金蓮花白粉病病原菌鑒定△

李勇，王蓉，丁萬隆

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193

金蓮花Trollius chinensisBge.為毛茛科金蓮花屬多年生草本植物，始載于《本草綱目拾遺》，富含黃酮類、有機(jī)酸類、生物堿類、香豆素類化學(xué)成分，具有明顯的清熱解毒、抗菌消炎等藥理活性[1]，對咽炎、急慢性扁桃體炎、急性中耳炎、急性結(jié)膜炎、急性骨膜炎、上呼吸道感染等有較好臨床療效[2-3]。金蓮花片、金蓮花口服液、金蓮花膠囊、金蓮花顆粒和金蓮花潤喉片被《中華人民共和國藥典》2020年版收錄[4]。目前，中藥材市場上銷售的金蓮花主要依賴人工栽培。河北省承德、張家口地區(qū)作為我國藥用金蓮花的主產(chǎn)區(qū)，集約化、大規(guī)模人工栽培為金蓮花病菌繁衍創(chuàng)造了有利條件，導(dǎo)致以前零星發(fā)生的病害逐漸上升為主要病害，且為害逐年加重，對金蓮花種植業(yè)構(gòu)成較大威脅。

筆者2018 年在河北省圍場縣調(diào)查發(fā)現(xiàn)，3 年生金蓮花植原體病的發(fā)生率達(dá)20%～30%[5]，而白粉病發(fā)病率則高達(dá)60%，對金蓮花植株生長、種子及花的產(chǎn)量和品質(zhì)均造成嚴(yán)重影響，但迄今未見有關(guān)金蓮花白粉病的病原菌記錄及研究報(bào)道。為此，本研究在基地調(diào)研基礎(chǔ)上，結(jié)合病害發(fā)生及為害特征、病菌顯微形態(tài)學(xué)觀察及核糖體脫氧核糖核酸（rDNA）-內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列比對分析，開展了金蓮花白粉病的病原鑒定工作，為深入開展金蓮花白粉病菌的生物學(xué)研究及病害綜合防控提供參考。

1 材料

1.1 樣品

3 年生金蓮花白粉病病株于2018 年8 月采自河北省承德市圍場縣金蓮花人工種植基地（E116°16′2.567″，N40°1′59.998″），由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所丁萬隆研究員鑒定為金蓮花Trollius chinensisBge.。采集的金蓮花白粉病樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，用于后續(xù)開展金蓮花白粉病病原菌鑒定工作。

1.2 儀器

XSP-12CA 型生物顯微鏡（上海光學(xué)儀器廠）；T100?型熱循環(huán)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增儀（Bio-Rad 公司）；DYY-6C 型電泳儀（北京市六一儀器廠）。

1.3 試藥

TaqDNA 聚合酶（日本TaKaRa 公司）；真菌基因組DNA 提取試劑盒（美國Omega 公司）；DNA 凝膠回收試劑盒（北京匯天東方生物技術(shù)有限公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 病原菌形態(tài)學(xué)觀察

取載玻片1張，中央加入無菌水1滴。小心取出金蓮花白粉病樣本，用無菌手術(shù)刀片從金蓮花莖稈或葉片上刮取少量白粉菌，放入無菌水中，輕輕蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察白粉菌閉囊殼、子囊、子囊孢子及附屬絲形態(tài)特征。

2.2 病原菌分子鑒定

用無菌手術(shù)刀片從金蓮花白粉病株的莖稈、葉柄及葉片上小心刮取白粉菌0.1 g，轉(zhuǎn)入事先冷卻的1.5 mL 離心管中，液氮冷卻下充分研磨。白粉菌基因組DNA 用真菌基因組DNA 提取試劑盒提取，具體提取步驟參照試劑盒說明。白粉菌rDNAITS 區(qū)段擴(kuò)增引物ITS1/PM6 用于供試白粉菌基因組DNA 樣本擴(kuò)增[6]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測及DNA 凝膠回收試劑盒純化后，交北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。相關(guān)序列在美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站經(jīng)BlastN 程序與GenBank 已知白粉菌序列進(jìn)行比對，MegaX 軟件鄰接法（neighbor-joining methods，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

3 結(jié)果與分析

3.1 病害癥狀

白粉病每年7 月中旬至9 月上旬在金蓮花產(chǎn)區(qū)流行，成株期金蓮花發(fā)病較重。病害發(fā)生初期，金蓮花莖稈、葉柄及葉片局部出現(xiàn)白色粉狀霉層，莖稈及葉片顏色無明顯變化（圖1）；隨病情發(fā)展，被霉層覆蓋的部位開始出現(xiàn)黑褐色病斑，不規(guī)則形，并逐漸串聯(lián)成片（圖2）；最終，霉層轉(zhuǎn)為淺褐色，上面密布白粉菌閉囊殼（圖3）。白粉病為害輕則造成金蓮花減產(chǎn)，嚴(yán)重者造成金蓮花早衰甚至死亡。

圖1 金蓮花莖稈上的菌絲層

圖2 金蓮花莖稈上的菌絲及閉囊殼

圖3 金蓮花葉片及植株基部為害狀

3.2 病原菌形態(tài)特征

金蓮花白粉菌閉囊殼聚生，暗褐色，近球形，直徑為60～100 μm，壁細(xì)胞不規(guī)則多角形，有凸起；每個(gè)閉囊殼內(nèi)僅有1個(gè)子囊，內(nèi)含8個(gè)淺褐色、卵圓形的子囊孢子（圖4）；附屬絲多根，著生于子囊果一側(cè)，菌絲狀，淺褐色，有隔膜，直徑為4～6 μm（圖5）。

圖4 金蓮花白粉菌閉囊殼

圖5 金蓮花白粉菌閉囊殼及附屬絲結(jié)構(gòu)

3.3 病原菌分子鑒定

經(jīng)ITS 引物擴(kuò)增，得到1 條長485 bp 條帶（GenBank登錄號(hào)：MT956681）。BLAST分析結(jié)果表明，金蓮花白粉菌ITS 擴(kuò)增序列與叉絲單囊殼屬白粉菌Podosphaera fuliginea（MF543026、AB046986）的序列同源性最高，分別為98.88%、98.73%。與P.gunnerae（AB525924、AB525923）序列同源性也較高，分別為98.03%、97.77%。此外，與叉絲單囊殼屬P.fuliginea（MK779060、MT261949 等）、P.plantaginis（KY661120、KY661084、KY660808等）、P.xanthii（MN203658、MG647819等）、P.fusca（MT985559、AY739113、KJ438824等）、P.erigerontiscanadensis（KY661158、KY661089、KY661039 等）、P.macrospora（KY661098、KY661097、KY661099等）的同源性也超過96%。將上述同源菌株基于rDNA-ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，供試金蓮花白粉菌與叉絲單囊殼白粉菌P.fuliginea聚為一支（圖6）。結(jié)合供試白粉菌閉囊殼、子囊等的顯微形態(tài)特征，將其鑒定為叉絲單囊殼P.fuliginea。

圖6 金蓮花白粉菌及其同源菌株基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

4 討論

白粉菌為植物專性寄生菌，屬子囊菌門（Ascomycota）白粉菌目（Erysiphales），新分類系統(tǒng)包括1 科15 屬650 余種[7]。白粉菌家族成員眾多，分類系統(tǒng)復(fù)雜，且在屬、種水平的分類上常有變化。白粉菌寄主范圍、專化性、閉囊殼內(nèi)子囊及子囊孢子數(shù)目，特別是閉囊殼外附屬絲形態(tài)特征一直是白粉菌鑒定的重要依據(jù)[8-9]。隨著分子生物學(xué)及電鏡在系統(tǒng)進(jìn)化研究中的應(yīng)用，白粉菌屬級(jí)分類系統(tǒng)及進(jìn)化理論發(fā)生了重大變化。無性型形態(tài)特征逐漸成為白粉菌屬分類的重要依據(jù)，閉囊殼外附屬絲形態(tài)在白粉菌屬級(jí)分類中不再重要，但仍可作為種級(jí)分類的參考依據(jù)[10-11]。

真菌rDNA-ITS序列在真菌種內(nèi)既有高度的保守性，又存在豐富的種屬間變異。根據(jù)該特性，上述序列不僅能用于真菌純培養(yǎng)的分子鑒定，還可用于病原真菌及環(huán)境真菌群體的動(dòng)態(tài)監(jiān)測[12-13]。利用專用引物擴(kuò)增白粉菌基因組ITS 區(qū)段，結(jié)合核酸序列同源性分析，同樣適用于白粉菌屬病原的分類鑒定研究[14-15]。

近年來，白粉病逐漸上升為金蓮花生產(chǎn)上的主要病害之一，導(dǎo)致罹患白粉病的金蓮花產(chǎn)量和品質(zhì)明顯下降，對金蓮花種植業(yè)威脅較大。由叉絲單囊殼P.fuliginea引起的白粉病在新疆碎花婆婆納[16]、大波斯菊和黃瓜[17]、多肉長壽花[18]等植物上亦有報(bào)道。野生金蓮花上未見白粉病發(fā)生，推測栽培金蓮花白粉病系鄰近寄主或跨區(qū)傳播導(dǎo)致。

田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，金蓮花種植密度過大，局地小氣候相對濕潤，可能是造成金蓮花白粉病嚴(yán)重發(fā)生的主要原因，在金蓮花生產(chǎn)上應(yīng)引起足夠重視。金蓮花以花入藥，病害高發(fā)時(shí)期與花盛開期部分重疊。因此，金蓮花生產(chǎn)上白粉病防治，應(yīng)在加強(qiáng)田間管理前提下，盡可能在病害發(fā)生初期噴施高效、低毒、低殘留化學(xué)殺菌劑[19-20]或微生物制劑加以預(yù)防，且嚴(yán)格控制用藥次數(shù)和使用劑量。