廣東懷集青心菊炭疽病病原菌的分子鑒定

崔一平，李一方，彭埃天，宋曉兵，凌金鋒，黃 峰，陳 霞

（1.廣東省農業(yè)科學院植物保護研究所/廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.懷集縣農業(yè)農村局，廣東 懷集 526400）

【研究意義】菊花Chrysanthemum〔Dendranthema morifolium（Ramat.）Tzvelev）〕屬于菊科菊屬，為多年生宿根草本植物，是我國十大名貴花卉之一和世界四大切花之一，其具有重要的文化意義和較高的經濟價值。菊花除作為重要的觀賞花卉外，有些種類還是重要的藥用菊和茶用菊，如貢菊和杭菊等［1-4］。廣東省懷集縣青心菊為菊花的一種，主要用于切花觀賞，不具有藥用價值，目前在廣東懷集已經形成了相關的產業(yè)，該產業(yè)的發(fā)展有效增加了當地農民的收入?！厩叭搜芯窟M展】在菊花生產過程中有很多的病蟲害，如菊花黑斑病、青枯病、霜霉病、炭疽病、灰斑病、白粉病等，不僅種類繁多且由于菊花的生長特性使得這些病害具有多發(fā)性［5-8］。炭疽病是世界性的病害，廣泛分布在全球各地，能夠在多種蔬菜、作物、果樹、花卉等植物上造成嚴重經濟損失。引起炭疽病的病原菌為炭疽菌屬真菌（Colletotrichumsp.），基于其科學和經濟的重要性，該屬真菌被列為全球第八大植物病原真菌。過去有報道在菊花的葉片上引起炭疽病癥狀的病原菌為膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides，但在花卉上還沒有關于炭疽病菌引起病害的相關報道［6］。青心菊為菊花的一種，花型漂亮，很受大眾的喜愛；同其他菊花一樣，在青心菊上也存在著許多的病害，但目前很少有相關的報道。對于菊花病害的防治主要依賴化學農藥，但是由于在菊花生產過程中相關標準的缺失，導致農藥的誤用和濫用現象普遍發(fā)生，從而嚴重影響了菊花在使用過程中的安全［7-10］?！颈狙芯壳腥朦c】2019年5 月，我們在廣東懷集占地約6.7 hm2的菊花種植基地進行病害調查時發(fā)現，有50%～80%的菊花植株葉片上出現圓形枯黃色病斑、花瓣則從頂端向下延伸出現水漬癥狀并變褐，嚴重影響菊花的生長狀況和觀賞價值。采集發(fā)病的菊花葉片和花朵進行病原分離和致病性測定，并對所得病原進行分子生物學鑒定；同時設置不同實驗處理對菊花炭疽病在田間的防治藥劑苯醚甲環(huán)唑可濕性粉劑、430 g/L 戊唑醇懸浮劑、咪鮮胺可濕性粉劑和30%噻呋·嘧菌酯懸浮劑，以及各藥劑濃度進行篩選和分析。【擬解決的關鍵問題】明確引起菊花葉片和花瓣上炭疽病的主要病原菌，篩選防治效果較好的田間藥劑，明確引起菊花炭疽病的病原菌及該病害在田間的最佳防治藥劑，為菊花炭疽病的田間防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物：發(fā)病青心菊2019 年春季采集自廣東懷集菊花種植基地，健康菊花植株也購買自該基地，后種植于溫室中的滅菌土壤中，在自然光照下進行培養(yǎng)。

供試藥劑：三唑類殺菌劑苯醚甲環(huán)唑可濕性粉劑（WP），廣州絲譽藥業(yè)有限公司和430 g/L戊唑醇懸浮劑（翠箭），中科；咪唑類殺菌劑咪鮮胺可濕性粉劑，廣州佳途科技股份有限公司；復配劑30%噻呋·嘧菌酯懸浮劑（良尊），河北冠龍農化有限公司和40%噻呋·肟菌酯懸浮劑（潤秀），宇龍化工。其中，苯醚甲環(huán)唑廣泛應用于果樹、蔬菜等真菌病害的防治；430 g/L 戊唑醇具有殺菌譜廣和藥效長的優(yōu)點，主要用于小麥、蔬菜和果樹等作物上的真菌病害；咪鮮胺主要作用于子囊菌和半知菌在大田作物、水果蔬菜、草皮及觀賞植物上引起的病害；30%噻呋·嘧菌酯由24%噻呋酰胺和12%醚菌酯及其他助劑組成，對大部分高等真菌引起的病害均有防效；40%噻呋·肟菌酯由20%噻呋酰胺和20%肟菌酯組成，主要用于防治水稻、小麥等作物的紋枯病。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，去離子水定容至1 000 mL。

試劑及儀器：植物DNA 提取試劑盒，愛思進生物技術（杭州）有限公司；2×EasyTaqPCRSuperMix（-dye），北京全式金生物技術有限公司。帶數字相機（Leica DFC450）的光學顯微鏡（Leica DM2500）及在使用過程中所用到的軟件LAS v.4.5.0 software package（Leica）均購自廣州市德靈實驗儀器有限公司。微量離心機（Thermo Scientific Heraeus Pico 17/21 Fresco 17/21，Thermo Scientific，美國）、T100TM PCR 儀、核酸水平電泳槽（Mini-Sub Cell GT Cell1704406，伯樂，美國），上海凌儀生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

病原菌的分離與形態(tài)特征觀察：選取感病菊花的葉片和花瓣，用解剖刀在病健交界處取出0.2 cm×0.2 cm 左右的小塊，依次于70%酒精中30 s，2%NaClO 2～3 min，用無菌水沖洗3～5 次，置于無菌濾紙上在超凈臺中晾干，最后置于PDA 平板上25 ℃進行培養(yǎng)。3 d 后分離物上長出白色菌絲，挑取單孢子接種在新的PDA 平板上繼續(xù)培養(yǎng)10 d 后，于顯微鏡下對分離所得代表菌株Cg1-1、Cg1-2 和Cg1-3 的菌絲和孢子進行鏡檢，至少觀察60 個視野。

致病性測定：在液體PDA 培養(yǎng)基中分別對Cg1-1、Cg1-2 和Cg1-3 進行培養(yǎng)，制成 1×106孢子/mL 的孢子懸浮液，選取9 株帶有花朵的健康青心菊植株和15 個花瓣進行噴灑接菌（每個菌株接種3 株青心菊和5 個花瓣）；而后放置于25℃培養(yǎng)箱中進行正常培養(yǎng)，濕度為85%，光照/黑暗為12 h/12 h；而后每天進行觀察，并對發(fā)病癥狀進行拍照記錄。

真菌分子生物學鑒定：以分離獲得的代表菌株Cg1-1、Cg1-2 和Cg1-3 的全基因組DNA 為模板進行PCR 擴增。將培養(yǎng)7～10 d 純化菌株的菌絲和孢子從PDA 平板上刮下來，迅速用液氮研磨。根據植物DNA 提取試劑盒的說明書提取DNA。選取核糖體轉錄間隔區(qū)（ITS）、大亞基基因large subunit（LSU）genes?幾丁質合成酶Chitin synthase（CHS1）和肌動蛋白actin（ACT）的檢測引物ITS1/ITS4、LR5F/LROR、CHS-79F/CHS-345R 和ACT-512F/ACT-783R 進行PCR 擴增［11-13］（表1）。反應體系：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性40 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32 個循環(huán)；72 ℃維持5 min。然后吸取5 μL PCR 產物進行電泳檢測，并將獲得的陽性PCR 產物送去測序；最后將獲得的核酸序列在NCBI 的BLAST 中進行比對分析，同時基于獲得的ACT 和CHS1 基因片段利用MegAlign 7.1.0（44）軟件以最大自然法建立菊花炭疽病病原菌菌株Cg1-1、Cg1-2 和Cg1-3 的系統(tǒng)發(fā)育樹，從而確定其分類地位；本試驗用到的引物合成及PCR 產物測序服務均購自上海生工生物工程有限公司。

表1 供試引物及其參考文獻Table 1 Primers for test and the references

2 結果與分析

2.1 青心菊炭疽病癥狀及病原菌的形態(tài)特征

經過2019 年的調查研究發(fā)現，青心菊炭疽病易發(fā)生在夏季高濕高溫的環(huán)境中。該病發(fā)病初期，受侵染的植株葉片上初為黑褐色圓點，而后逐漸擴展為帶有黃色暈圈的橢圓形褐色病斑，病斑中央變薄后脫落；花瓣頂端初為水漬癥狀，而后變?yōu)樯詈稚?，最后花瓣萎蔫壞死?/p>

對采集的病樣進行常規(guī)組織分離，共獲得8 株真菌菌株Cg1-1、Cg1-2、Cg1-3、Cg1-4、Cg1-5、Cg1-6、Cg1-7 和Cg1-8。經過培養(yǎng)發(fā)現，菌株的菌落在PDA 平板上均為圓形，最初為白色，而后變成灰白色，隨著時間的推移，菌落上面散布出粉紅色和黑色的圓點。8 個菌株的生長模式一致，本研究選取其代表菌株Cg1-1、Cg1-2和Cg1-3 進行后續(xù)研究。菌株Cg1-1、Cg1-2 和Cg1-3 的菌絲均為白色透明、有分枝和分隔，分生孢子單胞、橢圓形、透明且無隔膜，兩端圓形，內含1 個油球，大小為14.5～18.9 μm×3.7～5.9 μm（n=50），初步鑒定菌株Cg1-1、Cg1-2 和Cg1-3屬于炭疽菌屬Colletotrichumsp.（圖1 A～E）。圖中的平板和孢子僅顯示Cg1-1 的狀態(tài)，Cg1-2 和Cg1-3 的菌落和孢子形態(tài)與Cg1-1 相似。

2.2 菌株Cg1-1、Cg1-2 和Cg1-3 的致病性測定

分別噴灑接種菌株Cg1-1、Cg1-2 和Cg1-3的孢子懸浮液于健康青心菊花瓣和葉片3 d 后，花瓣的尖端出現水漬狀，葉片上出現小黑點；7 d后菊花植株的葉片和花朵上的接種癥狀與田間發(fā)病癥狀相似（圖1F～H）。從接種發(fā)病的菊花葉片和花瓣上可再分離獲得單一的與原接種菌株在培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征上相一致的病原菌。根據柯赫氏法則，菌株Cg1-1、Cg1-2 和Cg1-3 為青心菊炭疽病的致病菌。

圖1 青心菊炭疽病的田間癥狀及其病原菌Cg1-1 的生物學特征和致病性測定Fig.1 Symptoms of anthracnose on Chrysanthemum in the field and the biological characteristics and pathogenicity test of pathogen Cg1-1

2.3 菌株Cg1-1、Cg1-2 和Cg1-3 的分子生物學鑒定

采用引物ITS1/ITS4、LR5F/LROR、ACT-512F/ACT-783R 和CHS-79F/CHS-345R 進行PCR擴增，分別得到558、877、260、299 bp 的片段。通過膠回收和測序后，把得到的序列在GenBank中進行BLAST 比對，發(fā)現菌株Cg1-1、Cg1-2和Cg1-3（ITS：MN 720559；LSU：MN 721338；ACT：MW 915856；CHS1：MW915855）與膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）（ITS：MN 714368；LSU：MH 875304；ACT:MN 919196；CHS1：MN075586）的同源性均達到了97.9%以上。基于獲得的ITS、LSU、ACT和CHS-1 序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現，菌株Cg1-1、Cg1-2 和Cg1-3與炭疽菌屬C.gloeosporioides的遺傳距離最近，聚為一簇；而與隱秘刺盤孢菌C.aenigma的遺傳距離最遠。結合形態(tài)學特征及分子鑒定結果確定引起青心菊炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌C.gloeosporioides（圖1）。文中僅顯示基于CHS1 和ACT 序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹，而分別基于ITS 和LSU 序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹與其相類似（圖2）。

圖2 基于ACT 和CHS1 序列以最大自然法構建青心菊炭疽病菌株Cg1-1、Cg1-2 和Cg1-3 及其近緣屬種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the pathogen strains Cg1-1，Cg1-2 and Cg1-3 of Chrysanthemum anthracnose and their relative strains based on ACT and CHS1 sequences with the maximum natural method

3 討論

本研究確定了引起廣東懷集青心菊炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌C.gloeosporioides，這是廣東省首次報道膠孢炭疽菌在青心菊的花朵上引起炭疽病。前期有報道，膠孢炭疽菌能在韓國玫瑰上引起枝梢枯死，我國春羽和檀香紫檀上引起葉斑病以及在我國菊花葉片和莖稈上引起炭疽病［10，14-16］。有關引起菊花炭疽病病原菌C.gloeosporioides的侵染機制方面目前還沒有相關的研究報道。

除此之外，本研究還對菊花炭疽病的田間防治效果進行調查。1號田和4號田種植的是青心菊，2 號田和3 號田種植的是其他品種的花卉。結果表明，菊花在5－7 月份炭疽病發(fā)生較嚴重，這跟當時的天氣及降水狀況有很大的關系。高溫多雨有利于菊花炭疽病的發(fā)生。從田間的防治效果可以看出，2 000 倍液430 g/L 戊唑醇對菊花炭疽病的防治效果較差，而1 500 倍液苯醚甲環(huán)唑和1 500 倍液咪鮮胺對菊花炭疽病的防治效果較好，可以達到90%以上（未發(fā)表）。同時2 000 倍液噻呋·肟菌酯和噻呋·嘧菌酯對菊花炭疽病的防治效果一般。研究表明，苯醚甲環(huán)唑一直被廣泛應用在核桃、柑橘、辣椒、檳榔等作物上炭疽病的防治且防治效果較好［17-20］，咪鮮胺則對芒果炭疽病及葡萄座腔菌引起的病害等有較好的防治效果［21-22］。而430 g/L 戊唑醇則主要用于防治小麥銹病、白粉病、赤霉病等［23-26］。噻呋·肟菌酯和噻呋·嘧菌酯能夠有效預防和治療水稻紋枯病等病害的發(fā)生［6，27］。以上5 種藥劑均很少被報道應用在菊花病害的防治上。

近年來，通過對菊花炭疽病田間防治藥劑的調查發(fā)現，由于菊花炭疽病防控相關研究的缺乏，導致花農在對該病害進行防治時缺乏正確的指導，存在大量農藥誤用和濫用的情況。本研究通過調查發(fā)現，對田間菊花炭疽病的防治，1 500 倍液苯醚甲環(huán)唑和1 500 倍液咪鮮胺均具有很好的防效；同時鑒于炭疽病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，在雨后進行有效的田間施藥能夠較大程度防治和減輕菊花炭疽病的發(fā)生和為害。

4 結論

引起廣東懷集青心菊炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌C.gloeosporioides。在田間，1 500 倍液苯醚甲環(huán)唑可濕性粉劑和1 500 倍液咪鮮胺可濕性粉劑對青心菊炭疽病的防治效果最好，防治效果均在90%以上，推薦這2 種藥劑作為田間防治菊花炭疽病的施用藥劑。但是化學藥劑防治僅為防治菊花炭疽病的一個手段，還應在種植過程中增強農業(yè)措施管理。目前急需在花卉病害防控方面相關政策的出臺和實施。