QuEChERS結(jié)合UHPLC-MS同時測定土鱉蟲及其成方制劑中9種真菌毒素含量△

李媛，張楠，張亞鋒，孫曉，張苗苗，謝志民

西安市食品藥品檢驗所，陜西 西安 710054

真菌毒素是真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，屬于中藥微量外源性的有害殘留物。真菌毒素包含曲霉屬（黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A 等）、鐮刀菌屬（玉米赤霉烯酮、T-2毒素、嘔吐毒素和伏馬毒素等）和青霉屬（展青霉素和桔青霉素等）。中藥在采集、貯藏、制備、運輸過程中如保存不當(dāng)極易受潮霉變，部分品種有污染真菌毒素的可能，尤其是種子、果實類中藥、發(fā)酵類中藥、動物藥及含有上述中藥的中成藥[1-3]。動物藥基質(zhì)以蛋白質(zhì)、脂肪、核酸等大分子為主，基質(zhì)營養(yǎng)豐富，容易霉變。動物藥污染的主要途徑應(yīng)該是貯存過程。目前，多數(shù)動物藥并未明確規(guī)定冷藏、防潮等貯藏條件，霉變的樣品在市場上多見[4]。真菌毒素的前處理方法包括提取和凈化2 種，提取方法主要有高速均質(zhì)提取法、振蕩提取法、超聲提取法、高速攪拌提取法等，凈化方法主要有免疫親和柱色譜法、固相萃取柱色譜法和QuEChERS[5-6]。目前，QuEChERS 在食品中應(yīng)用較廣泛，但在中藥真菌毒素的研究方面報道較少，相較于其他方法，其具有操作簡便快捷、價格低廉的特點。本研究初步采用QuEChERS 測定中成藥中的真菌毒素。真菌毒素的檢測方法有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫色譜法、高效液相色譜法和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等[7-9]。QuEChERS 相較于免疫親和柱色譜法除雜效果欠佳，干擾較多，因此，采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的多反應(yīng)監(jiān)測模式，可有效排除雜質(zhì)干擾，而且靈敏度高。

土鱉蟲Eupolyphaga Steleophaga 為鱉蠊科昆蟲地鱉或冀地鱉的雌蟲干燥體，有破血逐瘀、續(xù)筋接骨的功效，用于跌打損傷、筋傷骨折、血瘀經(jīng)閉、產(chǎn)后瘀阻腹痛、癥瘕痞塊[10]。余詩琪等[11]采用固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用法測定了土鱉蟲中12種真菌毒素。孫嵐等[12]采用免疫親和柱凈化-高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法測定了土鱉蟲中的黃曲霉毒素。尚未有文獻(xiàn)報道采用QuEChERS 測定土鱉蟲及其制劑中的黃曲霉毒素。而《中華人民共和國藥典》2020 年版四部“中藥中真菌毒素測定指導(dǎo)原則”項下說明：“處方中含有易污染的藥材以及生粉投料的中成藥品種應(yīng)注意相關(guān)真菌毒素的檢測”，因此，本實驗同時檢測了土鱉蟲及其制劑中的真菌毒素。

本研究通過QuEChERS 凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UHPLC-MS）檢測，建立了土鱉蟲及其成方制劑中黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素B1（AFG2、AFG1、AFB2、AFB1），伏馬毒素B1、伏馬毒素B2（FB1、FB2），赭曲霉毒素A（OTA），玉米赤霉烯酮（ZON），T-2 毒素共9種真菌毒素的檢測方法。

1 材料

1.1 儀器

LC-30 AD 型超高效液相色譜儀、LCMS 8060型三重四極桿質(zhì)譜儀、LabSolutions工作站（日本島津公司）。

1.2 試藥

乙腈（色譜純，F(xiàn)isher 公司）；甲酸（色譜純，上海阿拉丁試劑有限公司）；氯化鈉、無水硫酸鎂（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；N-丙基乙二胺粉（PSA）、石墨化炭黑粉（GCB）、十八烷基硅烷粉（ODS）均購于天津博納艾杰爾公司。AFG2、AFG1、AFB2、AFB1混合對照品溶液（質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1，批 號：ALT060109）購 于Achemtek 公司；FB1、FB2混合對照品溶液（質(zhì)量濃度分別為 59.13、52.15 μg·mL-1，批號：SSFBa005）購于Fermentek 公司；OTA、T-2 毒素、ZON 對照品溶液（質(zhì)量濃度均為100 μg·mL-1，批號分別為1G01BC5、1700710、1G01J30）均購于Pribolab公司，純度均高于99.0%。

土鱉蟲（批號：183J160501）、活血止痛膠囊（批號：19050156）、通心絡(luò)膠囊（批號：A1812016）、腰痛寧膠囊（批號：920200）、復(fù)方三七膠囊（批號：171103）、麝香接骨膠囊（批號：2000101）、傷科接骨片（批號：20191110）均購自陜西省西安市某藥店。土鱉蟲經(jīng)西安市食品藥品檢驗所中藥室謝志民主任藥師鑒定為鱉蠊科昆蟲地鱉Eupolyphaga sinensisWalker的雌蟲干燥體。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

稱取土鱉蟲粉末及其成方制劑約5 g，分別置于50 mL離心管中，加水10 mL，浸潤搖勻，加入10%甲酸乙腈溶液10 mL，渦旋混勻1 min，加入氯化鈉1 g、無水硫酸鎂4 g，渦旋混勻1 min，在4000 r·min-1條件下離心5 min（離心半徑10 cm）。精密量取上清液5 mL，加入無水硫酸鎂900 mg、PSA 100 mg，渦旋混勻1 min，在4000 r·min-1條件下離心5 min（離心半徑10 cm）。精密量取上清液2 mL，減壓濃縮至干，加入50%乙腈1 mL復(fù)溶，用0.22 μm 有機(jī)系微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密吸取對照品溶液適量，用50%乙腈配制成質(zhì)量濃度為20 ng·mL-1的AFG2、AFG1、AFB2、AFB1、OTA、FB1、FB2，40 ng·mL-1的T-2 毒素、ZON混合對照品溶液。

2.3 儀器分析條件

2.3.1超高效液相色譜條件 色譜柱：賽默飛Acclaim RSLC 120 C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.2 μm）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：1 μL；流動相：0.1%甲酸水溶液（A），乙腈-甲醇（B，1∶1），梯度洗脫（0～5 min，40%～50%B；5～6 min，50%～60%B；6～12 min，60%～65%B）；流速：0.3 mL·min-1。

2.3.2質(zhì)譜條件 電離方式：電噴霧離子源（ESI），ZON采用負(fù)離子模式（ESI-）采集，其余均用正離子模式（ESI+）采集；檢測方式：多反應(yīng)檢測（MRM），分析參數(shù)見表1；霧化氣流量：3.0 L·min-1；加熱氣流量：10.0 L·min-1；干燥氣流量：10.0 L·min-1；接口溫度：300 ℃；脫溶劑管溫度：250 ℃；加熱塊溫度：400 ℃。

2.3.3監(jiān)測離子的選擇 采用SCAN 模式以m/z150～400進(jìn)行掃描，9種真菌毒素的離子參數(shù)見表1。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1校準(zhǔn)曲線、線性關(guān)系和檢出限（LOD）、定量限（LOQ）將對照品溶液逐級稀釋，配制系列混合對照品溶液，以各化合物的質(zhì)量濃度和響應(yīng)值峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，混合對照品溶液色譜圖見圖1。結(jié)果表明，9 種真菌毒素在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r≥0.995 6。以信噪比（S/N）為3時，各化合物的定量離子對對應(yīng)的樣品質(zhì)量濃度計算LOD。以S/N 為10 時，各化合物的定量離子對對應(yīng)的樣品濃度計算LOQ。結(jié)果見表2。

表2 土鱉蟲9種真菌毒素的線性方程和LOD、LOQ

圖1 土鱉蟲中9種真菌毒素TIC圖

2.4.2重復(fù)性試驗 精密稱取土鱉蟲樣品5 g，以5 μg·L-1水平添加，按2.1項下步驟進(jìn)行前處理，平行檢測6次，RSD＜10%，重復(fù)性良好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗 分別于0、1、4、8、12、16、20、24 h 精密吸取重復(fù)性考察項同一供試品溶液，以5 μg·L-1水平添加，按2.1項下步驟進(jìn)行前處理，按上述條件測定9 種真菌毒素的峰面積，結(jié)果峰面積的RSD 均≤10%，表明供試品溶液中9 種真菌毒素在24 h內(nèi)均穩(wěn)定。

2.4.4準(zhǔn)確度和精密度試驗 以加樣回收率評價方法的準(zhǔn)確度和精密度，添加低、中、高3 種不同質(zhì)量濃度水平（1、5、10 μg·L-1）的9 種真菌毒素混合對照品溶液，按照2.1項下方法制備，每個質(zhì)量濃度水平進(jìn)行3 份平行測定分析，平均回收率為70.42%～101.28%，RSD＜12%，符合樣品分析檢測要求。結(jié)果見表3。

表3 土鱉蟲9種真菌毒素加樣回收率測定結(jié)果%

2.5 樣品測定

采用所建立的檢測方法，分別對土鱉蟲及活血止痛膠囊、通心絡(luò)膠囊、腰痛寧膠囊、麝香接骨膠囊、復(fù)方三七膠囊和傷科接骨片等成方制劑中的真菌毒素進(jìn)行分析檢測，結(jié)果見表4。

表4 土鱉蟲及其成方制劑中9種真菌毒素含量的測定結(jié)果μg·kg-1

3 討論

3.1 流動相的選擇

分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸水、乙腈-甲酸水流動相系統(tǒng)，并且考察了不同濃度甲酸效果，結(jié)果乙腈-甲醇（1∶1）-0.1%甲酸水溶液系統(tǒng)出峰時間快，峰形好且靈敏度較高。故選擇乙腈-甲醇（1∶1）-0.1%甲酸水溶液為流動相。

3.2 提取溶劑的選擇

目前，常用的毒素提取溶劑包括甲醇、乙酸乙酯、乙腈和水中的1種或者多種不同配比的混合物，本實驗比較了甲醇-水、乙腈-水、10%甲酸-乙腈提取效果，10%甲酸-乙腈得到的真菌毒素離子對峰形較好且較為穩(wěn)定。綜合考慮選擇10%甲酸-乙腈作為提取溶劑。

3.3 凈化方式的選擇

本實驗基于QuEChERS，考察了PSA、GCB、ODS 及無水硫酸鎂4 種吸附填料用量與配比對實驗的影響。以回收率為指標(biāo)，結(jié)果表明，采用PSA-無水硫酸鎂（150∶900）凈化效果最好，且回收率能滿足實驗要求。

4 結(jié)論

本研究建立了土鱉蟲藥材及含土鱉蟲的成方制劑中AFG2、AFG1、AFB2、AFB1、FB1、FB2、OTA、ZON 及T-2 毒素的檢測方法，該法簡便、快速、準(zhǔn)確，能用于土鱉蟲藥材及制劑中真菌毒素的控制。實驗結(jié)果表明，除麝香接骨膠囊外其余品種均檢出不同類型及含量的真菌毒素，經(jīng)查閱相關(guān)國內(nèi)和國際真菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)，國內(nèi)只有《中華人民共和國藥典》2020 年版對藥材有限量規(guī)定，國際標(biāo)準(zhǔn)中大部分均是針對食品的限量標(biāo)準(zhǔn)，而成藥中真菌毒素限量還需要進(jìn)一步深入研究，為含易霉變土鱉蟲藥材及含土鱉蟲的成方制劑中藥的安全使用提供保障。