光照調控優(yōu)質肉雞性成熟的轉錄組分析

王錢保， 姜潤深， 黎壽豐， 黃華云， 李春苗， 黃正洋， 郭 興， 趙振華

(1.中國農業(yè)科學院家禽研究所，江蘇揚州 225003；2.安徽農業(yè)大學，安徽合肥 230000)

近年來，為分析密閉式雞舍多環(huán)境因子對雞生產性能的影響，專家們紛紛提出了基于雞舍環(huán)境因子與生產性能相互影響的參數(shù)回歸模型，其中，對于光照因素影響雞性成熟的研究成為時下熱點。光周期的變化衍生不同的內在生物節(jié)律，兩者同步性對雞性成熟產生影響。有研究指出，隨光照模式的正向適度增加，雞群生長和性器官發(fā)育均正向上升。潘棟研究表明，雞體性成熟啟動受光照時間和強度影響的同時，還與其是否符合雞某一特定生長周期的晝夜生理節(jié)律相關。優(yōu)質肉雞的性成熟是一個體內多循環(huán)多通路協(xié)同合作的過程，目前對于參與觸發(fā)性成熟啟動的物質和相關機制仍處于不斷完善之中，經驗證可能有多種物質和信號通路參與其中。近年，隨著雞基因組測序的不斷深化及高通量測序、分析技術快速發(fā)展，RNA-seq分析優(yōu)質肉雞在不同光照模式下性成熟期差異基因mRNA表達水平變化及其調控機制成為可能。因此，本研究在前期研究基礎上，擬通過 RNA-seq 技術方法，揭示光照對優(yōu)質肉雞性成熟的分子調控機理，從而改善優(yōu)質肉雞生產繁殖性能，全面推動優(yōu)質肉雞產業(yè)優(yōu)化升級。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及分組

2019年4月2日，挑選健康的來自江蘇省家禽科學研究所自主培育的品系F系0日齡母雞540羽，該品系群體生長整齊度高、性能優(yōu)良。按每組180羽雞隨機分成3組(對照組CK、試驗組T1和T2)，放于江蘇省家禽科學研究所邵伯基地試驗禽場內的3間密閉式雞舍地面平養(yǎng)。各組雞均在同一飼養(yǎng)條件統(tǒng)一執(zhí)行優(yōu)質肉雞營養(yǎng)需求和一般免疫程序，全期自由采食和飲水。

1.2 試驗方法

3組雞試驗在0～84日齡設計3種不同的光照模式，光照方案詳見表1。由表1可知，試驗周期為12周。于12周齡末時，每組采集3羽平均體質量雞下丘腦組織樣本放入無酶凍存管，編號后迅速放入液氮中保存，用于提取組織RNA進行RNA-Seq分析。Ⅰ組樣品編號為CK-1、CK-2、CK-3，Ⅱ組樣品編號為T1-1、T1-2、T1-3，Ⅲ組樣品編號為T2-1、T2-2、T2-3。

表1 3 組優(yōu)質肉雞光照方案

1.3 轉錄組測序

1.3.1 RNA樣本制備 采用Trizol法分別提取9個樣品的下丘腦組織RNA，分別采用Nanodrop、Qubit2.0、Aglient 2100方法檢測RNA樣品的純度、濃度和完整性等，以保證使用合格的樣品進行轉錄組測序。通過常規(guī)試劑盒去除rRNA，將mRNA富集。進一步將富集得到的mRNA反轉錄形成雙鏈cDNA，修復cDNA雙末端后加上接頭，PCR擴增構建上機文庫。

1.3.2 文庫制備 通過帶有Oligo(dT)的磁珠富集具有polyA尾巴的真核mRNA后，采用超聲波把mRNA打斷，以片段化的mRNA為模版，隨機寡核苷酸為引物，在M-MuLV逆轉錄酶體系中合成cDNA第一條鏈，隨后用RNaseH降解RNA鏈，并在DNA polymeraseⅠ體系下，以dNTPs為原料合成cDNA第二條鏈。純化后的雙鏈cDNA經過末端修復，加A尾并連接測序接頭，采用AMPure XP beads篩選200 bp左右的cDNA，進行PCR擴增并再次使用AMPure XP beads純化PCR產物，最終獲得文庫。

1.3.3 文庫質檢和Illumina測序 為保證測序質量利用瓊脂糖凝膠電泳分析樣品RNA完整性及是否存在DNA污染；利用Nano Photometer spectrophotometer檢測RNA純度；利用Qubit2.0 Fluorometer進行RNA濃度精確定量利用Agilent 2100 bioanalyzer精確檢測RNA完整性。為保證數(shù)據質量，要在信息分析前對原始數(shù)據進行數(shù)據過濾，過濾低質量數(shù)據以減少無效數(shù)據所帶來的分析干擾，得到clean reads。文庫質檢合格后，交由基迪奧生物公司使用HiSeq2000測序儀(Illumina)進行轉錄組測序。

1.4 數(shù)據處理和統(tǒng)計分析

利用DESeq 2軟件對基因表達水平進行分析，得到reads count數(shù)據，進行數(shù)據標準化(normalization)，根據模型進行假設檢驗概率(pvalue)計算，最后進行多重假設檢驗校正，得到FDR值(錯誤發(fā)現(xiàn)率)，最終得到組間的差異分析結果。使用R語言中的goseq包(12)將mRNA差異表達基因序列與GO(gene ontology)數(shù)據庫進行比對分析，獲得GO功能注釋；將mRNA差異表達基因與KEGG(kyotoencyclopedia of genes and genomes)數(shù)據庫進行BLASTX比對獲得mRNA差異表達基因相對應的Pathway注釋信息。

2 結果與分析

2.1 質控與數(shù)據總體分析

本研究對3組雞下丘腦轉錄組測序，由表2可知，測序數(shù)據統(tǒng)計與序列比對分析結果，9個樣品均獲得了54×10條 reads以上，總堿基數(shù)5 Gb左右，Q20在98%以上，Q30在95%以上，說明RNA-seq測序結果可靠，可用于后續(xù)分析。樣品比對到參考基因組上的reads均達總reads數(shù)約90%，比對率均較高。由表3可知，與所選雞的參考基因組序列比較，共發(fā)掘新基因684個，其中，10個基因得到功能注釋。

表2 3組測序數(shù)據統(tǒng)計與序列比對分析

表3 3組基因檢測情況

2.2 樣本關系分析

使用皮爾遜相關系數(shù)對樣品進行相關性分析，由圖1可知，試驗組組間3個生物學重復的決定系數(shù)()均大于0.95，對照組組間的決定系數(shù)()均在0.91以上，表明樣品組成相似性高，分析結果相關性較強。

2.3 差異基因整體分析

基于差異分析結果，篩選FDR<0.05 且 log|FC|>1 的基因為顯著差異基因，由圖2可知，各比較組顯著差異基因整體統(tǒng)計，對照組與試驗組T1、T2及試驗組T1與T2間的mRNA顯著差異表達基因數(shù)量均不超過21個，但對照組與試驗組T2的mRNA顯著差異表達基因數(shù)量超過189個，相比于對照組，試驗T2組有111個基因上調表達、78個基因下調表達。差異表達基因聚類分析結果見圖3。由圖3可知，大多數(shù)基因聚集在同一大類上，提示這些差異表達的基因具有特定的功能相關性。

2.4 差異基因GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析

分別對3組雞組織的上調差異基因、下調差異基因進行GO分析和KEGG信號通路富集分析，對照組和試驗組T1、T2分別富集到36個和45個顯著GO條目。由圖4可知，其中，富集較多的GO功能是正負調控的生物過程、信號傳遞、細胞分解過程、新陳代謝過程、脂質代謝相關過程和免疫相關過程。其中，信號傳導、機體新陳代謝及細胞過程在機體性成熟過程富集到了多個上調或下調基因，由表4可知，其中表達最為顯著的有抑制性神經遞質的褪黑素受體基因()、興奮性神經遞質瘦素受體基因()、影響中樞神經系統(tǒng)中最主要的神經遞質多巴胺受體基因()等。

表4 優(yōu)質肉雞差異基因GO功能富集情況

由圖5可知，KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)有5條顯著富集的KEGG信號通路，分別為機體新陳代謝、組織代謝、細胞分解過程、內環(huán)境信息表達、基因表達過程通路。這些通路相互作用、相互影響，共同參與了機體的生長發(fā)育、性成熟等生命周期活動。

3 討論

近年，轉錄組測序技術不斷深化，家禽測序體量和質量都有巨大提升。本研究測序獲得的原始序列均超過54×10條，總堿基數(shù)6 Gb左右，Q20堿基在98%以上，Q30堿基在95%以上，測序數(shù)據質量較高。與所選雞的參考基因組序列進行對比，共發(fā)掘新基因684個，其中，10個基因得到功能注釋。試驗組組別間的3個生物學重復的決定系數(shù)()均大于0.95，對照組組別間的決定系數(shù)()均在0.91以上，表明樣品組成相似性高，后續(xù)分析結果相關性較強。

光照作為調節(jié)家禽行為活動中性成熟的一項重要節(jié)律模式，其是通過視網膜雙感受器共同感知以達到對光周期的控制，促進機體形成特定的生物節(jié)律，從而平穩(wěn)有序地調控家禽性成熟活動。研究報道，家禽視網膜感受光照的刺激后，產生光信號經“視網膜-下丘腦神經束”傳遞至視交叉上核轉化為神經沖動，此過程通過來自性腺軸調控的神經內分泌調節(jié)，引起家禽體內促黃體素(LH)和促卵泡素(FSH)等一批性腺激素產生變化，最后影響家禽的性成熟等行為活動。家禽生產中，養(yǎng)殖者重點關注光照變化致使優(yōu)質肉雞體質量和脂肪沉積等是否合格，而易忽視其對性腺發(fā)育的影響，現(xiàn)有研究已經表明，優(yōu)質肉雞不同生長階段的生理特點差異較大，對光照時間長短反應不同，須在不同的生長階段采用不同的光照節(jié)律，否則便會引起優(yōu)質肉雞性早熟或開產延遲等情況。

本研究差異表達基因對比分析結果表明，對照組與試驗組T2的mRNA顯著差異表達基因數(shù)量超過189個，表明了對照組與試驗組T2由于不同的光照模式影響，導致了機體的生長發(fā)育在基因層面差異較大。在表達差異最顯著的基因中，與內外環(huán)境的節(jié)律調動過程和體內信號轉導有關的基因表達最為活躍。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)褪黑素在動物性成熟、激素分泌等過程中發(fā)揮著重要作用。褪黑素作為一種內分泌胺類激素，其分泌受光照影響呈現(xiàn)出晝低夜高的節(jié)律性，能夠抑制性激素分泌，如可以抑制HPG軸的水平，通過抑制促性腺激素釋放激素(GnRH)的釋放來調節(jié)機體的生殖功能，而下丘腦是促性腺激素釋放激素(GnRH)分泌的整合單位，是促黃體生成素和促卵泡生成素適時釋放的信號。此外作為抗性腺作用的主要靶器官，在性成熟過程中同樣發(fā)揮著巨大作用。因此，在肉種雞生產中，可以考慮通過補充外源性褪黑素適宜地延遲不同品種、不同育種目標肉種雞性成熟時機，以達到最大化生產目的。瘦素作為影響家禽生殖系統(tǒng)的一個重要信號，待性器官發(fā)育到一定階段后，在體內釋放隨后進入血液的含量不斷增加，促進了促性腺激素的分泌，導致了性腺類固醇激素的持續(xù)上升，進而影響開啟性成熟的啟動周期。多巴胺通過興奮多巴胺受體抑制垂體中血管活性腸肽(VIP)和催乳素(PRL)等多種相關激素的分泌，具有強烈抑制促性腺激素釋放以及刺激促生長激素分泌的作用，從而對雞的性成熟啟動起到積極的調控作用。GO和KEGG功能測序分析結果表明，3組雞富集到了多條顯著GO條目，KEGG信號通路富集分析提示，信號傳遞、新陳代謝和細胞過程等在機體性成熟過程中發(fā)揮了重要作用。量多而繁復的復雜通路多與機體生長發(fā)育、性成熟啟動密切相關，連接通路的這些上調或下調基因和多種性腺激素相互協(xié)作、相互制約，所產生的多種生理、藥理反應可作用于雞體內多個循環(huán)系統(tǒng)，其中，包括內分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和神經系統(tǒng)，進而也會影響雞的晝夜節(jié)律、性成熟啟動以及生殖行為，呈現(xiàn)后續(xù)的一系列機體應答反應。

4 結論

優(yōu)質肉雞不同生長階段的光照模式對其性成熟的影響較大，主要是通過上調或下調與信號傳遞和機體新陳代謝等信號通路相關基因的表達，從而影響優(yōu)質肉雞性成熟發(fā)育，最終實現(xiàn)生產性能的綜合調控。