羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘底泥微生物對不同碳源的代謝特征

王 淼，衣萌萌，王瑞寧，盧邁新

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室/廣東省水產(chǎn)動物免疫技術(shù)重點實驗室，廣東 廣州 510380）

【研究意義】池塘養(yǎng)殖是我國水產(chǎn)品供應(yīng)的重要來源。目前傳統(tǒng)的池塘養(yǎng)殖模式仍然是我國主要的淡水養(yǎng)殖模式。2020 年我國淡水池塘養(yǎng)殖面積為262.54 萬hm2，占淡水養(yǎng)殖總面積的52.09%，池塘養(yǎng)殖水產(chǎn)品產(chǎn)量為2 279.76 萬t，占淡水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的73.81%［1］。池塘保持一定厚度的底質(zhì)，可提供養(yǎng)分，穩(wěn)定水質(zhì)，是有益微生物和底棲生物生長繁殖的場所，有利于養(yǎng)殖生物的生長，但淤泥過厚給養(yǎng)殖水體帶來極大危害［2-3］。池塘底泥中的微生物作為分解者［4］，能轉(zhuǎn)化池塘生態(tài)系統(tǒng)中的有機物和無機物，改變和調(diào)節(jié)養(yǎng)殖環(huán)境條件，并促進物質(zhì)循環(huán)和浮游植物生長；但底泥中有害微生物比例的增大可以改變水體和底泥的菌相組成，影響水質(zhì)和底質(zhì)，并導(dǎo)致養(yǎng)殖動物的粘膜系統(tǒng)菌群失衡，增加其感病風(fēng)險。因此，池塘底泥微生物群落對維持池塘生態(tài)系統(tǒng)平衡具有重要意義，對其研究將可進一步揭示底泥微生物的功能。

【前人研究進展】微生物群落對Biolog-ECO板上31 種碳源的特征性利用稱作該微生物群落的代謝指紋圖譜［5］。利用Biolog-ECO 平板技術(shù)對養(yǎng)殖池塘環(huán)境微生物群落代謝功能的研究受到越來越多的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，在整個羅非魚養(yǎng)殖季節(jié)，池塘微生物群落對不同類型碳源的選擇有所不同，但池塘水體中的微生物數(shù)量和碳源代謝水平維持較穩(wěn)定的狀態(tài)［6］。羅非魚池塘底泥中異養(yǎng)細菌的數(shù)量在養(yǎng)殖周期基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，各月份間微生物對4 大類碳源的利用無明顯差異，對不同碳源的利用有差異［7］。Li 等［8］利用Biolog-ECO 平板研究了池塘循環(huán)水系統(tǒng)中微生物群落的代謝功能等。Sala 等［9］通過計算海水中微生物對Biolog-ECO 平板的氮利用指數(shù)來評估環(huán)境菌群對有機氮的處理能力，擴展了Biolog-ECO 平板的用途。

【本研究切入點】底泥的微生物群落的相關(guān)研究包括傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式［10］、Biolog-ECO 平板技術(shù)［11］和高通量測序技術(shù)等［12］，但底泥中只有約0.25%的微生物是可培養(yǎng)的［13］。近年來隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，許多研究通過16S rDNA 高通量測序技術(shù)研究了池塘底泥的微生物群落結(jié)構(gòu)［14-15］，但該方法得到的菌群結(jié)構(gòu)僅反映細菌的相對豐度，而無法了解菌群的功能，而Biolog-ECO 平板技術(shù)可以根據(jù)碳源類別分析底泥菌群功能，通過平均顏色變化率（Average Well Colour Development，AWCD）反映不同功能菌群的絕對豐度，并可以通過顯色反應(yīng)同時檢測可培養(yǎng)微生物和不可培養(yǎng)微生物，是一種較好的底泥微生物群落研究技術(shù)。

【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘為研究對象，分析了養(yǎng)殖底泥中NH4-N、NO2-N、NO3-N 和TN 的動態(tài)變化，利用Biolog-ECO 平板技術(shù)對池塘底泥中微生物的碳源代謝功能進行探討，并進一步分析了羅非魚養(yǎng)殖池塘底泥菌群對含氮碳源、含磷碳源和只含碳的碳源代謝的變化情況，以期為今后深入了解養(yǎng)殖環(huán)境中微生物群落對不同碳源的代謝功能與規(guī)律、構(gòu)建養(yǎng)殖環(huán)境微生態(tài)調(diào)控技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇廣州市花都區(qū)祿仕食品有限公司的4 個羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘，分別編號為池塘1（0.88 hm2）、池塘2（0.57 hm2）、池塘3（0.69 hm2）和池塘4（0.53 hm2），各池塘的養(yǎng)殖密度均為44 776 條/hm2，按照魚體體重的2%～3%投喂，養(yǎng)殖產(chǎn)量為24.6 t/hm2。池塘于2019年2月進行清塘、曬塘處理。

1.2 試驗方法

分別于2019 年4 月17 日、7 月12 日和10月15 日從養(yǎng)殖池塘中采集泥樣。采集池塘四角池底表層10～15 cm 的底泥200 g 左右，用于底泥的理化指標分析及Biolog-ECO 平板檢測。

1.2.1 底泥氮含量測定 將底泥晾干至質(zhì)量恒定后研磨成粉，取10 g，溶于100 mL 1 mol/L KCl，以160 r/min 震蕩處理1 h，取50 mL 懸濁液，以3 000 r/min 離心10 min，取上清液測定。采用納氏試劑光度法測定NH4-N 濃度，采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法測定NO2-N 濃度，采用酚二磺酸光度法測定NO3-N 濃度，采用過硫酸鉀紫外分光光度法測定TN 濃度。

1.2.2 基于Biolog-ECO 技術(shù)的微生物功能多樣性測定 取5 g 泥樣加入到45 mL 生理鹽水中，28 ℃ 160 r/min 震蕩1 h，取上清用生理鹽水稀釋100 倍，取150 μL 稀釋液置于Biolog-ECO 平板中。28 ℃下培養(yǎng)216 h。每隔24 h 使用多功能酶標儀（BioTek，美國）測定平板在590、750 nm 下的光密度值。每孔顏色變化所測定的吸光值反映微生物對碳源的利用情況。AWCD 的計算公式如下：

AWCD=∑［（Ci－R）590－（Ci－R）750］/n式中，Ci為測定的第i個碳源孔的光密度值；R為對照孔的光密度值；n為碳源種類數(shù)，本研究中n值隨所研究碳源種類數(shù)變化，分別為31（所有碳源）、19（只含碳的碳源）、10（含氮碳源）、2（含磷碳源）（表1）［9］。

表1 Biolog-ECO 平板的碳源分類和元素組成Table 1 Categories and element compositions of carbon source on the Biolog-ECO plates

1.3 數(shù)據(jù)分析

對培養(yǎng)120 h 的底泥樣品微生物碳源代謝的AWCD 進行統(tǒng)計分析。采用SigmaPlot for Windows作圖，采用IBM SPSS 18.0 進行單因素方差分析（One-way ANOVA），Duncan 多重比較檢驗組間差異。采用IBM SPSS 18.0 進行Spearman 相關(guān)性分析，分析池塘底泥理化指標與微生物碳源利用率的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘底泥的氮含量分析

羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘底泥中的TN 含量為0.38～1.43 g/kg（干重），NH4-N 含量為8.18～67.73 mg/kg（干重），NO3-N 含量為13.53～27.30 mg/kg（干重），NO2-N 含量為1.57～15.78 mg/kg（干重）。從圖1 可見，7 月和10 月的NH4-N 含量顯著高于4 月，4 月的NO3-N 含量顯著高于7 月和10 月，NO2-N 含量在3 個采樣時間之間無顯著性差異，10 月的TN 含量顯著高于4 月和7 月。

圖1 羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘底泥的氮含量分析Fig.1 Analysis of nitrogen contents in sediment of highdensity tilapia pond

2.2 羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘底泥微生物對不同碳源的利用特征

本研究結(jié)果顯示，羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘底泥微生物的AWCD 值4 月＞10 月＞7 月（圖2），表明4 月的底泥微生物代謝活性較高。從不同類碳源的利用情況（表2）來看，4 月池塘底泥微生物對只含碳的碳源的總利用率顯著高于7 月和10月，對含氮碳源的總利用率顯著高于7 月。從單個碳源的利用情況（表2）來看，底泥微生物無法利用的碳源有2-羥基苯甲酸、衣康酸和α-丁酮酸；4 月池塘底泥微生物對D-半乳糖酸-γ-內(nèi)脂、吐溫40、吐溫80、α-環(huán)式糊精、γ-羥丁酸、苯乙胺的利用率顯著高于7 月和10 月，對4-羥基苯甲酸、L-天門冬酰胺的利用率顯著高于7 月；10 月池塘底泥微生物對L-天門冬酰胺的利用率也顯著高于7 月。

圖2 羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘底泥微生物的AWCD 值Fig.2 AWCD value of microorganisms in sediment of high-density tilapia pond

表2 羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘底泥微生物對不同碳源的利用情況（AWCD 值）Table 2 Utilization of different carbon source by microorganisms in sediment of high-density tilapia pond（AWCD value）

（續(xù)表2）

2.3 羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘底泥理化指標與底泥微生物碳源利用率的相關(guān)分析

Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果（圖3）顯示，羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘底泥中的TN 含量與NH4-N含量呈正相關(guān)（r=0.73、P=0.008），NH4-N 含量與NO3-N、NO2-N 含量呈負相關(guān)（r=-0.88、P=0.000，r=-0.62、P=0.031），NO3-N 含量與NO2-N 含量呈正相關(guān)（r=0.62、P=0.032）。底泥微生物對含氮碳源的利用率、對只含碳的碳源的利用率與底泥中的NO3-N 含量呈正相關(guān)（r=0.68、P=0.014，r=0.63、P=0.027）；底泥微生物對含氮碳源的利用率與對含磷碳源的利用率、對只含碳的碳源的利用率呈正相關(guān)（r=0.69、P=0.013，r=0.79、P=0.002）；底泥微生物對含磷碳源的利用率與對只含碳的碳源的利用率呈正相關(guān)（r=0.71、P=0.010）。

圖3 羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘底泥理化指標與底泥微生物碳源利用率的相關(guān)分析Fig.3 Correlation analysis of sediment physiochemical indexes and utilization rate of carbon sources by microorganisms in sediment of high-density tilapia pond

3 討論

池塘養(yǎng)殖生產(chǎn)中，飼料的投入及魚類的排泄物使底泥中的TN 逐漸積累［16］，有研究表明，池塘輸入氮總量的35%以上富集到底泥中［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，高密度羅非魚養(yǎng)殖池塘底泥中TN 和NH4-N 不斷積累，10 月份時含量最高；而3 個采樣時間點底泥的NO2-N 含量無顯著差異，可能是由于NO2-N 作為硝化過程中的中間產(chǎn)物不能穩(wěn)定存在，氧氣充足時微生物將NO2-N 轉(zhuǎn)化為對水生動物低毒的NO3-N。4 月份底泥中的NO3-N 含量最高，是由于年初的清塘?xí)裉潦桂B(yǎng)殖初期底泥中的含氧量升高，但隨著養(yǎng)殖的進行，養(yǎng)殖中期和末期底泥中的含氧量逐漸下降，推測是由于底泥中的厭氧條件加速了反硝化作用。羅非魚池塘底泥中的NH4-N 是底泥中氮存在的主要形式［18-19］，本研究的相關(guān)分析結(jié)果顯示，羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘底泥中的TN 含量與NH4-N 含量呈正相關(guān)。

AWCD 值可以反映微生物的代謝速率、活性等［5］。研究表明，養(yǎng)殖水體微生物對Biolog-ECO 平板中不同碳源的利用率達到穩(wěn)定的時間不同，AWCD 值趨于穩(wěn)定的時間在96～168 h 之間［20］。本研究的底泥微生物對碳源利用的適應(yīng)期最長達到120 h，因此選擇培養(yǎng)120 h 的底泥微生物的碳源代謝AWCD 值作進一步的統(tǒng)計分析。前人研究將碳源分成氨基酸、碳水化合物、羧酸、多聚物、酚酸和胺類等不同類型［8］，本研究按照碳源的元素組成將其分為只含碳的碳源、含氮碳源、含磷碳源［9］。在利用碳源方面，底泥微生物能較好地利用β-甲基-D-葡萄糖苷、丙酮酸甲酯、D-半乳糖醛酸、吐溫80、D-甘露醇、肝糖、D-纖維二糖等只含碳的碳源和L-天門冬酰胺、N-乙酰-D-葡萄糖胺（AWCD＞0.5）等含氮碳源，也可以利用D，L-α-磷酸甘油、α-D-葡萄糖-1-磷酸（AWCD＜0.5）等含磷碳源，不能利用2-羥基苯甲酸、衣康酸和α-丁酮酸（AWCD＜0.5）。研究表明，Biolog-ECO 平板中微生物可以利用的碳源或類似物往往也存在于其原來的生境［21］。本研究4 月份底泥微生物利用的碳源種類多于7月份和10 月份，說明4 月份底泥中的有機物種類不同于7 月份和10 月份。高溶解氧條件下底泥菌群的微生物多樣性高于低氧和厭氧條件，且利用碳源的能力也更高［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，4 月份底泥微生物對只含碳的碳源的總利用率顯著高于7 月份和10 月份，可能是由于年初的清塘?xí)裉撂岣吡损B(yǎng)殖初期底泥中的含氧量，養(yǎng)殖中期和末期底泥中的含氧量下降，降低了底泥菌群的代謝能力。有研究表明，養(yǎng)殖水體微生物對Biolog-ECO 平板的含氮碳源的利用率和水體中氨氮的含量呈負相關(guān)［8］，與前人發(fā)現(xiàn)的異養(yǎng)細菌優(yōu)先使用氨氮作為生長源的研究結(jié)論一致［23］。本研究也發(fā)現(xiàn)，4 月份池塘底泥微生物對含氮碳源的總利用率顯著高于7 月份，而4 月份底泥中的氨氮含量顯著低于7 月份，結(jié)果驗證了前人的研究結(jié)論。池塘環(huán)境中的氮循環(huán)主要由微生物驅(qū)動，含氮有機物經(jīng)氨化作用形成氨，在有氧條件下氨經(jīng)硝化作用轉(zhuǎn)化成硝酸鹽，硝酸鹽經(jīng)反硝化作用轉(zhuǎn)化成N2［24］。底泥中的硝酸鹽含量越高，表示底泥微生物的硝化作用越強。本研究結(jié)果表明，底泥微生物的含氮碳源的AWCD 值與底泥中的硝酸鹽含量呈正相關(guān)，因此可以嘗試利用Biolog-ECO 平板技術(shù)分析底泥微生物的氨氮代謝功能。底泥微生物對含氮碳源的利用率與其對含磷碳源的利用率、對只含碳的碳源的利用率呈正相關(guān)；底泥微生物對含磷碳源的利用率與其對只含碳的碳源的利用率呈正相關(guān)，表明池塘底泥微生物群落結(jié)構(gòu)和功能相對穩(wěn)定。楊鶯鶯等［7］研究表明，羅非魚池塘底泥微生物群落對4 大類碳源的利用各月份間無顯著差異。宋景華等［25］應(yīng)用Biolog-ECO 平板技術(shù)分析了循環(huán)水養(yǎng)殖池塘水質(zhì)理化因子與微生物群落碳代謝特性的關(guān)系，結(jié)果顯示池塘水體TN、TP 與微生物代謝活性正相關(guān)；冗余分析結(jié)果表明TN、TP 等環(huán)境因子對養(yǎng)殖池塘微生物群落代謝的差異性貢獻最大。本研究結(jié)果表明，底泥微生物對含氮碳源的代謝活性與底泥中的硝酸鹽含量呈正相關(guān)。

4 結(jié)論

本研究采用Biolog-ECO 平板技術(shù)研究羅非魚高密度養(yǎng)殖池塘底泥微生物對不同碳源的代謝規(guī)律，結(jié)果表明，在養(yǎng)殖初期池塘底泥微生物對只含碳的碳源和含氮碳源的利用率高于養(yǎng)殖中期和末期，養(yǎng)殖中期和末期底泥中的總氮和氨氮含量顯著高于養(yǎng)殖初期。底泥微生物對含氮碳源的利用率與底泥中的硝酸鹽含量呈正相關(guān)，因此可以嘗試利用Biolog-ECO 平板技術(shù)分析底泥微生物的氮利用指數(shù)，評估底泥菌群對氮的處理能力。