姜黃素介導(dǎo)的光動(dòng)力技術(shù)對(duì)副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的殺滅效果

檀利軍，胡鈺梅，陳博文，陳 璐，胡 趙，王敬敬,3,*，劉海泉,4,5，趙 勇,4,5,*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330031；3.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528225；4.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；5.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（上海），上海 201306）

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種嗜鹽型革蘭氏陰性致病菌，廣泛存在于各類海產(chǎn)品中[1]。這種細(xì)菌被認(rèn)為是食用生的或未煮熟的海產(chǎn)品引起人類急性腸胃炎或腹瀉的主要原因[2]。腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）是嗜冷型革蘭氏陰性腐敗菌，是海產(chǎn)品等高蛋白食品中常見的優(yōu)勢(shì)腐敗菌[3]。近年來(lái)由于副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的污染導(dǎo)致了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題和巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]，因此，對(duì)副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的研究日益引起社會(huì)關(guān)注，開發(fā)抑制或殺滅這些有害菌的策略顯得尤為重要。

為了控制食品加工環(huán)境中有害微生物的污染，近年來(lái)研究出很多的新型抗菌策略（如酶制劑、紫外線滅菌、高壓脈沖電場(chǎng)等）[6]。這些技術(shù)方法雖然與傳統(tǒng)的抗菌策略（如消毒劑、抗生素等）相比更加綠色環(huán)保，但自身也存在很多缺點(diǎn)，包括成本高、可能改變食品原有品質(zhì)、殺菌效果不穩(wěn)定以及存在一定的安全問(wèn)題等[7]。因此，有必要開發(fā)新型抗菌技術(shù)和有效的根除方法來(lái)控制有害微生物的污染。光動(dòng)力技術(shù)（photodynamic technology，PDT）又稱光輻射療法，是一種在臨床醫(yī)學(xué)中廣泛采用的殺滅致病微生物的新方法[8-9]。這種新型的非熱殺菌技術(shù)在光敏劑和有氧的條件下通過(guò)適當(dāng)波長(zhǎng)的光照射后即可產(chǎn)生活性氧物質(zhì)（reactive oxygen species，ROS）。ROS能夠破壞細(xì)胞和微生物的大分子結(jié)構(gòu)進(jìn)而導(dǎo)致其受損或死亡[10]。然而該技術(shù)在食品工業(yè)中對(duì)有害微生物方面的應(yīng)用卻鮮有報(bào)道。

姜黃素是目前世界上使用最為廣泛的天然色素之一，其原料來(lái)源廣、成本低，且無(wú)毒無(wú)污染[11]。已有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素在藍(lán)光下（波長(zhǎng)范圍420～480 nm）具有光敏活性，對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌[12]、假單胞菌[13]、金黃色葡萄球菌[14]等具有很強(qiáng)的殺滅效果。然而，姜黃素介導(dǎo)的PDT對(duì)副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的抗菌作用及其機(jī)制尚未明確，此外，對(duì)其生物被膜的清除效果鮮見報(bào)道。因此，本研究將系統(tǒng)地探究姜黃素介導(dǎo)的PDT對(duì)副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌及其生物被膜的抗菌效果，以期為食品工業(yè)設(shè)計(jì)新型高效的非熱光動(dòng)力殺菌技術(shù)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

副溶血性弧菌ATCC 17802來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；副溶血性弧菌E36、腐敗希瓦氏菌E05、E08均由本實(shí)驗(yàn)室從對(duì)蝦中分離獲得。

姜黃素（食品級(jí)，純度高于99%） 上海生工生物工程股份有限公司；硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium，TCBS）、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（tryptone soy broth，TSB）、鐵瓊脂培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；ROS活性氧熒光探針（2’,7’-二氯二氫熒光素-雙乙酸酯（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）） 北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；9,10-蒽二基-雙（亞甲基）二甲酸（9,10-anthracenediylbis（methylene） dimalonic acid，ABDA） 美國(guó)Sigma公司；3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化銨（3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT）（5 mg/mL）、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）、體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛/體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛掃描電子顯微鏡固定液、SYBR Green I核酸染料 上海生工生物工程股份有限公司；其他化學(xué)分析試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LED藍(lán)光光源（波長(zhǎng)455～460 nm，燈管長(zhǎng)度30 cm，每秒輻照劑量3.80 mJ/cm2） 飛利浦照明電子（上海）有限公司；Bioscreen C MBR-全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀 芬蘭Oy Growth Curves Ab公司；5417R全自動(dòng)臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；TCS SP8激光共聚焦掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM） 德國(guó)徠卡公司；SNE-4500M場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本電子株式會(huì)社；SynergyHTX多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司；PTR-60分子雜交儀 英國(guó)Grant儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

將兩株副溶血性弧菌（-80 ℃下保藏在體積分?jǐn)?shù)50%的甘油管中）分別劃線于TCBS平板上，37 ℃下培養(yǎng)12 h后挑取綠色單菌落接種至TSB培養(yǎng)基（含3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）NaCl）中，置于恒溫（37 ℃）培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)（200 r/min），隨后將兩株菌的菌液混合，在4 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min；將兩株腐敗希瓦氏菌（-80 ℃下保藏在體積分?jǐn)?shù)50%的甘油管中）分別劃線接種于鐵瓊脂平板上，25 ℃下培養(yǎng)24 h后挑取黑色單菌落到TSB培養(yǎng)基中，置于恒溫（30 ℃）培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)（200 r/min），隨后將兩株菌的菌液混合并用相同條件離心10 min。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85% NaCl溶液分別將上述離心菌體稀釋至濃度約為8（lg（CFU/mL））后備用。

1.3.2 光敏劑的配制

稱取0.036 84 g姜黃素粉末溶解于100 mL的無(wú)水乙醇中，混勻后即可得到濃度為1 000 μmol/L的姜黃素儲(chǔ)備液，置于4 ℃避光保存。

1.3.3 PDT對(duì)副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的滅活

將100 μL菌液和不同濃度的姜黃素（副溶血性弧菌對(duì)應(yīng)姜黃素濃度：0.5、0.7、1.0、2.0、3.0 μmol/L；腐敗希瓦氏菌對(duì)應(yīng)姜黃素濃度：1、3、5、7、10 μmol/L。光照時(shí)間均為8 min）以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85% NaCl溶液加入到離心管中使體系總體積為1 mL。在分子雜交儀中100 r/min孵育20 min后加入24 孔板中光照不同的時(shí)間（副溶血性弧菌對(duì)應(yīng)光照時(shí)間：2、5、8、10、20 min，姜黃素濃度為1 μmol/L；腐敗希瓦氏菌對(duì)應(yīng)光照時(shí)間：2、5、8、10、15 min，姜黃素濃度為5 μmol/L）。選擇未經(jīng)光照和姜黃素處理（L-C-）的樣品作為陰性對(duì)照組，僅光照（L+C-）或僅姜黃素（L-C+）處理的樣品作為空白對(duì)照組。PDT處理結(jié)束后，將副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的菌液梯度稀釋后分別涂布于TCBS平板（12 h、37 ℃）和鐵瓊脂平板（24 h、25 ℃），培養(yǎng)到指定時(shí)間后計(jì)數(shù)[12]。

1.3.4 ROS和單線態(tài)氧的監(jiān)測(cè)

將100 μL菌液加入0.9 mL PBS中使細(xì)菌懸浮，加入不同濃度的姜黃素（副溶血性弧菌對(duì)應(yīng)姜黃素濃度：0.5、0.7、1.0 μmol/L；腐敗希瓦氏菌對(duì)應(yīng)姜黃素濃度：1、3、5 μmol/L）混合后再分別加入10 μmol/L DCFHDA試劑（監(jiān)測(cè)ROS的產(chǎn)生情況）或100 μmol/L ABDA試劑（監(jiān)測(cè)單線態(tài)氧的產(chǎn)生情況）。孵育結(jié)束后，光照不同時(shí)間（副溶血性弧菌對(duì)應(yīng)光照時(shí)間：8、10、20 min；腐敗希瓦氏菌對(duì)應(yīng)光照時(shí)間：8、10、15 min），分別用多功能酶標(biāo)儀測(cè)其發(fā)射波長(zhǎng)529 nm處最大熒光發(fā)射強(qiáng)度（ROS產(chǎn)生情況）與399 nm波長(zhǎng)處的光密度值（單線態(tài)氧產(chǎn)生情況）。以未經(jīng)光照和姜黃素處理為陰性對(duì)照組（L-C-）。最終單線態(tài)氧產(chǎn)生量以O(shè)D399nm（陰性對(duì)照組）-OD399nm（實(shí)驗(yàn)組）+OD399nm（姜黃素）表示[15]。

1.3.5 細(xì)菌再生長(zhǎng)能力的評(píng)估

將副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的菌液分別和不同濃度的姜黃素在體系中混合均勻，按1.3.3節(jié)條件孵育后光照不同的時(shí)間。具體處理?xiàng)l件的組合為副溶血性弧菌：0.5 μmol/L+8 min、1.0 μmol/L+8 min、1.0 μmol/L+20 min；腐敗希瓦氏菌：1 μmol/L+8 min、5 μmol/L+8 min、5 μmol/L+15 min。未經(jīng)光照和姜黃素處理為陰性對(duì)照組（L-C-）。隨后取每組樣品20 μL和180 μL無(wú)菌新鮮TSB（副溶血性弧菌組需要額外添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)3% NaCl）加入到100 微孔板中。生長(zhǎng)曲線分析儀設(shè)置參數(shù)為培養(yǎng)溫度25 ℃；每隔2 h讀取OD600nm一次；總運(yùn)行時(shí)長(zhǎng)為48 h，測(cè)定PDT處理后副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的生長(zhǎng)曲線[16]。

1.3.6 SEM觀察細(xì)菌表面形態(tài)變化

不同條件的PDT處理結(jié)束后，收集菌液到離心管中10 000 r/min離心5 min。棄除上清液后加入1 mL SEM固定液，4 ℃下靜置過(guò)夜。用體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、80%、90%、100%和100%的乙醇依次脫水。將樣品滴加在無(wú)菌玻璃片上，干燥后進(jìn)行鍍金處理，每個(gè)樣品隨機(jī)挑選3 個(gè)不同視野在SEM（5.0 kV、5 000 倍）下進(jìn)行觀察[17]。

1.3.7 結(jié)晶紫法定量生物被膜生物量

將10 μL副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌分別與990 μL的無(wú)菌新鮮TSB培養(yǎng)基（副溶血性弧菌額外添加3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）NaCl）加入到24 孔板中，隨后將孔板放入25 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)6、12、18、24、36、48 h。培養(yǎng)結(jié)束后移除浮游菌，并用PBS清洗3 次，放入55 ℃烘箱干燥后每孔加入1 mL體積分?jǐn)?shù)0.1%結(jié)晶紫溶液室溫靜置30 min。用PBS清洗3 次以除去多余的結(jié)晶紫，每孔加入1 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液，室溫下靜置30 min后測(cè)其在600 nm波長(zhǎng)處的光密度值[18]，以O(shè)D600nm表示生物被膜總生物量。

副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌生物被膜分別培養(yǎng)24 h和18 h后，取出24 孔板并用PBS清洗3 次移除浮游菌。加入不同濃度的姜黃素并光照不同的時(shí)間（具體處理?xiàng)l件組合見2.3節(jié)圖5）。處理結(jié)束后，用PBS清洗并放入烘箱干燥，每孔加入1 mL結(jié)晶紫溶液后室溫靜置30 min。用PBS去除多余的結(jié)晶紫后，每孔加入1 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液，室溫下靜置30 min后測(cè)其在600 nm波長(zhǎng)處的光密度值[18]，以O(shè)D600nm表示生物被膜總生物量。

1.3.8 MTT法檢測(cè)生物被膜細(xì)胞活力

副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌生物被膜經(jīng)過(guò)PDT處理后，每孔加入1 mL新鮮TSB培養(yǎng)基（副溶血性弧菌額外添加3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）NaCl）和100 μL MTT試劑，置于25 ℃培養(yǎng)箱中靜置孵育2 h以上。用PBS清洗以移除浮游菌后每孔加入1 mL二甲基亞砜，室溫靜置30 min后檢測(cè)在570 nm波長(zhǎng)處的光密度值[19]，以O(shè)D570nm表示細(xì)胞活力。

1.3.9 CLSM觀測(cè)生物被膜結(jié)構(gòu)變化

副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌生物被膜經(jīng)過(guò)PDT處理后，每孔加入1 mL SEM固定液，4 ℃下固定30 min，用PBS洗3 次以去除多余的固定液。隨后每孔加入200 μL核酸染料，室溫避光染色30 min。用PBS洗3 次以去除多余的染料，干燥后置于CLSM（200 倍）下隨機(jī)挑選3 個(gè)不同的視野觀察并拍照。通過(guò)ISA-2生物被膜結(jié)構(gòu)參數(shù)分析軟件分析導(dǎo)出圖像的生物體積、孔隙度、同質(zhì)性、質(zhì)構(gòu)熵以及粗糙度[20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每組樣品設(shè)置3 個(gè)平行，并進(jìn)行3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)后取平均值。通過(guò)Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；通過(guò)SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示具有顯著性差異；通過(guò)Graphpad Prism 8.4.3和Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PDT分別對(duì)副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的殺菌效果

姜黃素濃度對(duì)PDT處理副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的影響分別如圖1A、B所示。副溶血性弧菌陰性對(duì)照組（L-C-）菌落總數(shù)為7.51（lg（CFU/mL）），僅光照（8 min）或僅加姜黃素（3.0 μmol/L）處理時(shí)，菌落總數(shù)并無(wú)顯著變化（圖1A）。保持光照時(shí)間為8 min，當(dāng)姜黃素濃度為0.5 μmol/L時(shí)，菌落總數(shù)顯著下降至6.22（lg（CFU/mL））（P＜0.05）。當(dāng)姜黃素濃度提高到1.0 μmol/L時(shí)，菌落總數(shù)進(jìn)一步下降至4.22（lg（CFU/mL））。此外，添加濃度為3.0 μmol/L的姜黃素并光照8 min時(shí)，在平板上不能檢測(cè)到任何菌落。同樣，PDT對(duì)腐敗希瓦氏菌有類似的殺滅作用（圖1B），腐敗希瓦氏菌所有對(duì)照組之間的菌落總數(shù)也沒(méi)有顯著差異；當(dāng)姜黃素濃度增加到5 μmol/L時(shí)，菌落總數(shù)下降至3.60（lg（CFU/mL））（P＜0.05）；進(jìn)一步提升姜黃素濃度到10 μmol/L時(shí)，在平板上無(wú)法檢測(cè)到菌落。

光照時(shí)間對(duì)PDT處理副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的影響分別如圖1C、D所示。與陰性對(duì)照組相比，僅光照或者僅加姜黃素處理，副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的菌落總數(shù)均無(wú)顯著減少。當(dāng)加入1 μmol/L姜黃素并光照2 min后，副溶血性弧菌的菌落總數(shù)下降至6.23（lg（CFU/mL））（P＜0.05）；繼續(xù)延長(zhǎng)光照時(shí)間至8 min后，菌落總數(shù)下降至4.03（lg（CFU/mL））；當(dāng)光照時(shí)間達(dá)到20 min時(shí)，在平板上沒(méi)有檢測(cè)到菌落（圖1C）。在處理腐敗希瓦氏菌中也發(fā)現(xiàn)類似的失活趨勢(shì)。當(dāng)姜黃素的濃度為5 μmol/L、光照時(shí)間為8 min時(shí)，菌落總數(shù)顯著降低至3.34（lg（CFU/mL））（P＜0.05）；當(dāng)光照時(shí)間延長(zhǎng)至15 min時(shí)，在平板上已經(jīng)不可檢測(cè)到菌落（圖1D）。綜上，PDT對(duì)副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的殺菌效果均表現(xiàn)出強(qiáng)烈的光敏劑濃度和光照時(shí)間的依賴性。

圖1 姜黃素介導(dǎo)的PDT在不同處理?xiàng)l件下對(duì)副溶血性弧菌（A、C）與腐敗希瓦氏菌（B、D）的殺菌效果Fig.1 Inactivation effects of curcumin-mediated PDT on V.parahaemolyticus (A, C) and S.putrefaciens (B, D) under different treatment conditions

為了進(jìn)一步驗(yàn)證PDT對(duì)副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的抗菌效果，對(duì)經(jīng)過(guò)PDT處理后副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的再生能力進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果如圖2所示。在陰性對(duì)照組（L-C-）中，副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌兩者都在經(jīng)歷短暫的遲緩期（2 h）后迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)期并很快達(dá)到穩(wěn)定期。然而，隨著姜黃素濃度的增加和光照時(shí)間的延長(zhǎng)，副溶血性弧菌的遲緩期明顯延長(zhǎng)。當(dāng)姜黃素濃度為0.5 μmol/L、光照時(shí)間為8 min時(shí)，副溶血性弧菌經(jīng)歷了4 h的遲緩期才開始進(jìn)入對(duì)數(shù)期。當(dāng)姜黃素濃度為1 μmol/L、光照時(shí)間為20 min時(shí)，副溶血性弧菌的遲緩期達(dá)到了8 h；且到達(dá)穩(wěn)定期后的最大OD值（OD600nm≈0.4）只有陰性對(duì)照組（OD600nm≈0.8）的一半。此外，腐敗希瓦氏菌也得到了類似的結(jié)果。值得注意的是，當(dāng)姜黃素濃度為5 μmol/L、光照時(shí)間為15 min時(shí)，腐敗希瓦氏菌被徹底殺滅并停止生長(zhǎng)（圖2B）。這進(jìn)一步證實(shí)了PDT對(duì)副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌良好的滅活效果。

圖2 姜黃素介導(dǎo)的PDT處理對(duì)副溶血性弧菌（A）與腐敗希瓦氏菌（B）再生能力的影響Fig.2 Regrowth evaluation of V.parahaemolyticus (A) and S.putrefaciens (B) treated by curcumin-mediated PDT

為了更加深入探究PDT對(duì)副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的作用機(jī)理，通過(guò)SEM對(duì)細(xì)菌的外部形態(tài)進(jìn)行了觀察。陰性對(duì)照組（L-C-）中的副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌形態(tài)飽滿、輪廓清晰（圖3A1、B1）。經(jīng)PDT處理后（副溶血性弧菌：0.5 μmol/L+8 min；腐敗希瓦氏菌：1 μmol/L+8 min），部分細(xì)菌開始發(fā)生形變，細(xì)胞壁破損，細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)開始出現(xiàn)坍塌（圖3A2、B2）。進(jìn)一步提高PDT的處理強(qiáng)度后（副溶血性弧菌：1 μmol/L+20 min；腐敗希瓦氏菌：5 μmol/L+15 min），幾乎所有的細(xì)菌表面都發(fā)生了嚴(yán)重的形變，由于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)容物流失嚴(yán)重導(dǎo)致整個(gè)細(xì)菌趨向于扁平態(tài)（圖3A3、B3）。綜上，姜黃素介導(dǎo)的PDT殺滅副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的根本原因是其能夠使細(xì)菌細(xì)胞壁破損進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌裂解死亡。

圖3 姜黃素介導(dǎo)的PDT處理對(duì)副溶血性弧菌（A）與腐敗希瓦氏菌（B）細(xì)菌形態(tài)的影響Fig.3 Effect of curcumin-mediated PDT on cell morphology of V.parahaemolyticus (A) and S.putrefaciens (B)

Deng Xin等[21]研究了亞甲基藍(lán)介導(dǎo)的PDT對(duì)副溶血性弧菌的抗菌效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，亞甲基藍(lán)在激光照射下，副溶血性弧菌菌落總數(shù)最大能降低約5（lg（CFU/mL））。最近，Gong Chen等[13]研究了姜黃素介導(dǎo)的PDT對(duì)鱘魚特定腐敗菌（假單胞菌）的殺菌效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在姜黃素30 μmol/L、LED燈功率15 W、照射時(shí)間90 s的條件下達(dá)到了最強(qiáng)的殺菌效果，假單胞菌的菌落總數(shù)大約降低了3（lg（CFU/mL））。本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素介導(dǎo)的PDT在LED藍(lán)光光源下對(duì)副溶血性弧菌（致病菌）與腐敗希瓦氏菌（腐敗菌）都有著更加顯著的殺菌效果（姜黃素濃度分別為3.0 μmol/L與10 μmol/L、光照時(shí)間為8 min時(shí)，能降低副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的菌落總數(shù)7（lg（CFU/mL））以上），并且這是本課題組首次應(yīng)用PDT殺滅腐敗希瓦氏菌。另外本研究還發(fā)現(xiàn)，腐敗希瓦氏菌比副溶血性弧菌對(duì)姜黃素介導(dǎo)的PDT敏感性更低，這可能與菌株的異質(zhì)性有關(guān)[22]。更重要的是，與有毒的亞甲基藍(lán)相比，姜黃素是一種從植物中分離出來(lái)的綠色、無(wú)毒的天然活性成分，具有多種藥用價(jià)值，在許多國(guó)家被用作食品添加劑[14]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)PDT是最終通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)（細(xì)胞壁）以達(dá)到殺滅副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的效果，主要原因是副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌兩者均為革蘭氏陰性菌，它們的細(xì)胞壁由相對(duì)不透水的外膜組成，外膜中含有豐富的脂多糖（疏水性），內(nèi)膜含有磷脂（疏水性）[23]，而姜黃素作為一種脂溶性化合物更容易吸附在細(xì)胞壁上進(jìn)而發(fā)揮功效[24]。另外，PDT的殺菌效率還與光敏劑的吸收光譜有關(guān)[24]。本研究挑選的藍(lán)色LED光源的光譜范圍（455～460 nm）正是姜黃素的最大吸收范圍，從而讓姜黃素發(fā)揮出了最大的抗菌功效。因此，姜黃素介導(dǎo)的藍(lán)色LED光動(dòng)力技術(shù)能夠破壞副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致其死亡?？傊?，姜黃素介導(dǎo)的PDT有望成為食品工業(yè)中有效清除致病菌與腐敗菌的一種新途徑。

2.2 PDT對(duì)副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的殺菌機(jī)制

當(dāng)特定波長(zhǎng)的光照射到微生物表面上時(shí)，一部分會(huì)被光敏劑吸收，光敏劑被激發(fā)到更高的能量狀態(tài)，在其返回基態(tài)的過(guò)程中，與鄰近的細(xì)胞質(zhì)分子發(fā)生碰撞，導(dǎo)致能量轉(zhuǎn)移，隨后產(chǎn)生高能量、高反應(yīng)性分子ROS[24]。ROS通過(guò)氧化微生物細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸導(dǎo)致細(xì)胞調(diào)亡。這些ROS包括單線態(tài)氧、羥自由基、超氧陰離子自由基和過(guò)氧化氫[24]。在產(chǎn)生的ROS中，單線態(tài)氧是最具破壞性的。為了進(jìn)一步探究PDT滅活副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌過(guò)程中所涉及的作用機(jī)制，本研究采用DCFH-DA法與ABDA試劑法監(jiān)測(cè)了PDT過(guò)程中ROS和單線態(tài)氧的產(chǎn)生水平，結(jié)果如圖4所示。在陰性對(duì)照組（L-C-）中均檢測(cè)到了微弱的ROS熒光信號(hào)（DCF熒光發(fā)射強(qiáng)度與ROS的產(chǎn)生量成正比）（圖4A1、B1），這是由于細(xì)菌代謝過(guò)程中產(chǎn)生內(nèi)源ROS的影響。提高姜黃素的濃度（副溶血性弧菌：0.5、0.7、1.0 μmol/L；腐敗希瓦氏菌：1、3、5 μmol/L）與延長(zhǎng)光照時(shí)間（副溶血性弧菌：8、10、20 min；腐敗希瓦氏菌：8、10、15 min）時(shí)，體系中ROS的水平均顯著提升（P＜0.05）。單線態(tài)氧的產(chǎn)生水平也具有類似的變化趨勢(shì)。值得注意的是，當(dāng)保持光敏劑濃度不變，延長(zhǎng)光照時(shí)間時(shí)，單線態(tài)氧的水平不再顯著增加（圖4A2、B2）。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，由于單線態(tài)氧不穩(wěn)定，容易分解或者轉(zhuǎn)換為氧氣[10,25]。這些結(jié)果間接表明光敏劑濃度與光照時(shí)間影響PDT殺菌效率的根本原因是ROS與單線態(tài)氧產(chǎn)生水平上的差異。因此，可以推測(cè)出姜黃素介導(dǎo)的PDT對(duì)副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的抗菌機(jī)制，即在PDT處理過(guò)程中，姜黃素分子吸附在疏水性的細(xì)胞壁上，在藍(lán)光的照射下產(chǎn)生了大量的ROS，具有強(qiáng)氧化作用的ROS導(dǎo)致細(xì)菌發(fā)生損傷，隨后細(xì)胞壁疏松出現(xiàn)破洞，細(xì)菌隨之裂解死亡。

圖4 姜黃素介導(dǎo)的PDT在不同處理?xiàng)l件下副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌ROS和單線態(tài)氧的產(chǎn)生Fig.4 Production of ROS and singlet oxygen species in V.parahaemolyticus and S.putrefaciens treated by curcumin-mediated PDT under differentt conditions

2.3 PDT分別對(duì)副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌生物被膜的清除效果

利用結(jié)晶紫染色法監(jiān)測(cè)了副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌生物被膜總生物量隨著時(shí)間變化的動(dòng)態(tài)形成過(guò)程（圖5A）。結(jié)果表明，副溶血性弧菌（OD600nm＝1.81±0.15）與腐敗希瓦氏菌（OD600nm＝1.99±0.17）生物被膜分別在24 h和18 h后到達(dá)成熟期。因此，本研究分別選取該時(shí)刻形成的生物被膜來(lái)進(jìn)行后續(xù)的PDT實(shí)驗(yàn)。

不同濃度姜黃素和不同光照時(shí)間對(duì)副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌生物被膜的總生物量的影響分別如圖5B、C所示。與陰性對(duì)照組（L-C-）相比，單獨(dú)光照（L+C-）或姜黃素（L-C+）處理均不會(huì)引起生物被膜的顯著變化。當(dāng)姜黃素濃度為10 μmol/L、光照時(shí)間為30 min時(shí)，副溶血性弧菌生物被膜總生物量降低了17%；進(jìn)一步提高姜黃素的濃度到30 μmol/L時(shí)，總生物量降低了50%；此外，當(dāng)姜黃素的濃度為30 μmol/L、光照時(shí)間延長(zhǎng)至60 min時(shí)，生物被膜總生物量下降了70%。PDT處理腐敗希瓦氏菌生物被膜也得到了類似的結(jié)果，最大清除率約為62%。同時(shí)，本研究檢測(cè)了在PDT處理過(guò)程中副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌生物被膜細(xì)胞活力的變化。如圖5D、E所示，僅光照（L+C-）或姜黃素（L-C+）處理組與陰性對(duì)照組（L-C-）相比生物被膜細(xì)胞活力并無(wú)顯著性變化。當(dāng)姜黃素濃度為10 μmol/L、光照時(shí)間為30 min時(shí)，副溶血性弧菌生物被膜的細(xì)胞活力（OD570nm）出現(xiàn)大幅下降（P＜0.05），由對(duì)照組的0.523降低至0.285；進(jìn)一步提高姜黃素的濃度到30 μmol/L，細(xì)胞活力下降至0.07；當(dāng)采用姜黃素濃度為30 μmol/L、光照時(shí)間為60 min的組合條件處理時(shí)，OD570nm趨近于零。腐敗希瓦氏菌生物被膜細(xì)胞活力的變化趨勢(shì)與副溶血性弧菌類似。Araújo等[26]通過(guò)熒光光譜法評(píng)估了姜黃素介導(dǎo)的藍(lán)色LED光動(dòng)力技術(shù)對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抗菌功效，結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)PDT處理后，與對(duì)照組相比，菌落總數(shù)降低了3.6（lg（CFU/mL））；此外，通過(guò)熒光光譜圖像發(fā)現(xiàn)生物被膜數(shù)量也明顯減少。Quishida等[27]評(píng)估了姜黃素介導(dǎo)的PDT對(duì)不同生長(zhǎng)階段的念珠菌與鏈球菌生物被膜的潛在作用。通過(guò)結(jié)晶紫法和XTT法表征了PDT處理前后念珠菌與鏈球菌生物被膜的總生物量和細(xì)胞活力的變化。結(jié)果也同樣發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，PDT處理組的總生物量與細(xì)胞活力均出現(xiàn)顯著性降低（P＜0.05）。這些研究發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證明了姜黃素介導(dǎo)PDT處理不但具有高效的殺菌效果，而且還有良好的抗生物被膜特性。

圖5 副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌生物被膜隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)形成過(guò)程（A）及姜黃素介導(dǎo)的PDT處理對(duì)副溶血性弧菌（B、D）與腐敗希瓦氏菌（C、E）生物被膜的清除與細(xì)胞活力的影響Fig.5 Biofilm formation by V.parahaemolyticus and S.putrefaciens as a function of time (A) and effect of curcumin-mediated PDT on biofilm biomass and cell viability of V.parahaemolyticus (B, D) and S.putrefaciens (C, E)

在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)CLSM表征了姜黃素介導(dǎo)的PDT對(duì)副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌生物被膜的清除效果，結(jié)果如圖6所示。陰性對(duì)照組的副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌都呈現(xiàn)出緊湊且密集分布的生物結(jié)構(gòu)（圖6A1、B1）。然而，當(dāng)姜黃素濃度分別為10 μmol/L和20 μmol/L、光照時(shí)間為30 min時(shí)，副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌都呈現(xiàn)出稀疏和不均勻的分散結(jié)構(gòu)（圖6A2、B2）。當(dāng)姜黃素的濃度分別提高到30 μmol/L和50 μmol/L、光照時(shí)間為60 min時(shí)，與對(duì)照組相比，兩種細(xì)菌的生物被膜都變得極其稀疏、松散（圖6A3、A4、B3、B4）。

圖6 姜黃素介導(dǎo)的PDT在不同處理?xiàng)l件下副溶血性弧菌（A）與腐敗希瓦氏菌（B）的CLSM圖像Fig.6 Confocal laser scanning microscope images of V.parahaemolyticus (A)and S.putrefaciens (B) after curcumin-mediated PDT treatment under different conditions

生物被膜的定量圖像分析結(jié)果顯示，在經(jīng)過(guò)姜黃素濃度為30 μmol/L（腐敗希瓦氏菌為50 μmol/L），經(jīng)光照60 min處理后（以下分析均為該條件），副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌生物被膜的生物體積分別顯著下降至3.2×104μm3和9.0×104μm3（表1），與對(duì)照組相比分別大約下降了93%與85%?？紫抖确从沉松锉荒ぶg的致密程度，孔隙度越小，代表生物被膜越致密[28-29]。如表1所示，經(jīng)過(guò)PDT處理后，副溶血性弧菌生物被膜的孔隙度從0.79上升到0.98（P＜0.05），腐敗希瓦氏菌生物被膜的孔隙度從0.74上升到0.98（P＜0.05）。同質(zhì)性通常用于衡量細(xì)胞簇的相似性，同質(zhì)性越高，表明簇結(jié)構(gòu)越均勻。一般來(lái)說(shuō)，同質(zhì)性的大小隨著細(xì)胞簇?cái)?shù)量的減少而增加[28-29]。經(jīng)過(guò)PDT處理的副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌生物被膜的同質(zhì)性均大幅增加（P＜0.05）。因此可以得出結(jié)論，姜黃素介導(dǎo)的PDT能有效根除生物被膜中副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的細(xì)胞。同時(shí)，作為生物被膜圖像尺度隨機(jī)性度量的質(zhì)構(gòu)熵的分析結(jié)果也印證了表1中同質(zhì)性的結(jié)果。PDT處理后副溶血性弧菌的質(zhì)構(gòu)熵由3.50降低至1.73（P＜0.05），腐敗希瓦氏菌的質(zhì)構(gòu)熵由3.53降低至1.74（P＜0.05）。質(zhì)構(gòu)熵越高，生物膜圖像的異質(zhì)性就越大[28]。這意味著質(zhì)構(gòu)熵的降低將有助于異質(zhì)性的降低。粗糙度提供了生物被膜厚度變化的度量，是反映生物被膜表面異質(zhì)性的指標(biāo)[30]。在本研究中，隨著姜黃素濃度的增加和光照時(shí)間的延長(zhǎng)，生物被膜粗糙度顯著增加（P＜0.05），這與同質(zhì)性的變化趨勢(shì)一致?？梢酝茢?，生物被膜粗糙度的增加將極大地促進(jìn)姜黃素附著在生物被膜表面，這可能有助于增強(qiáng)PDT的殺菌能力。綜上，姜黃素介導(dǎo)的藍(lán)色LED光動(dòng)力技術(shù)對(duì)副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌生物被膜的清除具有同樣的高效性。

表1 姜黃素介導(dǎo)的PDT在不同處理?xiàng)l件下副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌生物被膜結(jié)構(gòu)參數(shù)的變化Table 1 Changes in biofilm structure parameters of V.parahaemolyticus and S.putrefaciens after curcumin-mediated PDT treatments

3 結(jié) 論

本研究表明，姜黃素介導(dǎo)的PDT能有效殺滅副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌并清除其成熟的生物被膜。PDT殺菌過(guò)程中ROS和單線態(tài)氧的產(chǎn)生水平與SEM的結(jié)果表明，姜黃素介導(dǎo)的PDT殺菌機(jī)制是通過(guò)產(chǎn)生大量具有強(qiáng)氧化作用的ROS作用于細(xì)菌，并最終導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁破損進(jìn)而裂解死亡。此外，本研究還進(jìn)一步探究了姜黃素介導(dǎo)的PDT的抗生物被膜效果。在宏觀層面上通過(guò)結(jié)晶紫法定量生物被膜，通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力；在微觀層面上通過(guò)CLSM觀察生物被膜并對(duì)其圖像的結(jié)構(gòu)參數(shù)進(jìn)行分析，包括生物體積、孔隙率、同質(zhì)性、質(zhì)構(gòu)熵和粗糙度。結(jié)果表明，姜黃素介導(dǎo)的PDT對(duì)生物被膜同樣具有良好的清除效果。綜上，姜黃素介導(dǎo)的PDT可有效地控制有害微生物及其生物被膜的形成，從而大大降低食品安全風(fēng)險(xiǎn)。