碳點熒光探針的制備及其檢測金銀花中綠原酸含量的研究

李晚誼，李 宏，李秋蘭，楊德志，楊亞玲*

碳點熒光探針的制備及其檢測金銀花中綠原酸含量的研究

李晚誼1，李 宏2，李秋蘭3，楊德志3，楊亞玲3*

1.云南省農(nóng)業(yè)科學院藥用植物研究所，云南 昆明 650205 2.云南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，云南 昆明 650033 3.昆明理工大學生命科學與技術(shù)學院，云南 昆明 650500

以氯、氮摻雜碳點（Cl/N-CDs）為熒光探針，基于Cl/N-CDs和綠原酸之間的內(nèi)濾效應(yīng)，猝滅Cl/N-CDs的熒光，建立了綠原酸熒光檢測新方法。以氯化膽堿與尿素形成的低共熔溶劑及檸檬酸為原料，通過一步水熱法完成碳點制備，并通過透射電子顯微鏡，紫外-可見分光光度法，紅外光譜，X射線衍射，X射線光電子能譜和熒光對其光學性能、形貌及相關(guān)基團進行表征。綠原酸在0.47～62.70 μg/mL對Cl/N-CDs的熒光猝滅呈良好的線性關(guān)系，用于金銀花提取液中綠原酸的檢測，其檢出限可達到36 ng/mL。在綠原酸不同提取方法中，以氯化膽堿/尿素低共熔溶劑作為提取劑時對金銀花中綠原酸的提取效率最高。以低共熔溶劑作為碳點制備原料和綠原酸提取溶劑，可實現(xiàn)綠原酸的提取和檢測的雙重作用，為金銀花的質(zhì)量評價提供新的研究思路。

綠原酸；金銀花；氯、氮摻雜碳點；熒光探針；低共熔溶劑

金銀花作為忍冬科忍冬屬植物忍冬Thunb.雙子葉植物的花蕾或帶初開的花，具有疏熱散風、清熱解毒的藥理作用[1-3]，被稱為“中藥抗生素”。綠原酸屬于多酚類化合物，是金銀花中起抗菌、抗炎、抗病毒藥理作用的有效成分之一[4-5]?！吨袊幍洹?020年版及ISO標準21317-2019規(guī)定，金銀花中綠原酸≥1.5%[6-7]。迄今為止綠原酸含量的檢測以HPLC法[8]、熒光光譜法[9]和近紅外光譜法[10]等為主要手段[11-14]，其中熒光光譜法由于具有便于操作、耗時短、靈敏度高、低成本等優(yōu)點，受到了廣大研究者的關(guān)注[15-16]。

碳點（carbon dots，CDs）是一類新型碳納米材料，其直徑小于10 nm，且可以通過在其表面修飾不同的官能團來改變其物理化學性能，元素摻雜形成新的表面形態(tài)可以捕獲激發(fā)電子，使得碳點的量子產(chǎn)率及其性能得到顯著提升[17-19]。低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DES）是指由季銨鹽等（氫鍵受體）和羧酸、多元醇等（氫鍵給體）根據(jù)一定的化學計量比組合而成的凝固點比原料熔點低的低共熔混合物，又稱共晶溶劑。項目組前期研究表明，DES具有良好的萃取性能[20-21]，同時以DES為原料制備的碳點又具有高的熒光產(chǎn)率及抗菌效能[22]。因此，研究以DES作為原料制備碳點，具有一定的研究價值。

碳點具有熒光強度高和穩(wěn)定性好的優(yōu)點，在紫外光的照射下可以發(fā)出強烈的熒光，使其在很多領(lǐng)域中都有廣闊的應(yīng)用前景。李志英等[23]以甘露糖為原料，采用熱解法制備的檸檬酸修飾的熒光碳點，可以實現(xiàn)樣品中總黃酮的分析檢測（以蘆丁計）。徐源等[24]探討了利用碳點建立可用于鹿茸中活性物質(zhì)測定技術(shù)的可行性分析。周巳祺等[25]以熒光碳點作為探針，建立一種簡便靈敏的測定中藥大黃素的方法。羅康[26]以黃鐵礦和氟化鈣作為納米材料實現(xiàn)了中藥中雜質(zhì)的熒光檢測。所以，碳點在實現(xiàn)中藥中成分快速檢測前景廣闊。

本研究是以氯化膽堿和尿素形成的DES及檸檬酸為原料，通過一步水熱法合成氯、氮摻雜碳點（Cl/N-CDs）?；贑l/N-CDs和綠原酸之間的內(nèi)濾效應(yīng)，建立了綠原酸熒光檢測新方法（如圖1所示）。為了對金銀花中綠原酸進行精確檢測，研究采取不同溶劑（水、乙醇及DES）對金銀花中的綠原酸進行提取。通過使用本方法和HPLC法檢測檢測提取液中綠原酸，結(jié)果證明本方法可信度較高。此外，共存物干擾實驗也證明，本方法具有優(yōu)異的抗干擾能力（共存的其他多酚、有機酸等成分對探針幾乎無干擾）。

1 儀器與材料

1.1 儀器

GS800A分子熒光光譜儀，安捷倫科技（中國）有限公司；TENSOR27型傅立葉紅外光譜分析儀，德國Bmker公司；Bruker D8 Advance型X射線衍射儀，德國Bruker公司；TU-1901紫外-可見雙光束分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；XW-800快速混勻器，上海汗諾儀器有限公司；pHS-3B精密酸度計，德國賽多利公司；HC-3018R型高速離心機（轉(zhuǎn)頭型號H0650），安徽中科中佳科學儀器有限公司；120 mL聚四氟乙烯內(nèi)襯水熱反應(yīng)釜，上海-凱實驗儀器有限公司；Tecnai G2 TF30場發(fā)射透射電子顯微鏡，荷蘭FEI公司。

圖1 基于綠原酸對Cl/N-CDs熒光猝滅傳感器示意圖

1.2 試劑

氯化膽堿（批號C106702276）、尿素（批號2150820）、檸檬酸（批號20200720）購于上海國藥集團化學試劑公司，質(zhì)量分數(shù)均大于98%；硫酸奎寧（批號H1623052）、綠原酸（批號CHB190121）、異綠原酸A（批號CHB180921）、異綠原酸C（批號CHB180925）購于上海阿拉丁生化科技有限公司；無水乙醇（批號20211101329）購買自上海易恩化學技術(shù)有限公司；KCl（批號20200820）、NaCl（批號20201020）、MgCl2（批號20171009）、ZnCl2（批號20140320）、CaCl2（批號20130602）、CuCl2（批號20130509）、棕櫚酸（批號20140510）、阿拉伯酸（批號20131110）、-葡萄糖（批號20100801）、甘氨酸（批號F20120616）、半胱氨酸（批號F20090415）、抗壞血酸（批號20180402）購自上海麥克林生化科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)均大于99%；金銀花由云南中醫(yī)藥大學陳林興教授鑒定，為忍冬科忍冬屬植物忍冬Thunb.的干燥花蕾或帶初開的花，購買于云南中藥材批發(fā)市場；實驗用水均為去離子水，美國Milli-Q Academic超純水系統(tǒng)。

2 方法

2.1 Cl/N-CDs的合成

將氯化膽堿與尿素按物質(zhì)的量比1∶1（氯化膽堿-尿素2.8∶1.2）混合之后，于100 ℃油浴，磁力攪拌至固體顆粒完全熔解為透明液體，該透明液體即DES[27]。將1.9 g檸檬酸和100 mL去離子水與低共熔溶劑混合，完全溶解后，轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯罐中，置于馬弗爐180 ℃條件下反應(yīng)8 h。隨后將其從馬弗爐中取出，放置于室溫自然冷卻。得到的棕色溶液先離心（10 000 r/min、15 min），再用0.22 μm濾膜濾過，即得氯、氮雙元素摻雜的碳點（Cl/N-CDs），于4 ℃下儲存?zhèn)溆?。? mL Cl/N-CDs于燒杯中，烘干后稱定質(zhì)量，扣除燒杯質(zhì)量后，即得Cl/N-CDs的質(zhì)量濃度為23 mg/mL。

2.2 量子產(chǎn)率及光學特性

Cl/N-CDs的量子產(chǎn)率參照文獻方法[28]進行計算。用0.1 mol/L H2SO4溶液溶解硫酸奎寧作為標準溶液使用（其熒光量子效率為54%），Cl/N-CDs的量子產(chǎn)率（）按以下公式計算。

＝RSRS2/(RSR2)

表示吸光度，表示溶劑的折射系數(shù)（其中S2/R2＝1，R和S分別表示參比硫酸奎寧和樣品），表示熒光強度

對材料光學特性的研究通過紫外和熒光儀器實現(xiàn)，具體如下：用1.6 mg/mL的Cl/N-CDs稀釋溶液測定其紫外特征吸收峰。熒光儀上在激發(fā)波長為280～360 nm，狹縫寬度均為5 nm時檢測其熒光發(fā)射隨激發(fā)波長的位移情況。

2.3 熒光探針測定綠原酸的方法

量取8 mL合成的Cl/N-CDs用去離子水稀釋至115 mL，得到質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL的Cl/N-CDs稀釋溶液，用作熒光強度檢測的工作液。一般過程中，量取0.5 mL的Cl/N-CDs稀釋溶液和0.5 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液（pH 7），加入20 μL不同質(zhì)量濃度的綠原酸標準溶液后，用去離子水稀釋至4 mL。渦旋混勻后，室溫下放置反應(yīng)5 min。最后在324 nm的激發(fā)波長下測定402 nm處的熒光強度。

考察不同乙醇體積分數(shù)、NaCl濃度、pH值、溫度及共存物質(zhì)對熒光探針的影響。

2.3.1 乙醇體積分數(shù) 量取0.5 mL的Cl/N-CDs稀釋溶液，用不同體積分數(shù)的乙醇（0、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、100%）稀釋至4 mL后，在324 nm的激發(fā)波長下測定402 nm處熒光強度的變化。

2.3.2 NaCl濃度 量取0.5 mL的Cl/N-CDs稀釋溶液，用不同濃度的NaCl（50、100、150、200、250、300、350、400、450 mmol/L）稀釋至4 mL后測定402 nm處熒光強度的變化。

2.3.3 pH值 在pH 2～10時檢測Cl/N-CDs熒光強度變化。

2.3.4 溫度 在5～65 ℃時檢測Cl/N-CDs熒光強度變化。

2.3.5 共存物質(zhì) 分別考察可能存在的共存物質(zhì)K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Fe3+、棕櫚酸、阿拉伯酸、葡萄糖、甘氨酸、半胱氨酸、抗壞血酸及異構(gòu)體質(zhì)量濃度為6 mg/mL時對60 μg/mL的綠原酸熒光猝滅效果的影響。

2.4 樣品的提取

精確稱取3份5 g金銀花粉末置于圓底燒瓶中，3份樣品中再分別加入100 mL的DES（氯化膽堿/尿素）、去離子水和60%乙醇[29]作為提取劑，超聲（25 ℃、功率120 W）提取120 min后，8000 r/min離心15 min，取上層清液，測定綠原酸含量。

2.5 HPLC法驗證方法準確性

2.5.1 對照品測試 分別取20 μL不同質(zhì)量濃度的綠原酸標準溶液，注入HPLC系統(tǒng)分析，測定相對應(yīng)質(zhì)量濃度下綠原酸的峰面積。以綠原酸質(zhì)量濃度為橫坐標（），峰面積為縱坐標（），繪制標準曲線為＝23.282－47.625，2＝0.996 4，線性范圍4～1000 μg/mL。與此同時，取樣品提取液20 μL，在相同色譜條件下，通過HPLC法測定不同提取劑條件下提取的待測液中綠原酸含量。

2.5.2 色譜條件 色譜柱為Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.4%磷酸水溶液（13∶87）；體積流量為1.0 mL/min；柱溫為25 ℃；進樣量為20 μL；檢測波長為327 nm。

3 結(jié)果與分析

3.1 Cl/N-CDs的表征

圖2-a為Cl/N-CDs的X射線光電子能譜（XPS）圖。圖中283.8、398.3、531.0 eV 3個主峰，分別對應(yīng)于C1s、N1s和O1s。C1s的高分辨率譜圖（圖2-b）可分為283.8、284.7、285.7、287.2 eV 4個峰，分別對應(yīng)于C＝C、C-O、C-N、C＝O。圖2-c顯示的N1s高分辨率譜圖在398.2、399.7 eV處有2個典型的峰，分別對應(yīng)于N-C和N-H。O1s的高分辨率譜圖（圖2-d）可以分解為530.3、531.1、532.3 eV處的3個峰，分別對應(yīng)O-H、C＝O、C-O。

圖3-a為Cl/N-CDs的透射電子顯微鏡（TEM）圖，從圖中可以看出，所制備的Cl/N-CDs呈現(xiàn)類球形，分散性較好，且尺寸大小在5 nm左右。Cl/N-CDs排列為晶格條紋，相鄰晶格間的間距為0.24 nm。圖3-b為Cl/N-CDs的紅外光譜（FI-IR）圖。從圖中可以看出，3259、3430、2950 cm?1處的較強峰各自與N-H、O-H和C-H的伸縮振動相關(guān)聯(lián)，C＝O和C＝C的伸縮振動歸因于1649 cm?1處的峰，1400 cm?1歸因于C-N鍵的伸縮振動，而1089 cm?1附近的峰來源于C＝O鍵的伸縮振動[30]。

3.2 Cl/N-CDs的光學性能

圖4-a中的2條譜線分別為Cl/N-CDs的熒光激發(fā)譜線（紅線）和熒光發(fā)射譜線（藍線）。如圖中所示，可以看出Cl/N-CDs的最大激發(fā)在324 nm，最大發(fā)射峰在402 nm處。Cl/N-CDs水溶液在自然光下接近無色，在365 nm的紫外光照射下呈現(xiàn)出明亮的藍色熒光。圖4-b則是在不同的激發(fā)波長下Cl/N-CDs的熒光發(fā)射峰。而且激發(fā)波長的改變不會改變發(fā)射峰的位置，表明Cl/N-CDs尺寸的均勻性和表面狀態(tài)的穩(wěn)定性。

圖2 Cl/N-CDs的XPS全譜圖(a) 及C 1s (b)、N 1s (c) 和O 1s (d) 的高分辨譜圖XPS譜圖

圖3 TEM圖(a) 和FTIR譜圖(b)

圖4 綠原酸的UV-vis吸收光譜和Cl/N-CDs的FL光譜(a) 及Cl/N-CDs在不同激發(fā)波長下的熒光發(fā)射光譜(b)

材料熒光量子產(chǎn)率的測定采用相對熒光量子產(chǎn)率測定法，以硫酸奎寧作為標準溶液，計算得到Cl/N-CDs熒光量子點產(chǎn)率為37%。此外，研究考察了不同5個批次下Cl/N-CDs的熒光強度變化，結(jié)果表明Cl/N-CDs熒光強度相對標準偏差在±2.13%以內(nèi)。

3.3 熒光探針測定綠原酸的條件優(yōu)化

考察了乙醇、NaCl、pH值和反應(yīng)溫度對Cl/N- CDs測定綠原酸的影響（圖5）。結(jié)果表明，不同乙醇體積分數(shù)、NaCl濃度、pH值在6～8及溫度35～55 ℃時，Cl/N-CDs的熒光強度基本不變，Cl/N-CDs具有較好的穩(wěn)定性、耐鹽性等特性，對酸堿度和乙醇具有較強的抗干擾能力。

3.4 Cl/N-CDs熒光猝滅測定綠原酸

綠原酸在0.47～62.70 μg/mL時，Cl/N-CDs熒光的猝滅程度（圖6-a）與反應(yīng)液中加入的綠原酸質(zhì)量濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖6-b）：(0－)/0＝?12.437 89＋925.388 23，2＝0.992 48。其中0和分別為加不同質(zhì)量濃度綠原酸前后Cl/N-CDs的熒光強度，為綠原酸的質(zhì)量濃度。檢出限根據(jù)3/計算，為36 ng/mL（為空白樣品的標準偏差，為線性校準曲線的斜率）。

3.5 熒光猝滅機制的研究

Cl/N-CDs的熒光光譜和綠原酸的紫外吸收光譜如圖4-a所示，綠原酸在236、334 nm處有2個UV-vis吸收光譜（黑線）特征吸收峰，Cl/N-CDs的激發(fā)和發(fā)射波長分別為324、402 nm。從圖4-a中可以看出，綠原酸的紫外特征吸收峰與Cl/N-CDs的激發(fā)、發(fā)射峰有很大程度重疊，故而推測綠原酸對Cl/N-CDs產(chǎn)生熒光猝滅的機制為內(nèi)濾效應(yīng)。

3.6 熒光探針對綠原酸測定的選擇性

研究考察了金銀花樣品中可能存在的共存物質(zhì)對熒光探針體系的影響。如圖7所示，以Cl/N-CDs為空白，其他實驗組中加入等量Cl/N-CDs和綠原酸，并分別加入K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Fe3+、棕櫚酸、阿拉伯酸、葡萄糖、甘氨酸、半胱氨酸、抗壞血酸。由圖7可知，以上幾種可能與綠原酸共存于金銀花基體中的成分對測定基本沒有干擾。綠原酸異構(gòu)體對碳點熒光干擾的研究表明，異綠原酸A和異綠原酸C的質(zhì)量濃度高于綠原酸質(zhì)量濃度5倍時有一定熒光猝滅效果?？紤]到實際金銀花樣品中異構(gòu)體和金屬離子的實際濃度，該結(jié)果表明本方法具有較好的抗干擾效果。

圖5 乙醇體積分數(shù)(a)、NaCl濃度(b)、溫度(c)、pH值 (d) 對Cl/N-CDs熒光強度的影響

圖6 不同綠原酸質(zhì)量濃度和Cl/N-CDs的熒光光譜(a) 及線性曲線(b)

3.7 不同提取方法對金銀花中綠原酸測定的影響

為了實現(xiàn)對實際金銀花樣品中綠原酸的精確檢測，并選出對熒光分析干擾小甚至沒有干擾的提取試劑，探究了3種不同提取試劑提取對實際綠原酸提取檢測結(jié)果的影響，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，用氯化膽堿/尿素DES提取效果最好，測定的綠原酸含量最高，60%乙醇提取效果其次，水提取效果最低。此外，DES自身也具有一定的熒光，如圖8-a所示，但其最大m＝420 nm，x＝500 nm，并不會對綠原酸的熒光測定產(chǎn)生干擾。

圖7 共存物質(zhì)對熒光探針體系的影響

表1 金銀花樣品中綠原酸的含量測定比較(, n = 5)

Table 1 Determination of chlorogenic acid content in LJF samples (, n = 5)

表1 金銀花樣品中綠原酸的含量測定比較(, n = 5)

提取方法添加量/(mg?g?1)熒光探針HPLC法 綠原酸/(mg?g?1)回收率/%綠原酸/(mg?g?1)回收率/% DES法026.80±10.79?27.00±11.82? 2046.50±12.0098.546.70±13.3898.5 4065.40±13.7396.566.90±14.9099.8 醇提法021.30±11.75?21.50±15.05? 2040.90±11.1398.041.30±10.1799.0 4060.40±11.5197.861.10±12.0099.0 水提法011.60±12.71?12.10±9.73? 2031.40±11.7599.031.90±11.2999.0 4051.90±16.97100.852.00±12.5599.8

由于提取液顏色較深無法直接使用紫外方法測定（圖8-b），藥典方法中需要通過色譜柱分離。本研究以建立的熒光探針方法測定提取液中綠原酸，方法加樣回收率在96.5%～100.8%，結(jié)果也表明用本法測定金銀花樣品的綠原酸含量精密度高、穩(wěn)定性好，且?guī)缀鯚o干擾存在。為了驗證方法的準確性，研究以HPLC方法對相同樣品進行了測定，對比結(jié)

圖8 DES的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜(a)、不同提取液的紫外吸收光譜圖(b)、DES和60%乙醇提取液的色譜圖(c)、不同提取液圖片(d)

果較一致。雖然本方法依然需要使用較多萃取劑提取綠原酸，但與HPLC法相比（圖8-c），該方法借助酶標儀可以實現(xiàn)高通量檢測，操作簡便、快速、成本低廉。HPLC法檢出限根據(jù)3/計算為1.4 mg/kg，遠高于本方法，此外，借助酶標儀檢測，檢測時間可以從HPLC法的5 min縮短至幾秒鐘范圍內(nèi)，相對比之下，儀器運行和測定成本也很低，具有很好的應(yīng)用推廣價值。

4 討論

4.1 熒光探針條件優(yōu)化

本實驗分別考察了乙醇體積分數(shù)（0～100%）、NaCl濃度（0～450 mmol/L）、pH值（2～10）和反應(yīng)溫度（5～65 ℃）4種不同條件下，對Cl/N-CDs的熒光和熒光探針檢測體系的影響，結(jié)果表明Cl/N-CDs的熒光和熒光探針檢測影響較弱，證明了基于Cl/N-CDs的熒光探針檢測體系具有較強的抗干擾能力。

4.2 熒光探針測定猝滅機制及其選擇性

通過測定Cl/N-CDs的熒光光譜和綠原酸的紫外吸收光譜，對比二者譜圖見的差異性，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠原酸的吸收峰與碳點的激發(fā)峰存在很大一部分的重疊。根據(jù)此現(xiàn)象，可以推測Cl/N-CDs與綠原酸之間的熒光猝滅效果主要基于內(nèi)濾效應(yīng)，且其熒光猝滅效果與綠原酸含量成正比。

在檢測體系種加入7種金屬離子、6種可能共存的物質(zhì)以及綠原酸的異構(gòu)體，通過測定其對碳點的熒光強度影響效果。最終發(fā)現(xiàn)綠原酸對體系的熒光具有非常顯著的熒光猝滅效果，綠原酸的異構(gòu)體僅具有非常微弱的熒光猝滅效果。結(jié)果表明該熒光探針對于綠原酸的測定具有非常強的選擇性。

4.3 金銀花樣品的測定分析

研究以3種不同的提取液，分別提取金銀花中的綠原酸，結(jié)果表明以氯化膽堿/尿素制備的DES萃取劑對綠原酸萃取效果最好，且其提取液顏色最淺。從色譜圖上可以看出，在一定程度上DES作為萃取劑可以降低干擾，且DES的熒光不會對檢測體系產(chǎn)生干擾。方法的加樣回收率在96.5%～100.8%，與HPLC方法測定的結(jié)果相一致。

5 結(jié)論

本研究建立了一種耐鹽、耐酸堿、耐醇及高溫的可檢測綠原酸的熒光探針。方法具有準確性好、抗干擾能力強的特點，可用于實際金銀花中綠原酸的提取和含量測定。利用熒光探針技術(shù)，可以實現(xiàn)金銀花中綠原酸的快速分析測定，可為中藥質(zhì)量評價提供新的研究思路和分析策略。

此外，關(guān)于Cl/N-CDs與綠原酸選擇性熒光猝滅的作用機制，還需要進一步研究。探究碳點與綠原酸的作用機制，對于建立高選擇性的熒光探針技術(shù)具有重要的指導意義，同時也可為其他探針技術(shù)的開發(fā)提供技術(shù)支持。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 夏偉, 余永亮, 楊紅旗, 等.金銀花化學成分及藥理作用研究進展 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學, 2017, 45(33): 126-127.

[2] 吳嬌, 王聰, 于海川.金銀花中的化學成分及其藥理作用研究進展 [J].中國實驗方劑學雜志, 2019, 25(4): 225-234.

[3] 方仕茂, 劉忠英, 楊婷, 等.金銀花葉紅茶加工工藝研究 [J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2021(3): 217-220.

[4] 張彩云, 谷靜娟, 周銀萍, 等.金銀花、連翹對金黃色葡萄球菌誘發(fā)小鼠乳腺炎的防治作用研究 [J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志, 2015, 34(3): 44-47.

[5] Wu Z S, Xu B, Du M,.Validation of a NIR quantification method for the determination of chlorogenic acid insolution in ethanol precipitation process [J]., 2012, 62: 1-6.

[6] 中國藥典[S].一部.2020: 230-232.

[7] ISO 21317—2019中醫(yī)藥—金銀花[S].2019: 14.

[8] 繆艷燕, 徐幫會, 徐劍, 等.金銀花的HPLC指紋圖譜建立及其抗炎作用譜-效關(guān)系研究 [J].中國藥房, 2020, 31(20): 2497-2502.

[9] 韓竹.基于碳點為探針的利福平、綠原酸、Cu2+和谷胱甘肽的熒光檢測新方法研究 [D].重慶: 西南大學, 2020.

[10] 周文忠, 張峻松, 鄒悅, 等.應(yīng)用近紅外光譜法結(jié)合波長篩選快速測定煙草綠原酸、莨菪亭和蕓香苷含量 [J].江西農(nóng)業(yè)學報, 2019, 31(12): 66-71.

[11] 茅佳寧, 岳倩, 周雪瑩, 等.基于乙二胺修飾碳點的熒光猝滅高效檢測綠原酸 [J].化學試劑, 2020, 42(8): 954-958.

[12] 郝海群.近紅外光譜法測定金銀花中綠原酸含量 [J].河南中醫(yī), 2015, 35(3): 640-642.

[13] 姜華, 郭敏, 徐世紅, 等.HPLC法測定忍冬藤痛風顆粒中綠原酸的含量 [J].西部中醫(yī)藥, 2017, 30(4): 25-27.

[14] 沈亞芬, 杜偉鋒, 鄭敏霞, 等.HPLC同時測定野菊花中綠原酸、咖啡酸和蒙花苷的含量 [J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學, 2015, 32(9): 1117-1120.

[15] Yang H, Yang L, Yuan Y S,.A portable synthesis of water-soluble carbon dots for highly sensitive and selective detection of chlorogenic acid based on inner filter effect [J]., 2018, 189: 139-146.

[16] 張惠.姜黃素、綠原酸和硫胺素的熒光檢測新方法研究 [D].重慶: 西南大學, 2018.

[17] 李宏, 華建豪, 侯朝祥, 等.鋅摻雜碳量子點“關(guān)-開”型熒光探針檢測果蔬中谷胱甘肽的研究 [J].分析測試學報, 2019, 38(1): 52-57.

[18] Jiang J, He Y, Li S Y,.Amino acids as the source for producing carbon nanodots: Microwave assisted one-step synthesis, intrinsic photoluminescence property and intense chemiluminescence enhancement [J]., 2012, 48(77): 9634-9636.

[19] 李俊芬, 李鵬霞, 張琳, 等.關(guān)于碳點性能提升的研究進展 [J].分析科學學報, 2018, 34(3): 429-436.

[20] Li X, Yuan T, Zhao T,.An effective acid-base- induced liquid-liquid microextraction based on deep eutectic solvents for determination of testosterone and methyltestosterone in milk [J]., 2020, 58(9): 880-886.

[21] Wen J Q, Lu Y G, Shi L Y,.A novel cloud point extraction based on fatty acid deep eutectic solvent combined with high-performance liquid chromatography for determination of ultraviolet absorbent in food packaging bags [J]., 2020, 153: 104466.

[22] Gao Z, Li X, Shi L Y,.Deep eutectic solvents- derived carbon dots for detection of mercury (II), photocatalytic antifungal activity and fluorescent labeling for[J]., 2019, 220: 117080.

[23] 李志英, 閆慧云, 劉璐璐, 等.檸檬酸修飾熒光碳點的合成及對中草藥總黃酮的檢測 [J].化學研究與應(yīng)用, 2017, 29(9): 1352-1356.

[24] 徐源, 李春義, 趙海平.碳點的研究進展及其在鹿茸研究中應(yīng)用前景分析 [J].中草藥, 2020, 51(9): 2580-2586.

[25] 周巳祺, 席琳, 趙恒志, 等.基于己二胺修飾熒光碳點的中藥大黃素檢測研究 [J].化學試劑, 2016, 38(6): 536-538.

[26] 羅康.黃鐵礦和氟化鈣納米材料在中藥雜質(zhì)熒光檢測和制藥廢水處理中的應(yīng)用[D].廣州: 廣東藥科大學, 2020.

[27] Gao Z, Li X, Shi L Y,.Deep eutectic solvents-derived carbon dots for detection of mercury (II), photocatalytic antifungal activity and fluorescent labeling for C.albicans [J]., 2019, 220: 117080.

[28] Li Y M, Zhang X L, Zhu B C,.A highly selective colorimetric and “off-on-off” fluorescent probe for fluoride ions [J]., 2010, 26(10): 1077-1080.

[29] 王鑫, 李楠, 齊佳慧, 等.金銀花中綠原酸的提取工藝研究 [J].黑龍江大學工程學報, 2020, 11(3): 36-39.

[30] Chen J, Liu J, Li J,.One-pot synthesis of nitrogen and sulfur co-doped carbon dots and its application for sensor and multicolor cellular imaging [J]., 2016, 485: 167-174.

Preparation of carbon dot fluorescent probes and study on determination of chlorogenic acid in

LI Wan-yi1, LI Hong2, LI Qiu-lan3, YANG De-zhi3, YANG Ya-ling3

1.Research Institute of Medicinal Plants, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650205, China 2.Research Institute of Product Processing, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650033, China 3.Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Technology, Kunming 650500, China

In this study, chlorine and nitrogen doped carbon dots (Cl/N-CDs) were used as fluorescent probes.Based on the internal filtration effect between Cl/N-CDs and chlorogenic acid to quench Cl/N-fluorescence of CDs, a new method for fluorescence detection of chlorogenic acid has been established.The Cl/N-CDs was synthesized by one-step hydrothermal method using the eutectic solvent formed by choline chloride/urea and citric acid as raw materials.The optical properties, morphology and related groups of Cl/N-CDs were characterized by TEM, UV-vis, FT-IR, XRD and XPS.In the range of 0.47—62.70 μg/mL, the fluorescence quenching of Cl/N-CDs by chlorogenic acid showed a good linear relationship, and the detection limit of chlorogenic acid in the extract could reach 36 ng/mL.Among the different chlorogenic acid extraction methods, choline chloride/urea eutectic solvent used as the extractant has the highest extraction efficiency for chlorogenic acid in(LJF).The eutectic solvent is used as the raw material for carbon dot preparation and the chlorogenic acid extraction solvent, which can play the dual role of chlorogenic acid extraction and detection, and provide new research ideas for the quality evaluation of LJF.

chlorogenic acid;; chlorine and nitrogen doped carbon dots; fluorescent probe; eutectic solvent

R283.6

A

0253 - 2670(2022)05 - 1402 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.05.015

2021-09-04

云南省科技廳重大科技專項（202002AE320006-02-060）；云南主要外銷蔬菜綠色關(guān)鍵技術(shù)研究和集成示范（2019ZG001-3）；云南特色水果品質(zhì)提升與優(yōu)勢品牌創(chuàng)建（2019ZG002）；農(nóng)產(chǎn)品加工團隊培育（202002AE320007-03）

李晚誼（1965—），女，云南昆明人，研究員，主要從事食品加工及食品安全等方面的研究。

通信作者：楊亞玲（1964—），女，云南昆明人，教授，主要從事分析化學等方面的研究。

[責任編輯 鄭禮勝]