補(bǔ)骨脂炮制前后水煎液致雌性ICR小鼠膽汁瘀積性肝損傷作用比較

符映均，吳 育, ，梅春梅，華政穎，李偉東*

補(bǔ)骨脂炮制前后水煎液致雌性ICR小鼠膽汁瘀積性肝損傷作用比較

符映均1，吳 育1, 2，梅春梅2，華政穎2，李偉東2*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)南通附屬醫(yī)院藥劑科，江蘇 南通 226000 2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，江蘇 南京 210023

探討補(bǔ)骨脂炮制前后致雌性ICR小鼠膽汁瘀積性肝損傷的差異。采用高效液相色譜儀檢測(cè)補(bǔ)骨脂炮制前后化學(xué)成分含量變化。雌性ICR小鼠連續(xù)30 d ig生、鹽補(bǔ)骨脂水煎液，末次給藥24 h后，取血清，采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)肝損傷相關(guān)指標(biāo)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性和總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBIL）、總膽汁酸（total bile acid，TBA）水平；取肝臟、脾臟和腎臟，稱定質(zhì)量并計(jì)算臟器指數(shù)，采用蘇木素-伊紅（HE）染色法進(jìn)行肝臟病理組織學(xué)檢查；采用ELISA法檢測(cè)血清中雌二醇（estradiol，E2）、促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）以及肝臟中法尼醇受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）、雌激素硫酸轉(zhuǎn)移酶1E1（sulfotransferase 1E1，SULT1E1）和E2含量。補(bǔ)骨脂經(jīng)鹽炙后補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、新補(bǔ)骨脂異黃酮含量下降，其余8種成分含量均升高，其中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、corylifol A升高較為明顯。雌性小鼠ig生、鹽補(bǔ)骨脂水煎液30 d后出現(xiàn)生殖器損傷，小鼠陰道口紅腫，有水樣浸潤(rùn)。與對(duì)照組比較，生、鹽補(bǔ)骨脂組小鼠血清ALT、AST、ALP活性及DBIL、TBIL、TBA水平均顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），鹽炙后補(bǔ)骨脂致肝損傷較生品更嚴(yán)重；肝臟FXR、SULT1E1含量顯著降低（＜0.01、0.001），血清E2、FSH、IL-6和肝臟E2含量均顯著升高（＜0.05、0.01、0.001）。鹽補(bǔ)骨脂與生補(bǔ)骨脂比較，IL-6升高更明顯，F(xiàn)XR、SULT1E1下降更明顯。補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和Corylifol A可能是補(bǔ)骨脂藥效成分同時(shí)也可能是其主要毒性成分，鹽補(bǔ)骨脂較生補(bǔ)骨脂更易造成肝損傷。

補(bǔ)骨脂；鹽炙；膽汁瘀積性肝損傷；雌激素樣作用；補(bǔ)骨脂素；異補(bǔ)骨脂素；corylifol A；補(bǔ)骨脂苷；異補(bǔ)骨脂苷；新補(bǔ)骨脂異黃酮

補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂L.的干燥成熟果實(shí)，在我國(guó)臨床上應(yīng)用已有上千年的歷史。補(bǔ)骨脂作為傳統(tǒng)的補(bǔ)陽(yáng)藥，具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、固精縮尿、溫脾止瀉的功效，其生品味辛、苦，性溫，鹽炙后能和其辛竄溫燥之性，并引藥入腎?！吨袊?guó)藥典》2020年版一部記載鹽補(bǔ)骨脂的炮制方法，取凈補(bǔ)骨脂，照鹽炙法（通則0213）炒至微鼓起。古代補(bǔ)骨脂主要用于治療腎虛腰痛、小便頻數(shù)、小兒遺尿、腎漏，現(xiàn)代多用于抗腫瘤、抗菌、治療骨質(zhì)疏松等。古代文獻(xiàn)中僅有關(guān)于其燥性的描述，《雷公炮炙論》云：“性本大燥，毒?！毖a(bǔ)骨脂經(jīng)鹽炙入藥，古云“鹽制入腎”，經(jīng)炮制后補(bǔ)骨脂的療效增強(qiáng)。目前以補(bǔ)骨脂為主藥生產(chǎn)的制劑有仙靈骨葆膠囊、白蝕丸、復(fù)方補(bǔ)骨脂顆粒、青娥丸等，常作為植物雌激素治療更年期綜合征。但隨著臨床的推廣使用，補(bǔ)骨脂的肝毒性逐漸被人發(fā)現(xiàn)，并伴隨著相關(guān)的臨床和實(shí)驗(yàn)研究[1-4]，其肝毒性愈發(fā)受人重視。

劉亞蕾等[5]收集了2012—2016年含補(bǔ)骨脂的制劑的藥物性肝損傷共110個(gè)病例，有91例是由補(bǔ)骨脂引起的肝損傷（占肝損總病例數(shù)82.72%）；89.01%患者年齡在41歲以上，且女性居多，占參與調(diào)查的肝損所有患者的60.9%，具有明顯的性別差異。Nam等[6]回顧分析40例補(bǔ)骨脂所致肝損病例發(fā)現(xiàn)，約85.0%患者為女性，年齡集中在54～70歲，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）和直接膽紅素（direct bilirubin，DBIL）含量均顯著升高，補(bǔ)骨脂造成的肝損傷多表現(xiàn)為肝細(xì)胞損傷，停藥后6個(gè)月內(nèi)痊愈，沒(méi)有出現(xiàn)終末期肝病或死亡。

蔡濤濤等[7]按25 mL/kg給予小鼠補(bǔ)骨脂全粉，發(fā)現(xiàn)鹽炙后Na+改變腸道滲透壓，增大了小鼠腸道對(duì)補(bǔ)骨脂全組分的吸收，毒性作用增強(qiáng)，且補(bǔ)骨脂毒性強(qiáng)度與不同炮制品種含補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素含量成正相關(guān)。夏亞楠等[8]以腎陽(yáng)虛、脾虛大鼠為研究模型，連續(xù)7 d按7 g/kg ig補(bǔ)骨脂生品、水炙品、鹽炙品補(bǔ)骨脂提取液，得出相反結(jié)論，提示鹽炙后可以降低肝毒性。陶益等[9]研究表明，酒炙和鹽炙后補(bǔ)骨脂酚含量較生品下降，而補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量顯著升高。且有報(bào)道雌性小鼠更易造成肝損傷[10]。為了進(jìn)一步探究鹽制補(bǔ)骨脂的肝毒性，本研究首先檢測(cè)補(bǔ)骨脂炮制前后化學(xué)成分差異，再將生補(bǔ)骨脂、鹽補(bǔ)骨脂水煎液分別ig給藥30 d，探究其對(duì)雌性ICR小鼠的肝毒性。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雌性ICR小鼠，14～16周齡，體質(zhì)量32～36 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（LU）2016-0001，置于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室設(shè)施中，標(biāo)準(zhǔn)光照/黑暗周期為12 h。所有接受人道關(guān)懷和治療的動(dòng)物均符合《中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理立法規(guī)定和一般建議》，并由南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理證號(hào)202004A037）。

1.2 藥品與試劑

補(bǔ)骨脂（批號(hào)191101，云南大理）購(gòu)自北京同仁堂，由南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為豆科植物補(bǔ)骨脂L.的干燥成熟果實(shí)，標(biāo)本編號(hào)（1804058）保存于南京中醫(yī)藥大學(xué)植物標(biāo)本館；對(duì)照品4′--甲基補(bǔ)骨脂查耳酮（批號(hào)120415）、補(bǔ)骨脂甲素（批號(hào)101026）、Corylifol A（批號(hào)110117）、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚（批號(hào)110502）、補(bǔ)骨脂寧（批號(hào)120612）、新補(bǔ)骨脂異黃酮（批號(hào)110409）、補(bǔ)骨脂寧（批號(hào)120216）、補(bǔ)骨脂苷（批號(hào)120612）、異補(bǔ)骨脂苷（批號(hào)120603）、補(bǔ)骨脂素（批號(hào)120307）、異補(bǔ)骨脂素（批號(hào)120308）購(gòu)自南京世洲生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為98%；小鼠法尼醇受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）試劑盒（批號(hào)ANG-E22041M）、小鼠白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）試劑盒（批號(hào)ANG-E22036M）、小鼠雌二醇（estradiol，E2）試劑盒（批號(hào)ANG-E21444M）、小鼠促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）試劑盒（批號(hào)ANG-E22036M）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；小鼠雌激素硫酸轉(zhuǎn)移酶1E1（sulfotransferase 1E1，SULT1E1）試劑盒（批號(hào)832X724744）購(gòu)自南京奧青生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器

e2695型高效液相色譜儀（HPLC，美國(guó)Allince公司）；Microfuge 22R型離心機(jī)、AU680型全自動(dòng)生化儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）；680型酶標(biāo)分光光度讀板儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；DM1L型倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司）。

2 方法

2.1 鹽炙補(bǔ)骨脂

鹽補(bǔ)骨脂按照《中國(guó)藥典》2020年版鹽炙法（通則0213）標(biāo)準(zhǔn)炮制加工。取凈補(bǔ)骨脂，噴淋適量鹽水，拌勻，悶潤(rùn)3～6 h，至鹽水被吸盡，置已加熱炒制容器內(nèi)，用文火炒至表面未鼓起，并有香氣溢出時(shí)，取出，晾涼，即得。

2.2 補(bǔ)骨脂生品及鹽制品11種化學(xué)成分的含量測(cè)定[11]

2.2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～3 min，5% A；3～15 min，5%～15% A；15～25 min，15%～18% A；25～35 min，18%～35% A；35～50 min，35%～40% A；50～55 min，40%～50% A；55～70 min，50%～100% A；70～88 min，100%～5% A；88～90 min，5% A；體積流量為1 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品（表1），1、3、4～7號(hào)置于10 mL量瓶，2、8～11號(hào)置于5 mL量瓶，精密加入甲醇定容，超聲5 min，經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，放入液相小瓶，進(jìn)樣測(cè)定。

表1 對(duì)照品配制信息

2.2.3 供試品溶液的制備 稱取補(bǔ)骨脂生品及鹽制品各50 g，打粉，過(guò)4號(hào)篩，精密稱取10 g（3份），至砂鍋中，量取超純水150 mL，煎煮30 min，煎煮2次，合并濾液，濃縮至100 mL；精密量取1 mL，加入1 mL無(wú)水乙醇，12 000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，放入液相小瓶，進(jìn)樣測(cè)定。

2.3 補(bǔ)骨脂生品及鹽制品肝毒性研究

2.3.1 生、鹽補(bǔ)骨脂水煎液的制備 分別取140 g生補(bǔ)骨脂、鹽補(bǔ)骨脂，按傳統(tǒng)煎煮方法煎煮，第1次加8倍量水煎煮，第2次加6倍量水煎煮，煎煮液濃縮至200 mL，冷凍干燥處理，制成凍干粉，用于后續(xù)毒性試驗(yàn)，臨床等效劑量按5倍劑量等比稀釋，即得。

2.3.2 動(dòng)物分組及給藥 在確定補(bǔ)骨脂各組分含量符合《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定后，按傳統(tǒng)方法煎煮補(bǔ)骨脂進(jìn)行后續(xù)毒性試驗(yàn)。將雌性ICR小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組及生補(bǔ)骨脂低、高劑量（5、20 g/kg）組和鹽補(bǔ)骨脂低、高劑量（5、20 g/kg）組，每組6只，各給藥組ig相應(yīng)藥物，對(duì)照組ig等體積0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)30 d。

2.3.3 血清生化檢測(cè) 末次給藥24 h后，小鼠經(jīng)眼后靜脈取血，4 ℃、1000×離心10 min，分離得到上清液，于?80 ℃保存。采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清中ALT、AST、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性和DBIL、TBIL、總膽汁酸（total bile acid，TBA）水平。

2.3.4 組織病理學(xué)檢查 各組小鼠脫頸椎處死，于9: 00～10: 00時(shí)取肝臟，以減少藥物代謝酶基因表達(dá)的變化。稱定肝臟、腎臟、脾臟質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)＝器官質(zhì)量×1000/體質(zhì)量

將10%多聚甲醛固定肝組織，洗滌、脫水，進(jìn)行石蠟包埋，切片干燥后用二甲苯脫臘，再用梯度酒精脫苯，蒸餾水復(fù)水，最后用蘇木素-伊紅（HE）染色，于光鏡下觀察。

2.3.5 ELISA法檢測(cè)血清中E2、FSH、IL-6和肝臟中FXR、SULT1E1、E2含量 取于?80 ℃保存的血清及肝臟，將肝臟用PBS溶液勻漿，按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中E2、FSH、IL-6及肝臟中FXR、SULT1E1、E2含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 生、鹽補(bǔ)骨脂的化學(xué)成分含量比較

如圖1和表2所示，鹽補(bǔ)骨脂相較于生補(bǔ)骨脂，除補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷和新補(bǔ)骨脂異黃酮含量降低外，4′--甲基補(bǔ)骨脂查耳酮、補(bǔ)骨脂甲素、corylifol A、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂寧、補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量均有上升。

1-補(bǔ)骨脂苷 2-異補(bǔ)骨脂苷 3-補(bǔ)骨脂素 4-異補(bǔ)骨脂素 5-新補(bǔ)骨脂異黃酮 6-補(bǔ)骨脂甲素 7-補(bǔ)骨脂寧 8-補(bǔ)骨脂定 9-補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚 10-corylifol A 11-4′-O-甲基補(bǔ)骨脂查耳酮

表2 生、鹽補(bǔ)骨脂各成分含量(, n = 6)

Table 2 Contents of components in raw and salt processed Psoraleae Fructus (, n = 6)

表2 生、鹽補(bǔ)骨脂各成分含量(, n = 6)

樣品成分/(μg·mL?1) 4′-O-甲基補(bǔ)骨脂查爾酮補(bǔ)骨脂甲素corylifol A補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚補(bǔ)骨脂寧新補(bǔ)骨脂異黃酮 生補(bǔ)骨脂4.84±0.1818.50±2.1858.78±1.0224.30±0.177.37±0.1824.79±0.54 鹽補(bǔ)骨脂5.77±0.5821.32±3.4869.11±9.7326.49±3.709.89±3.5223.36±6.07 樣品成分/(μg·mL?1) 補(bǔ)骨脂定補(bǔ)骨脂苷異補(bǔ)骨脂苷補(bǔ)骨脂素異補(bǔ)骨脂素 生補(bǔ)骨脂13.44±1.27804.21±12.11497.43±10.27259.10±5.80244.15±4.75 鹽補(bǔ)骨脂17.23±1.48687.82±82.55398.91±47.11278.76±39.00262.50±36.62

3.2 生、鹽補(bǔ)骨脂對(duì)ICR小鼠表觀的影響

如圖2所示，雌性小鼠ig生、鹽補(bǔ)骨脂30 d后，均出現(xiàn)生殖器損傷，雌性小鼠陰道口紅腫，有水樣浸潤(rùn)，且鹽補(bǔ)骨脂組較生補(bǔ)骨脂組更為嚴(yán)重。

3.3 生、鹽補(bǔ)骨脂對(duì)ICR小鼠血清中ALT、AST、ALP活性和DBIL、TBIL、TBA水平的影響

如圖3所示，與對(duì)照組比較，生、鹽補(bǔ)骨脂各劑量組血清中ALT、AST、ALP活性和TBIL、TBA水平均顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），生補(bǔ)骨脂高劑量組及鹽補(bǔ)骨脂各劑量組血清中DBIL水平顯著升高（＜0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)性。比較生補(bǔ)骨脂和鹽補(bǔ)骨脂高劑量組，血清中ALT、ALP活性和TBIL、TBA水平有顯著性差異（＜0.05、0.01、0.001）；比較生補(bǔ)骨脂和鹽補(bǔ)骨脂低劑量組，血清DBIL、TBIL水平有顯著性差異（＜0.01）；表明鹽補(bǔ)骨脂較生補(bǔ)骨脂造成ICR小鼠肝損傷更為嚴(yán)重。

3.4 生、鹽補(bǔ)骨脂對(duì)ICR小鼠臟器指數(shù)的影響

如表3所示，雌性小鼠ig生、鹽補(bǔ)骨脂30 d后，與對(duì)照組比較，肝臟指數(shù)較脾臟、腎臟指數(shù)改變更為明顯，鹽補(bǔ)骨脂高劑量組肝臟、脾臟、腎臟指數(shù)較生補(bǔ)骨脂高劑量組有顯著性差異（＜0.05、0.01）。

圖2 生、鹽補(bǔ)骨脂對(duì)ICR小鼠表觀的影響

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與生補(bǔ)骨脂低劑量組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與生補(bǔ)骨脂高劑量組比較：△P＜0.05 △△P＜0.01 △△△P＜0.001，圖5同

表3 生、鹽補(bǔ)骨脂對(duì)ICR小鼠臟器指數(shù)的影響(, n = 6)

Table 3 Effect of raw and salt processed Psoraleae Fructus on organ index of ICR mice (, n = 6)

表3 生、鹽補(bǔ)骨脂對(duì)ICR小鼠臟器指數(shù)的影響(, n = 6)

組別劑量/(g·kg?1)肝臟指數(shù)/(mg·g?1)脾臟指數(shù)/(mg·g?1)腎臟指數(shù)/(mg·g?1) 對(duì)照—34.79±4.843.72±0.8310.06±0.54 生補(bǔ)骨脂535.99±3.913.19±0.6410.03±0.60 2036.32±6.43*3.47±1.009.82±1.74 鹽補(bǔ)骨脂535.58±2.753.01±0.2510.18±0.42 2041.40±5.22**△△5.58±2.70***△△11.11±1.15*△

與對(duì)照組比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001；與生補(bǔ)骨脂高劑量組比較：△＜0.05△△＜0.01

*< 0.05**< 0.01***< 0.001control group;△< 0.05△△< 0.01rawhigh-dose group

3.5 生、鹽補(bǔ)骨脂對(duì)ICR小鼠肝組織病理變化的影響

如圖4所示，各給藥組雌性小鼠肝組織均有不同程度的水腫和炎癥浸潤(rùn)，鹽補(bǔ)骨脂組小鼠肝細(xì)胞水腫更為明顯，鹽補(bǔ)骨脂低劑量組輕度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，鹽補(bǔ)骨脂高劑量組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)更為嚴(yán)重；生補(bǔ)骨脂、鹽補(bǔ)骨脂高劑量組部分出現(xiàn)脂肪變性，明顯水腫，疑似枯發(fā)細(xì)胞增多。

圖4 生、鹽補(bǔ)骨脂對(duì)ICR小鼠肝組織病理變化的影響 (×200)

3.6 生、鹽補(bǔ)骨脂對(duì)ICR小鼠血清中E2、FSH、IL-6和肝臟中FXR、SULT1E1、E2含量的影響

如圖5所示，與對(duì)照組比較，生、鹽補(bǔ)骨脂各劑量組小鼠血清中E2、FSH和肝臟中E2含量均顯著升高（＜0.01、0.001），肝臟中FXR含量顯著降低（＜0.01、0.001）；生補(bǔ)骨脂低劑量組和鹽補(bǔ)骨脂各劑量組小鼠血清中IL-6含量顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），鹽補(bǔ)骨脂高劑量組肝臟SULT1E1含量顯著降低（＜0.01）。比較生補(bǔ)骨脂和鹽補(bǔ)骨脂高劑量組，血清IL-6和肝臟SULT1E1含量有顯著差異（＜0.05）；比較生補(bǔ)骨脂和鹽補(bǔ)骨脂低劑量組，肝臟FXR含量有顯著差異（＜0.05）。

圖5 生、鹽補(bǔ)骨脂對(duì)ICR小鼠血清中E2、FSH、IL-6和肝臟中FXR、SULT1E1、E2含量的影響

4 討論

《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定補(bǔ)骨脂含補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的總量不得少于0.70%。本研究采用HPLC測(cè)定生、鹽補(bǔ)骨脂水煎液各成分含量[11]，得出鹽炙后補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷和新補(bǔ)骨脂異黃酮相較于生品略有降低，其余檢測(cè)出的8個(gè)成分如補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素等含量均有提升。梁燦璨等[12]認(rèn)為補(bǔ)骨脂鹽制后毒性降低，SD大鼠ig生、鹽補(bǔ)骨脂7 d，大鼠血清中ALT、AST活性降低，表明補(bǔ)骨脂鹽炙后可緩解藥物對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠肝腎功能的不良反應(yīng)，同時(shí)緩解生品的燥性，鹽炙對(duì)藥物燥性的緩解作用可能與其對(duì)體內(nèi)水通道蛋白（aquaporin，AQP）表達(dá)調(diào)控有關(guān)。補(bǔ)骨脂酒炙后其主要肝毒性成分補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量均比生品降低[13]。有學(xué)者認(rèn)為，雷公炮制法使用黃酒對(duì)補(bǔ)骨脂進(jìn)行炮制，與現(xiàn)代常用的2種鹽炙法比較，補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷和補(bǔ)骨脂酚下降更為明顯，水處理主要促進(jìn)苷類成分降解[14]。陶益等[9]研究表明，酒炙和鹽炙后補(bǔ)骨脂酚含量較生品下降，而補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量顯著升高，與本研究結(jié)果相似。

補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素可能既是補(bǔ)骨脂有效成分，補(bǔ)骨脂鹽炙后存在增強(qiáng)功效的作用，同時(shí)也是其毒性成分。Wang等[15]報(bào)道了ig補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素（40、80 mg/kg）后，Wistar大鼠體內(nèi)同種藥物同等劑量下雌鼠的肝損傷程度更為嚴(yán)重，且異補(bǔ)骨脂素比補(bǔ)骨脂素的肝毒性更大；補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素可抑制大鼠肝臟膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）、膽酸鹽外排泵（bile salt export pump，BSEP）、多藥耐藥相關(guān)蛋白2（multidrug resistance associated protein 2，MRP2）和SULT2A1的表達(dá)，增加FXR和MRP3的表達(dá)，且大鼠出現(xiàn)多器官毒性，膽汁瘀積性肝損傷較明顯。另有報(bào)道指出，大劑量異補(bǔ)骨脂素（25、50、100 mmol/L）可使斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝臟產(chǎn)生大量空泡結(jié)構(gòu)，異補(bǔ)骨脂素通過(guò)抑制藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致體內(nèi)異補(bǔ)骨脂素的積累和抗氧化能力的下降，從而導(dǎo)致肝臟損傷[16]。補(bǔ)骨脂酚同樣也是補(bǔ)骨脂毒性成分之一，大鼠ig補(bǔ)骨脂酚（52.5、262.5 mg/kg）6周，AST、ALT升高，、羥甲基戊二酸單酰輔酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA，）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor α，）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-2（sterol regulatory element binding protein-2，）mRNA表達(dá)降低，補(bǔ)骨脂酚（52.5 mg/kg）組BSEP表達(dá)升高，補(bǔ)骨脂酚（262.5 mg/kg）組BSEP表達(dá)降低，補(bǔ)骨脂酚可引起膽汁瘀積性肝毒性，其機(jī)制可能與影響肝臟脂質(zhì)代謝有關(guān)[17]。以上提示補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和補(bǔ)骨脂酚可能是補(bǔ)骨脂藥效成分同時(shí)也可能是其主要毒性成分，而古代人們更注重其藥效忽視其毒性。結(jié)合本研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)鹽炙后膽汁瘀積性肝損癥狀更為明顯。

臨床主要采用鹽炙補(bǔ)骨脂水煎液，其主要入血成分是補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷，其次是補(bǔ)骨脂二氫黃酮及補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚，而補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷可通過(guò)體內(nèi)胃腸微環(huán)境轉(zhuǎn)化為補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素[18-19]。補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂酚、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素具有顯著的植物雌激素樣活性[20]。目前越來(lái)越多的證據(jù)顯示雌激素與膽汁瘀積的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[21]，雌激素替代治療骨質(zhì)疏松易產(chǎn)生肝毒性，膽管炎患者肝臟代謝雌激素水平增高。膽汁酸代謝、肝臟脂質(zhì)代謝均與雌激素相關(guān)，臨床女性膽固醇結(jié)石的發(fā)病率是男性的4倍，雌激素致肝膽疾病越來(lái)越引起人們的重視。FSH能夠促進(jìn)卵泡的發(fā)育和成熟，并且能促進(jìn)排卵，它的產(chǎn)生受下丘腦促性腺釋放激素的控制，同時(shí)受雌激素E2的反饋調(diào)控。結(jié)果顯示，小鼠ig補(bǔ)骨脂后雌激素E2、FSH水平均升高，表明植物雌激素樣物質(zhì)對(duì)肝損傷有一定的作用。

IL-6能夠調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，在機(jī)體的抗感染免疫反應(yīng)中起重要作用。生、鹽補(bǔ)骨脂組IL-6升高，其中鹽補(bǔ)骨脂高劑量組與生補(bǔ)骨脂組相比，炎癥水平更高。FXR通路可以調(diào)控人體膽汁酸合成排泄和膽汁酸的正常循環(huán)。生補(bǔ)骨脂組和鹽補(bǔ)骨脂組肝組織FXR含量均顯著下降，且鹽補(bǔ)骨脂較生補(bǔ)骨脂下降更為明顯。硫酸化反應(yīng)是雌激素代謝的主要途徑，SULT1E1是該反應(yīng)的關(guān)鍵酶，與對(duì)照組比較，鹽補(bǔ)骨脂高劑量組肝組織SULT1E1含量明顯下降，提示過(guò)量雌激素不能及時(shí)通過(guò)SULT1E1進(jìn)行滅活，鹽補(bǔ)骨脂與生補(bǔ)骨脂具有顯著差異。

從中藥臨床運(yùn)用特點(diǎn)著手，研究臨床不良反應(yīng)發(fā)生的可能機(jī)制，從而更有效監(jiān)測(cè)臨床用藥，是從實(shí)踐中來(lái)，回歸于實(shí)踐中去，本研究表明補(bǔ)骨脂有效成分同時(shí)也是毒性成分，且產(chǎn)生肝損傷作用與其含有的植物雌激素樣成分有關(guān)，而鹽補(bǔ)骨脂可能更易引起膽汁瘀積性肝損傷。但本研究缺乏平行考察補(bǔ)骨脂不同炮制方法對(duì)成分的影響。目前針對(duì)補(bǔ)骨脂的不良反應(yīng)機(jī)制的研究主要集中在單體研究，對(duì)單一成分肝毒性較為深入?yún)s忽略了補(bǔ)骨脂不同成分之間是否存在相互作用，缺乏整體性，其毒性成分的復(fù)雜性、效毒相關(guān)性以及與雌激素的深層聯(lián)系有待進(jìn)一步研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study of cholestatic liver injury in female ICR mice by decoction ofbefore and after processing

FU Ying-jun1, WU Yu1, 2, MEI Chun-mei2, HUA Zheng-ying2, LI Wei-dong2

1.Department of Pharmacy, Nantong Hospital to Nanjing University of Chinese Medicine, Nantong 226000, China 2.Engineering Center of State Ministry of Education for Standardization of Chinese Medicine Processing, Jiangsu Provincial Key Laboratory of Chinese Medicine Processing, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

To investigate the difference of cholestatic liver injury in female ICR mice induced by raw and salt processed Buguzhi ().The changes of chemical constituents before and after processing ofwere detected by high performance liquid chromatography.Female ICR mice were continuously given raw and salt processedwater decoction for 30 d, and 24 h after last administration, serum was collected, automatic biochemical analyzer was used to detect liver injury-related indicators alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatase (ALP) activities and total bilirubin (TBIL), direct bilirubin (DBIL), total bile acid (TBA) levels.Liver, spleen and kidney were taken and weighed, organ index was calculated; Hematoxylin-eosin (HE) staining was used for liver histopathological examination; ELISA was used to detect contents of estradiol (E2), follicle-stimulating hormone (FSH), interleukin-6 (IL-6) in serum and farnesoid X receptor (FXR), estrogen sulfate Transferase 1E1 (SULT1E1), E2 in liver.After salt processed, the contents of psoralen, isopsoralen and neobavaisoflavone were decreased, and other eight components contents were increased, among which psoralen, isopsoralen and corylifol A were significantly increased.The genitals of female mice were damaged after ig raw and salt processedwater decoction for 30 d, vaginal mouth of mice was red and swollen with watery infiltration.Compared with control group, ALT, AST, ALP activities and DBIL, TBIL, TBA levels in serum of mice in raw and salt processedgroups were significantly increased (< 0.05, 0.01, 0.001), liver injury of salt processedwas more serious than that of.The contents of FXR and SULT1E1 in liver were significantly decreased (< 0.01, 0.001), and contents of E2, FSH, IL-6 in serum and E2 in liver were significantly increased (< 0.05, 0.01, 0.001).Compared with, IL-6 content in salt processedgroup was significantly increased, and FXR and SULT1E1 contents were decreased more obviously.Psoralen, isopsoralen and Corylifel A may be active components and main toxic components of, salt processedis more likely to cause liver damage than raw.

; salt processed; cholestatic liver injury; estrogen-like effects; psoralen; isopsoralen; corylifel A; psoralen; isopsoralen; neobavaisoflavone

R285.5

A

0253 - 2670(2022)05 - 1434 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.05.018

2021-11-10

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（8177390）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81973484）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFC1707000）；2021年江蘇省研究生科研與實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（KYCX21_1754)

符映均，碩士，從事中藥學(xué)研究。E-mail: woshifyj1987@163.com

通信作者：李偉東，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥炮制、中藥藥效研究。E-mail: liweidong0801@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]