基于miR-208a-3p探究蘿卜硫素對肝癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響

梅孝臣，王 磊，王 娟，張理想，陸 瑩，張 娟，孫萬日*

基于miR-208a-3p探究蘿卜硫素對肝癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響

梅孝臣1，王 磊2，王 娟3，張理想1，陸 瑩1，張 娟1，孫萬日1*

1.鄭州大學附屬南陽市中心醫(yī)院普外科，河南 南陽 473000 2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院小兒外科，河南 鄭州 450000 3.南陽市宛城區(qū)第一人民醫(yī)院普外科，河南 南陽 473000

探討蘿卜硫素對肝癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響及其作用機制。用10、20、40 μmol/L蘿卜硫素處理人正常肝細胞L02、肝癌HepG2細胞48 h，通過CCK-8法篩選合適的蘿卜硫素濃度用于后續(xù)實驗；將HepG2細胞分為對照組和蘿卜硫素（20 μmol/L）組，CCK-8法檢測細胞增殖；Transwell測定細胞遷移與侵襲。設置對照組、模擬物（mimic）組及其陰性對照（mimic NC）組、抑制物（inhibitor）組及其陰性對照（inhibitor NC）組、真核翻譯起始因子4E（eukaryotic translation initiation factor 4E，EIF4E3）過表達物（pcDNA-EIF4E3）組及其陰性對照（pcDNA）組、EIF4E3小干擾RNA（si-EIF4E3）組及其陰性對照（si-NC）組、pcDNA-EIF4E3＋mimic NC組和pcDNA-EIF4E3＋mimic組，利用LipofectamineTM2000轉染試劑盒對HepG2細胞進行轉染，轉染48 h后，各組分別加入20 μmol/L蘿卜硫素處理24 h，qRT-PCR檢測HepG2細胞中表達；CCK-8法檢測細胞增殖；Transwell測定細胞遷移與侵襲；雙熒光素酶報告基因檢測實驗驗證miR-208a-3p與EIF4E3靶向關系；Western blotting檢測細胞中EIF4E3蛋白表達。與對照組比較，蘿卜硫素組HepG2細胞在24、48 h的450值、侵襲及遷移細胞數目顯著降低（＜0.05）；HepG2細胞中呈高表達，EIF4E3蛋白呈低表達；靶向負調控EIF4E3的表達；下調或過表達EIF4E3可增強蘿卜硫素對HepG2細胞增殖、侵襲及遷移的抑制作用，而過表達或沉默EIF4E3則呈相反趨勢；同時過表達和EIF4E3不會影響蘿卜硫素對HepG2細胞增殖、侵襲及遷移的抑制作用。蘿卜硫素可能通過下調進而上調EIF4E3的表達來抑制HepG2細胞增殖、侵襲及遷移。

肝癌；miR-208a-3p；蘿卜硫素；真核翻譯起始因子4E；增殖

肝癌是世界范圍內的主要癌癥，其發(fā)病率不斷升高，且存活率低于10%[1]。盡管在醫(yī)學、局部治療和手術治療方面取得了進展，但肝癌轉移率高且易產生耐藥性，導致其治愈率仍然較低[2]。因此，開發(fā)有效的治療藥物至關重要。蘿卜硫素是一種異硫氰酸酯，廣泛存在于西蘭花和其他十字花科植物中[3]。研究表明，蘿卜硫素可抑制肝癌細胞增殖，促進細胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[4]；蘿卜硫素可抑制人肺腺癌A549細胞的侵襲和遷移[5]。而關于蘿卜硫素對肝癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響鮮有報道。miRNA在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著重要的調控作用，下調miR-208-3p表達可抑制肝癌細胞的的增殖和侵襲[6]。生物信息學分析發(fā)現真核翻譯起始因子4E（eukaryotic translation initiation factor 4E，）為的靶基因，且EIF4E3可調控腫瘤細胞的增殖、遷移與侵襲[7]。而蘿卜硫素對肝癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響是否與miR-208-3p/EIF4E3軸有關尚不明確。因此本研究以miR-208-3p/EIF4E3軸為切入點，探究蘿卜硫素對肝癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響，以期為肝癌的臨床治療提供理論依據。

1 材料

1.1 細胞

人肝癌HepG2細胞及人正常肝細胞L02均購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥品與試劑

蘿卜硫素（質量分數≥98%，批號4478-93-7）購自青島捷世康生物科技有限公司；阿霉素（質量分數99%，批號23214-92-8）購自武漢華玖醫(yī)藥科技有限公司；模擬物（mimic）及其陰性對照（mimic NC）、抑制物（inhibitor）及其陰性對照（inhibitor NC）、EIF4E3過表達物（pcDNA-EIF4E3）及其陰性對照（pcDNA）、EIF4E3小干擾RNA（si-EIF4E3）及其陰性對照（si-NC）均購自廣州基迪奧生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒（批號205111）購自上海玉博生物科技有限公司；ECL發(fā)光檢測試劑盒（批號36222ES60）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號P0010）、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（批號RG027）均購自上海碧云天生物技術有限公司；LipofectamineTM2000轉染試劑盒（批號190521）購自美國Invitrogen公司；EIF4E3兔多克隆抗體（批號201103）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔多克隆抗體（批號200908）及HRP標記的羊抗兔IgG二抗（批號201007）購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.3 儀器

Elx800型酶標儀購自美國伯樂公司；CX23型光學顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；EPICS-ALTRA型流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司；ImageMaster型凝膠成像分析儀購自美國應用生物系統公司；7700型qRT-PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

HepG2細胞及L02細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.2 CCK-8法檢測蘿卜硫素對L02細胞和HepG2細胞存活率的影響

取處于對數生長期的HepG2細胞及L02細胞，以4×103個/孔接種至96孔板中，設置對照組及蘿卜硫素低、中、高劑量（10、20、40 μmol/L）組和阿霉素（2.5 μmol/L）組，待細胞貼壁后，分別加入相應藥物進行處理，對照組加入不含藥物的DMEM培養(yǎng)基，另設置空白孔（無細胞），處理48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，采用酶標儀測定450 nm處的吸光度（）值，計算細胞存活率。

細胞存活率＝(給藥－空白)/(對照－空白)

2.3 細胞分組

取處于對數生長期的HepG2細胞，設置對照組（正常培養(yǎng)的HepG2細胞）和蘿卜硫素組（20 μmol/L蘿卜硫素處理的HepG2細胞），處理48 h后，用于檢測蘿卜硫素對HepG2細胞增殖、侵襲和遷移的影響。

取處于對數生長期的HepG2細胞，設置對照組、mimic NC組、mimic組、inhibitor NC組、inhibitor組、pcDNA組、pcDNA-EIF4E3組、si-NC組、si-EIF4E3組、pcDNA-EIF4E3＋mimic NC組、pcDNA-EIF4E3＋mimic組，將LipofectamineTM2000轉染試劑與對應的轉染物進行轉染，轉染48 h后，采用qRT-PCR檢測mRNA表達，或采用Western blotting檢測EIF4E3蛋白表達以驗證轉染效率。轉染成功后，將上述對應各組細胞分別加入20 μmol/L蘿卜硫素處理24 h，分別標記為蘿卜硫素組、mimic NC＋蘿卜硫素組、mimic＋蘿卜硫素組、inhibitor NC＋蘿卜硫素組、inhibitor＋蘿卜硫素組、pcDNA＋蘿卜硫素組、pcDNA-EIF4E3＋蘿卜硫素組、si-NC＋蘿卜硫素組、si-EIF4E3＋蘿卜硫素組、pcDNA-EIF4E3＋mimic NC＋蘿卜硫素組、pcDNA-EIF4E3＋mimic＋蘿卜硫素組用于后續(xù)實驗。

2.4 CCK-8法檢測各組細胞增殖情況

按“2.2”項下方法進行細胞增殖測定，采用酶標儀測定450 nm處的值來評價細胞增殖能力。

2.5 Transwell檢測細胞侵襲與遷移情況

2.5.1 侵襲實驗 用不含胎牛血清的培養(yǎng)基將各組細胞稀釋至6×104個/mL，取200 μL各組細胞接種到包被有Matrigel的Transwell上室，再向Transwell下室加入500 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，取出Transwell小室，棄去孔內培養(yǎng)基，用棉簽輕輕擦去上部未遷移的細胞，然后將細胞用甲醇固定30 min，0.1%結晶紫染色20 min，于光學顯微鏡下隨機選取5個視野進行觀察并計數。

2.5.2 遷移實驗 用不含胎牛血清的培養(yǎng)基將各組細胞稀釋至6×104個/mL，取200 μL各組細胞接種到Transwell上室，再向Transwell下室加入500 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，按“2.5.1”項下方法處理。

2.6 qRT-PCR檢測HepG2細胞miR-208a-3p mRNA表達

按照試劑盒說明書提取各組細胞總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。以為內參，通過2???Ct方法計算的相對表達量。引物序列：上游引物5’-ATAAGACGAG- CAAAAAGCTTGT-3’，下游引物5’-GGAACGATA- CAGAGAAGATTAGC-3’；上游引物5’-TGCG- GGTGCTCGCTTCGCAGC-3’，下游引物5’-CCAG- TGCAGGGTCCGAGGT-3’。

2.7 雙熒光素酶報告基因實驗

分別構建EIF4E3的野生型（WT）和突變型（MUT）3’-UTR區(qū)質粒，標記為WT-EIF4E3、MUT-EIF4E3。利用LipofectamineTM2000轉染試劑盒將WT-EIF4E3和MUT-EIF4E3分別與mimic NC或mimic共轉染于HepG2細胞，轉染48 h后，通過雙熒光素酶測定系統檢測相對熒光素酶活性。

2.8 Western blotting檢測HepG2細胞EIF4E3蛋白表達情況

各組細胞加入RIPA裂解液，提取蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒進行定量，蛋白樣品經12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉封閉1 h，加入EIF4E3和GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜；用TBST洗膜3次后，加入HRP標記的羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，采用ECL發(fā)光檢測試劑盒顯影，Image軟件分析條帶灰度值。

2.9 統計分析

使用GraphPad Prism 5軟件進行統計分析，數據表示為，檢驗用于兩組間的比較，單因素方差分析用于多組間的比較，兩組之間比較采用SNK-檢驗。

3 結果

3.1 蘿卜硫素對L02和HepG2細胞存活率的影響

如表1所示，與對照組相比，蘿卜硫素（20、40 μmol/L）組L02及HepG2細胞存活率均顯著降低（＜0.05），且蘿卜硫素濃度為20 μmol/L時，L02細胞存活率為96.33%，HepG2細胞存活率為50%，并高于阿霉素組，因此選用20 μmol/L蘿卜硫素用于后續(xù)研究。

表1 蘿卜硫素對L02和HepG2細胞存活率的影響(, n = 6)

Table 1 Effect of sulforaphane on survival rate of L02 and HepG2 cells (, n = 6)

表1 蘿卜硫素對L02和HepG2細胞存活率的影響(, n = 6)

組別劑量/(μmol·L?1)L02細胞HepG2細胞 A450細胞存活率/%A450細胞存活率/% 對照—0.220±0.004100.00±0.000.340±0.008100.00±0.00 蘿卜硫素100.219±0.00598.75±1.030.298±0.004*82.52±2.62* 200.216±0.004*#96.33±1.31*#0.223±0.003*#51.32±2.24*# 400.192±0.003*#&76.25±1.27*#&0.185±0.002*#&35.22±1.82*#& 阿霉素2.50.207±0.002*#&%89.22±2.16*#&%0.203±0.002*#&%43.13±1.25*#&%

與對照組比較：*＜0.05；與蘿卜硫素（10 μmol·L?1）組比較：#＜0.05；與蘿卜硫素（20 μmol·L?1）比較：&＜0.05；與蘿卜硫素（40 μmol·L?1）組比較：%＜0.05

*<0.05control group;#<0.05sulforaphane (10 μmol·L?1) group; compared with SFN-20 group;&<0.05sulforaphane (20 μmol·L?1) group;%<0.05sulforaphane (40 μmol·L?1) group

3.2 蘿卜硫素對HepG2細胞增殖、侵襲和遷移的影響

如圖1所示，與對照組比較，蘿卜硫素組細胞的450值、侵襲及遷移細胞數目顯著降低（＜0.05）。

3.3 miR-208a-3p在L02、HepG2細胞中的表達情況及其對蘿卜硫素處理后的HepG2細胞增殖、侵襲和遷移的影響

如表2所示，與L02細胞比較，HepG2細胞中的表達顯著升高（＜0.05）；與HepG2細胞比較，20 μmol/L蘿卜硫素處理后的HepG2細胞中的表達顯著降低（＜0.05）。

如表3所示，與對照組、mimic NC組比較mimic組HepG2細胞中表達水平顯著升高（＜0.05）；與對照組、inhibitor NC組比較，inhibitor組HepG2細胞中表達水平顯著降低（＜0.05）。

圖1 蘿卜硫素對HepG2細胞增殖(A)、侵襲(B)和遷移(C) 的影響(, n = 6)

表2 miR-208a-3p在L02、HepG2細胞中的表達情況(, n = 6)

Table 2 Expression of miR-208a-3p in L02 and HepG2 cells (, n = 6)

表2 miR-208a-3p在L02、HepG2細胞中的表達情況(, n = 6)

組別劑量/ (μmol·L?1)miR-208a-3p mRNA相對表達量 L02—1.00±0.00 HepG2—2.85±0.13* 蘿卜硫素＋HepG2201.35±0.11#

與L02細胞比較：*＜0.05；與HepG2細胞比較：#＜0.05

*<0.05L02 cells;#<0.05HepG2 cells

表3 miR-208a-3p在各轉染組細胞中的表達情況(, n = 6)

Table 3 Expression of miR-208a-3p in cells of each transfection group (, n = 6)

表3 miR-208a-3p在各轉染組細胞中的表達情況(, n = 6)

組別miR-208a-3p mRNA相對表達量 對照1.00±0.00 mimic NC1.08±0.07 miR-208a-3p mimic2.12±0.15*# inhibitor NC1.06±0.05 miR-208a-3p inhibitor0.36±0.02*&

與對照組比較：*＜0.05；與mimic NC組比較：#＜0.05；與inhibitor NC組比較：&＜0.05

*<0.05control group;#<0.05mimic NC group;&<0.05inhibitor NC group

如圖2所示，與蘿卜硫素組、mimic NC＋蘿卜硫素組比較，mimic＋蘿卜硫素組HepG2細胞450值、侵襲及遷移細胞數目顯著升高（＜0.05）；與蘿卜硫素組、inhibitor NC＋蘿卜硫素組比較，inhibitor＋蘿卜硫素組細胞450值、侵襲及遷移細胞數目顯著降低（＜0.05）。

圖2 過表達或抑制miR-208a-3p對蘿卜硫素處理的HepG2細胞侵襲 (A、D)及遷移 (B、E)和增殖 (C) 的影響(, n = 6)

3.4 miR-208a-3p靶向調控EIF4E3的表達

Targetscan網站預測發(fā)現miR-208a-3p與EIF4E3存在結合位點，見圖3。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，與mimic NC和WT-EIF4E3共轉染組比較，mimic和WT-EIF4E3共轉染組HepG2細胞的熒光素酶活性顯著降低（＜0.05）；與mimic NC和MUT-EIF4E3共轉染組比較，mimic和MUT-EIF4E3共轉染組HepG2細胞的熒光素酶活性變化無統計學意義，見表4。

Western blotting結果（圖4）顯示，與對照組、mimic NC組比較，mimic組HepG2細胞中EIF4E3蛋白表達水平顯著降低（＜0.05）；與對照組、inhibitor NC組比較，inhibitor組HepG2細胞中EIF4E3蛋白表達水平顯著升高（＜0.05）。

圖3 Targetscan網站預測miR-208a-3p與EIF4E3的結合位點

表4 各組熒光素酶活性比較(, n = 6)

Table 4 Comparison of luciferase activity in each group (, n = 6)

表4 各組熒光素酶活性比較(, n = 6)

組別熒光素酶活性 WT-EIF4E3MUT-EIF4E3 mimic NC1.07±0.141.28±0.15 miR-208a-3p mimics0.33±0.02*1.21±0.13

與mimic NC組比較：*＜0.05

*<0.05mimic NC group

A-對照組 B-mimic NC組 C-miR-208a-3p mimic組 D-inhibitor NC組 E-miR-208a-3p inhibitor組 與對照組比較：*P＜0.05；與mimic NC組比較：#P＜0.05；與inhibitor NC組比較：&P＜0.05

3.5 蘿卜硫素通過調控miR-208a-3p/EIF4E3抑制HepG2細胞的增殖、遷移與侵襲

如圖5所示，與L02細胞比較，HepG2細胞中EIF4E3蛋白表達水平顯著降低（＜0.05）；與HepG2細胞比較，蘿卜硫素處理后的HepG2細胞中EIF4E3蛋白表達水平顯著升高（＜0.05）。

如圖6所示，與對照組、pcDNA組比較，pcDNA- EIF4E3組HepG2細胞中EIF4E3蛋白表達水平顯著升高（＜0.05）；與對照組、si-NC組比較，si-EIF4E3組HepG2細胞中EIF4E3蛋白表達水平顯著降低（＜0.05）；與pcDNA-EIF4E3組、pcDNA-EIF4E3＋mimic NC組比較，pcDNA-EIF4E3＋miR-208a-3p mimic組HepG2細胞中EIF4E3蛋白表達水平顯著降低（＜0.05）；與對照組比較，pcDNA-EIF4E3＋mimic組HepG2細胞中EIF4E3蛋白表達水平無顯著性差異。

A-L02細胞 B-HepG2細胞 C-蘿卜硫素＋HepG2細胞 與L02細胞比較：*P＜0.05；與HepG2細胞比較：#P＜0.05

A-對照組 B-pcDNA組 C-pcDNA-EIF4E3組 D-si-NC組 E-si-EIF4E3組 F-pcDNA-EIF4E3＋mimic NC組 G-pcDNA-EIF4E3＋mimic組 與對照組比較：*＜0.05；與pcDNA組比較：#＜0.05；與pcDNA-EIF4E3組比較：&＜0.05；與si-NC組比較：%＜0.05；與pcDNA-EIF4E3＋mimic NC組比較：@＜0.05

A-control group B-pcDNA group C-pcDNA-EIF4E3 group D-si-NC group E-si-EIF4E3 group F-pcDNA- EIF4E3 + mimic NC group G-pcDNA-EIF4E3 +group*<0.05control gr+oup;#<0.05pcDNA group;&<0.05pcDNA-EIF4E3 group;%<0.05si-NC group;@<0.05pcDNA-EIF4E3 + mimic NC group

圖6 各組HepG2細胞中EIF4E3蛋白表達情況(,= 6)

Fig.6 EIF4E3 protein expression in HepG2 cells in each group (, n = 6)

如圖7所示，與蘿卜硫素組、pcDNA＋蘿卜硫素組比較，pcDNA-EIF4E3＋蘿卜硫素組HepG2細胞450值、侵襲及遷移細胞數目顯著降低（＜0.05）；與蘿卜硫素組、si-NC＋蘿卜硫素組比較，si-EIF4E3＋蘿卜硫素組HepG2細胞450值、侵襲及遷移細胞數目顯著升高（＜0.05）；與pcDNA-EIF4E3＋蘿卜硫素組、pcDNA-EIF4E3＋mimic NC＋蘿卜硫素組比較，pcDNA-EIF4E3＋miR-208a-3p mimic＋蘿卜硫素組HepG2細胞450值、侵襲及遷移細胞數目顯著升高（＜0.05）；與蘿卜硫素組比較，pcDNA-EIF4E3＋mimic＋蘿卜硫素組HepG2細胞450值、侵襲及遷移細胞數目無顯著差異。

4 討論

蘿卜硫素是一種在十字花科蔬菜中發(fā)現的植物化學物質，可靶向參與癌癥發(fā)展的多種途徑[8]。研究表明，蘿卜硫素可通過阻斷Notch通路活化，下調Hes1表達，從而抑制結腸癌SW480細胞增殖、遷移和侵襲[9]；蘿卜硫素與索拉菲尼聯用對HepG2細胞具有協同抗腫瘤作用，其機制可能與誘導細胞凋亡有關[10]；蘿卜硫素可通過抑制磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路活化進而降低胃癌SGC7901細胞增殖、遷移及侵襲能力[11]。本研究結果顯示，蘿卜硫素可抑制HepG2細胞存活率，呈劑量相關性，且蘿卜硫素濃度為20 μmol/L時，細胞存活率接近50%，因此選用20 μmol/L蘿卜硫素用于后續(xù)研究；本研究還發(fā)現，與對照組比較，蘿卜硫素組HepG2細胞在24、48 h的450值、侵襲及遷移細胞數目顯著降低，提示蘿卜硫素可抑制HepG2細胞增殖、侵襲及遷移。

miRNA是長度為22～25 nt的非編碼RNA，其在轉錄后或翻譯水平負調控基因表達，可參與許多細胞過程的調節(jié)，如細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等[12]。越來越多的證據表明，多種miRNA在肝癌等人類惡性腫瘤中異常表達，miRNA的失調表達與癌癥的發(fā)病機制密切相關[13]。miR-208a-3p作為miRNA家族的一員，已有研究報道m(xù)iR-208a-3p在宮頸癌中高表達，抑制miR-208a-3p可抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲[14]；過表達miR-208a-3p能夠促進骨肉瘤細胞的增殖和轉移能力[15]；抑制miR-208-3p可減弱肝癌細胞的增殖和侵襲能力[6]；miR-208a-3p通過靶向程序性細胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）在結直腸癌中發(fā)揮致癌基因的作用[16]。本研究結果顯示，miR-208a-3p在HepG2細胞中高表達，過表達miR-208a-3p可減弱蘿卜硫素對HepG2細胞增殖、侵襲及遷移的抑制作用，下調miR-208a-3p可增強蘿卜硫素對HepG2細胞增殖、侵襲及遷移的抑制作用，提示miR-208a-3p參與了HepG2細胞增殖、侵襲及遷移過程，蘿卜硫素可能通過下調miR-208a-3p表達抑制HepG2細胞增殖、侵襲及遷移。

圖7 過表達或抑制EIF4E3對蘿卜硫素處理的HepG2細胞侵襲 (A、D)及遷移 (B、E)和增殖 (C) 的影響(, n = 6)

為了進一步探究蘿卜硫素通過下調miR-208a-3p表達抑制HepG2細胞增殖、侵襲及遷移的作用機制，本研究通過雙熒光素酶報告基因實驗證實EIF4E3為miR-208a-3p的靶基因。EIF4E3是真核細胞翻譯起始和調控的核心成分，能夠選擇性地控制腫瘤基因的翻譯和表達[17]。研究表明，過表達EIF4E3通過下調周期蛋白B1蛋白表達，抑制細胞周期的G2/M期，從而抑制宮頸癌細胞的增殖及克隆形成能力[18]；敲低EIF4E3可顯著增強胃癌BGC-823和MGC-803細胞的增殖、遷移和侵襲能力[7]。本研究結果顯示，EIF4E3蛋白在HepG2細胞中低表達，miR-208a-3p可靶向負調控EIF4E3，沉默EIF4E3可減弱蘿卜硫素對HepG2細胞增殖、侵襲及遷移的抑制作用，過表達EIF4E3可增強SFN對HepG2細胞增殖、侵襲及遷移的抑制作用，同時過表達miR-208a-3p和EIF4E3不會影響蘿卜硫素對HepG2細胞增殖、侵襲及遷移的抑制作用，提示蘿卜硫素可能通過調控miR-208a-3p/EIF4E3抑制HepG2細胞增殖、侵襲及遷移。

綜上所述，蘿卜硫素可能通過下調miR-208a-3p進而上調EIF4E3的表達來抑制HepG2細胞增殖、侵襲及遷移。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of sulforaphane on proliferation, invasion and migration of liver cancer cells based on miR-208a-3p

MEI Xiao-chen1, WANG Lei2, WANG Juan3, ZHANG Li-xiang1, LU Ying1, ZHANG Juan1, SUN Wan-ri1

1.Department of General Surgery, Nanyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University, Nanyang 473000, China2.Department of Pediatric Surgery, The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, China 3.Department of General Surgery, The First People’s Hospital of Wancheng District, Nanyang 473000, China

To investigate the effect and mechanism of sulforaphane on proliferation, invasion and migration of liver cancer cells.Human normal liver cells L02 and hepatocarcinoma HepG2 cells were treated with 10, 20, 40 μmol/L sulforaphane for 48 h, and the appropriate sulforaphane concentration was screened by CCK-8 method for subsequent experimental studies; HepG2 cells were divided into control group and sulforaphane (20 μmol/L) group, CCK-8 method was used to detect cell proliferation; Transwell was used to measure cell migration and invasion.HepG2 cells were divided into control group,mimic group, mimic group,inhibitor group, inhibitor NC group, pcDNA-eukaryotic translation initiation factor 4E (EIF4E3) group, pcDNA group, si-EIF4E3 group, si-NC group, pcDNA-EIF4E3 + mimic NC group and pcDNA-EIF4E3 +mimic group, HepG2 cells were transfected with LipofectamineTM2000 transfection kit, after 48 h of transfection, each group was treated with 20 μmol/L sulforaphane for 24 h.qRT-PCR was used to detect the expression ofin HepG2 cells; CCK-8 method was used to detect cell proliferation; Transwell method was used to measure cell migration and invasion; Dual luciferase reporter gene detection experiment was used to verify the targeting relationship between miR-208a-3p and EIF4E3; Western blotting was used to detect the EIF4E3 protein expression in cells.Compared with control group,450value, number of invasion and migration cells of HepG2 cells in sulforaphane group were significantly reduced (< 0.05);in HepG2 cells was highly expressed and EIF4E3 protein was low expressed; miR-208a-3p targeted and negatively regulated the expression of EIF4E3; Down-regulation ofor over-expression of EIF4E3 could enhance the inhibitory effects of sulforaphane on HepG2 cell proliferation, invasion and migration, while overexpression ofor silence of EIF4E3 showed the opposite trend; Overexpression ofand EIF4E3 at the same time would not affect the inhibitory effects of sulforaphane on HepG2 cell proliferation, invasion and migration.Sulforaphane may down-regulateto up-regulate the expression of EIF4E3, thereby inhibiting the proliferation, invasion and migration of HepG2 cells.

liver cancer; miR-208a-3p; sulforaphane; eukaryotic translation initiation factor 4E; proliferation

R285.5

A

0253 - 2670(2022)05 - 1450 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.05.020

2021-11-04

梅孝臣（1981—）男，碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事肝膽外科方面研究。E-mail: mx1981c@163.com Tel: 18538976966

通信作者：孫萬日（1971—）男，碩士研究生，主任醫(yī)師，主要從事肝膽外科方面研究。E-mail: 15890879873@163.com Tel: 15890879873

[責任編輯 李亞楠]