mycelia

2.7 BH對指狀青霉線粒體膜電位及能量代謝的影響

線粒體是細胞能量代謝的主要場所。ROS介導的氧化應激可直接引起線粒體損傷，而MMP在維持線粒體功能中起重要作用，因此MMP在多種細胞凋亡刺激下呈下降趨勢[32-33]。由圖7A可知，30 min時，BH對指狀青霉菌絲體MMP沒有造成顯著影響，但處理60 min時，0.5 MIC和MIC處理組的菌絲體MMP分別為0.388±0.017、0.262±0.010，均顯著低于對照組（0.435±0.013，P＜0.05）。說明此時線粒體功能已受損。此外，BH處理對指狀青霉菌絲體的能量代謝造成顯著影響。處理30 min時，菌絲體ATP含量迅速減少，0.5 MIC和MIC BH處理組的ATP含量分別為（72.91±2.85）μg/g和（76.16±0.87）μg/g，均顯著低于對照組（（116.52±5.18）μg/g，P＜0.05）；處理60 min時，ATP含量進一步下降（圖7B）。胞內(nèi)能荷水平也呈現(xiàn)類似變化趨勢（圖7C）。結果暗示BH處理30 min時，指狀青霉菌絲體能量代謝已受到影響；60 min時，線粒體功能受損，能量代謝進一步失衡。

圖7 鹽酸小檗堿對指狀青霉MMP及能量代謝的影響Fig.7 Effect of BH on the mitochondrial membrane potential and energy metabolism of P.digitatum

3 討 論

生物堿是植物次生代謝物中含量最高的一類，因其具有高效、低毒、選擇性高、對有益生物安全及病原物不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，生物堿農(nóng)藥的開發(fā)對農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[34]。BH作為一種具有廣譜抑菌性的生物堿，對玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）、蘋果斑點落葉病菌（A.alternata）、桃褐腐病菌（M.fructicola）等多種植物病原真菌的抑菌活性已有初步報道[16-17,35]，但BH對植物病害的防控效果鮮有研究。在本實驗中，BH抑制指狀青霉生長的MIC和MFC分別為0.16、0.32 g/L（表1），處理15 h后，0.5 MIC處理組和MIC BH處理組的孢子萌發(fā)率分別僅為（12.55±0.71）%和（4.40±1.05）%（圖1），說明離體條件下，BH對指狀青霉具有較強的抑制作用。進一步研究了活體條件下BH對柑橘果實綠霉病的防控效果，結果顯示BH處理能降低發(fā)病果實的病斑直徑，有效延緩發(fā)病進程，且防控效果呈現(xiàn)劑量依賴型（表2）。BH的離體實驗效果優(yōu)于活體實驗，此現(xiàn)象與安托芬在離體和活體條件下對指狀青霉的抑制效果[20]相似，可能與人工接種孢子濃度較高以及果實傷口揮發(fā)物誘導病原菌孢子萌發(fā)有關[36]。此外，果實的酸度、硬度、成熟度等因素均對柑橘果實的發(fā)病進程有一定影響[37]。

掃描電子顯微鏡結果顯示，經(jīng)BH處理的菌絲體干癟褶皺（圖3），說明BH可改變指狀青霉菌絲體的表面形態(tài)。而真菌細胞壁作為小分子物質進出細胞的第一道屏障，對維持細胞形態(tài)、抵抗外界壓力及真菌的生長和定植等生命活動有重要意義[38-39]。真菌細胞膜具有維持細胞秩序和完整性的作用，細胞膜的破裂可使細胞內(nèi)容物外泄并引起真菌細胞組織的破裂[32]。本實驗中，BH處理后指狀青霉菌絲體的細胞壁完整性和細胞膜通透性均受損，引起胞內(nèi)物質的外泄。結果與高磊[40]報道的小檗堿顯著破壞煙曲霉（Aspergillus fumigatus）的細胞壁和細胞膜結構這一結論相似。值得注意的是，30 min時，0.5 MIC BH處理組的細胞膜通透性已受損，而該質量濃度下細胞壁完整性受損發(fā)生在30 min之后（圖4、5），說明細胞膜是BH最初的作用位點。

研究表明，真菌細胞膜上存在多種離子通道，對細胞內(nèi)外的物質和能量交換具有重要意義，而抑菌物質誘導真菌細胞膜通透性的改變可導致ATP的泄漏[41-42]。本實驗中，BH處理30 min時，指狀青霉菌絲體胞內(nèi)ATP含量及能荷水平均急劇下降（圖7B、C）。因此推斷30 min時指狀青霉能量代謝失衡與細胞膜通透性的改變有關，與胞外糖脂對酵母的抑菌機制相似[41]。膜脂質過氧化和ROS反應在真菌體內(nèi)的動態(tài)平衡維持著細胞正常的新陳代謝，這種平衡的打破即造成細胞損傷。這種氧化性損傷不僅僅發(fā)生在質膜，還是引起線粒體損傷的主要途徑之一[7,43]。本實驗中，60 min時，BH處理組的菌絲體中ROS積累并發(fā)生膜脂過氧化反應（圖6），MMP也顯著降低（圖7A），表明ROS的積累造成了線粒體功能的損傷，該結果與前期報道的生物堿安托芬對指狀青霉的抑菌機理[43]相似。而線粒體功能受損加劇了能量代謝的失衡，表現(xiàn)為胞內(nèi)ATP含量和能荷水平的進一步降低。

綜上，BH能有效抑制指狀青霉的孢子萌發(fā)和菌絲生長，并延緩柑橘果實綠霉病的發(fā)病進程。BH損傷病原菌的細胞通透性，導致胞內(nèi)物質泄漏和能量失衡。隨后，胞內(nèi)ROS積累造成膜脂過氧化和線粒體損傷，進一步影響能量代謝，導致細胞凋亡。