基于數(shù)據(jù)庫篩選補(bǔ)中益氣湯中7種黃酮類成分及其含量分析

曹禮慧 徐漢明 袁中文 陳朋 馮森玲

摘要：目的 篩選補(bǔ)中益氣湯治療子宮脫垂7種黃酮類成分及其含量分析。方法 運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選補(bǔ)中益氣湯治療子宮脫垂的關(guān)鍵化合物，采用HPLC法分析關(guān)鍵化合物的含量，Agilent SB-C18柱（250mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相為色譜乙腈-0.05%磷酸水溶液梯度洗脫，進(jìn)樣量10μL，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長：254 nm，柱溫為30℃。結(jié)果 通過數(shù)據(jù)庫篩選出7種黃酮類成分，包括槲皮素、山柰酚、柚皮素、異鼠李素、刺芒柄花素、川陳皮素、毛蕊異黃酮。結(jié)論 建立HPLC法測(cè)定補(bǔ)中益氣湯治療子宮脫垂的7種黃酮類成分，該含量測(cè)定方法穩(wěn)定、可靠、準(zhǔn)確，可用于補(bǔ)中益氣湯質(zhì)量控制并指導(dǎo)臨床用藥。

關(guān)鍵詞：補(bǔ)中益氣湯;TCMSP數(shù)據(jù)庫;高效液相色譜法;黃酮類成分;含量分析

中圖分類號(hào)：R285.5?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號(hào)：1007-2349（2022）02-0071-04

Content Analysis of Seven Flavonoids Compounds in Buzhong YiqiDecoction Based on Database

CAO Li-hui1， XU Han-ming2， YUAN Zhong-wen1， CHEN Peng3， FENG Sen-ling1

（1.The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University/Guangdong Provincial Key Laboratoryof Obstetrics Major Diseases， Guangzhou 510150， China;2. Shenzhen Hospital of Beijing University， Shenzhen 518033， China; 3. Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine， Guangzhou 510006， China）

【Abstract】Objective： To analyze the content of seven flavonoids compounds in Buzhong Yiqi Decoction in the treatment of uterine prolapse patients. Methods： The key compounds of Buzhong Yiqi Decoction in the treatment of uterine prolapse were screened by using TCMSP database， and the content of key compounds was analyzed by HPLC. Agilent SB-C18 column was 250mm×4.6mm， 5μm， and the mobile phase was acetonitrile-0.05% phosphoric acid aqueous solution gradient elution. The injection volume was 10 μL and the flow rate was 1.0 mL/min. The detection wavelength was 254 nm， and the column temperature was 30 ℃. Results： Seven flavonoids were screened from the database， including quercetin， kaempferol， naringenin， isorhamnetin， formononetin， nobiletin and calycosin. Conclusion： A HPLC method was established for the determination of seven flavonoids in Buzhong Yiqi Decoction in the treatment of uterine prolapse. The content determination method is stable， reliable and accurate， and can be used for quality control of Buzhong Yiqi Decoction and guide clinical medication.

【Key words】Buzhong Yiqi Decoction; TCMSP Database; High Performance Liquid Chromatography; Flavonoids; Content Analysis

補(bǔ)中益氣湯[1]來源于名醫(yī)李東恒《脾胃論》，主治脾胃氣虛證、氣虛下陷證和氣虛發(fā)熱證。子宮脫垂[2]是盆腔臟器脫垂的主要表現(xiàn)形式，其嚴(yán)重影響了患者的正常生活，目前發(fā)病機(jī)制仍不清楚，只能通過對(duì)癥治療減輕患者的不適，無法徹底根治[3-4]。文獻(xiàn)研究表明[5-6]，補(bǔ)中益氣湯可能是通過提高TGFβ-3表達(dá)或通過抑制miR-30d表達(dá)，增加盆腔臟器脫垂大鼠子宮骶韌帶膠原蛋白的合成，從而改善盆腔臟器脫垂情況。也有文獻(xiàn)通過臨床研究發(fā)現(xiàn)[7-9]，試驗(yàn)組服用補(bǔ)中益氣湯后子宮脫垂的臨床癥狀較對(duì)照組明顯改善。補(bǔ)中益氣湯作為復(fù)方，具有化學(xué)成分復(fù)雜，使得治療子宮脫垂的藥代動(dòng)力學(xué)研究中的目標(biāo)化合物不明確[10]。研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選補(bǔ)中益氣湯治療子宮脫垂的關(guān)鍵化合物，繼而建立高效液相色譜法分析含量，此方法的建立為補(bǔ)中益氣湯治療子宮脫垂關(guān)鍵化合物的質(zhì)量控制提供有效依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司;FR224CN型電子天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司;KQ-300E型超聲機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 樣品與試劑 槲皮素（批號(hào)：100081-200406，中國生物制品檢定所）、山柰酚（批號(hào)：S-014-121218，天津市科曼思特醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司）、柚皮素（批號(hào)：L09834，大連美侖生物技術(shù)有限公司）、異鼠李素（批號(hào)：110860-201611，中國食品藥品檢定研究院）、刺芒柄花素（批號(hào)：N0301AS，大連美侖生物技術(shù)有限公司）、川陳皮素（批號(hào)：B20199，上海源葉生物科技有限公司）、毛蕊異黃酮（批號(hào)：D0806AS，大連美侖生物技術(shù)有限公司）;色譜級(jí)乙腈（Sigma 公司），超純水（自制），其余試劑均為分析純。

補(bǔ)中益氣配方顆粒（批號(hào)：黃芪20032711、人參20009131、白術(shù)20020101、炙甘草20031601、當(dāng)歸20028041、陳皮20017121、升麻20039941、北柴胡20033021，北京康仁堂藥業(yè)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 關(guān)鍵化合物的篩選 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫，以“黃芪”、“人參”、“甘草”、“白術(shù)”、“升麻”、“柴胡”、“陳皮”、“當(dāng)歸”為關(guān)鍵詞，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為篩選條件，對(duì)化合物進(jìn)行篩選，根據(jù)UniProt數(shù)據(jù)庫對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，將靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)基因，限定物種為“Homo Sapiens”獲得補(bǔ)中益氣湯活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，剔除重復(fù)及與UniProt匹配后補(bǔ)中益氣湯共117個(gè)靶點(diǎn);通過GeneCards數(shù)據(jù)庫，以“uterine prolapse”作為關(guān)鍵詞檢索，獲取子宮脫垂靶點(diǎn)667個(gè)，其中與補(bǔ)中益氣湯的交集靶點(diǎn)共37個(gè)。使用Cytoscape軟件構(gòu)建“中藥-化合物-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，其中度值較高的化合物有槲皮素、山柰酚、柚皮素、異鼠李素、刺芒柄花素、川陳皮素、毛蕊異黃酮等，可能是補(bǔ)中益氣湯治療子宮脫垂的關(guān)鍵化合物，見表1。

2.2 含量分析方法與結(jié)果

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent SB-C18柱（250mm×4.6 mm，5μm），柱溫為30℃，進(jìn)樣量10μL，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長：254 nm下測(cè)定，流動(dòng)相為色譜乙腈-0.05%磷酸水溶液，梯度洗脫條件：0～10 min，10%乙腈;10～30 min，10%～80%乙腈;30～31 min，80%～10%乙腈;31～45 min，10%乙腈。見表2。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取柚皮素、槲皮素、山柰酚、異鼠李素、刺芒柄花素、川陳皮素、毛蕊異黃酮對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度約為0.5mg/mL溶液，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備 取補(bǔ)中益氣配方顆粒（黃芪6 g，人參1.8 g，白術(shù)1.8 g，炙甘草3 g，當(dāng)歸1.2 g，陳皮0.6 g，升麻0.6 g，柴胡0.6 g，合計(jì)15.6 g），研細(xì)，取0.5 g。精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，超聲處理（功率300w，頻率40kHZ）50min，放冷，用70%乙醇定容至50 mL，搖勻，靜置，取上清液，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 線性關(guān)系考察 按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別向HPLC中注入混合對(duì)照品溶液5、10、15、20、25μL，在254 nm處測(cè)定峰面積值，并以樣品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得7種黃酮類化合物的線性回歸方程分別為：Y=612.334X+0.0574，R2=0.9926，表明柚皮素在0.0015-1.1452 mg/mL與峰面積呈良好線性關(guān)系;Y=583.690X+0.0641，R2=0.9938，表明槲皮素在0.0014-1.2471 mg/mL與峰面積呈良好線性關(guān)系;Y=468.614X+0.0741，R2=0.9974，表明山柰酚在0.0031-1.1479 mg/mL與峰面積呈良好線性關(guān)系;Y=502.387X+0.0063，R2=0.9945，表明異鼠李素在0.0027-1.2478 mg/mL與峰面積呈良好線性關(guān)系;Y=452.842X+0.0149，R2=0.9916，表明川陳皮素在0.0019-1.2407 mg/mL與峰面積呈良好線性關(guān)系;Y=597.675X+0.0473，R2=0.9938，表明毛蕊異黃酮在0.0018-1.1389 mg/mL與峰面積呈良好線性關(guān)系;Y=653.714X+0.0673，R2=0.9942，表明刺芒柄花素在0.0021-1.2370 mg/mL與峰面積呈良好線性關(guān)系。見表3。

2.2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次的補(bǔ)中益氣配方顆粒樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行處理，制備供試品溶液6份，按上述“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件吸取供試品溶液各10 μL，注入HPLC進(jìn)行分析。柚皮素、槲皮素、山柰酚、異鼠李素、刺芒柄花素、川陳皮素、毛蕊異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.37%、1.14%、1.71%、1.54%、1.19%、1.27%和0.96%，各個(gè)黃酮類化合物的RSD值均小于2%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.4.3 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批次的補(bǔ)中益氣配方顆粒樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行處理，制備供試品溶液6份，置于具塞三角燒瓶內(nèi)，分別加入柚皮素、槲皮素、山柰酚、異鼠李素、刺芒柄花素、川陳皮素、毛蕊異黃酮對(duì)照品適量，按上述“2.2.1”項(xiàng)方法處理，測(cè)定各個(gè)黃酮類化合物的含量。測(cè)得柚皮素的平均回收率為99.388%，RSD=1.25%;測(cè)得槲皮素的平均回收率為99.209%，RSD=1.49%;測(cè)得山柰酚的平均回收率為100.84%，RSD=1.42%;測(cè)得異鼠李素的平均回收率為99.138%，RSD=1.38%;測(cè)得川陳皮素的平均回收率為100.526%，RSD=0.61%;測(cè)得毛蕊異黃酮的平均回收率為101.557%，RSD=1.80%;測(cè)得刺芒柄花素的平均回收率為100.500%，RSD=0.73%。見表4。

2.2.5 樣品含量測(cè)定 將“2.2.3”項(xiàng)目下的供試品溶液按照“2.2.1”的條件進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)樣品中各個(gè)黃酮類化合物的出峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算得到樣品中柚皮素的含量為5.613 mg/mL;測(cè)得槲皮素的含量為1.147 mg/mL;測(cè)得山柰酚的含量為0.482 mg/mL;測(cè)得異鼠李素的含量為0.239 mg/mL;測(cè)得川陳皮素的含量為0.550 mg/mL;測(cè)得毛蕊異黃酮的含量為0.947 mg/mL;測(cè)得刺芒柄花素的含量為1.371 mg/mL。如圖1。

3 討論

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選中益氣湯治療子宮脫垂的關(guān)鍵化合物。得到37個(gè)交集靶點(diǎn)，利用Cytoscape軟件構(gòu)建“中藥-化合物-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，其中度值排名靠前的化合物，分別有槲皮素、山柰酚、柚皮素、異鼠李素、刺芒柄花素、川陳皮素、毛蕊異黃酮，推測(cè)可能為補(bǔ)中益氣湯治療子宮脫垂的關(guān)鍵化合物。研究發(fā)現(xiàn)[11]，槲皮素、山柰酚、異鼠李素等均具有抗炎作用，補(bǔ)中益氣湯可能通過降低氧化應(yīng)激通路、減輕炎癥反應(yīng)等達(dá)到治療子宮脫垂。

采用高效液相色譜法進(jìn)一步對(duì)補(bǔ)中益氣湯治療子宮脫垂的7種黃酮類成分進(jìn)行含量分析，為補(bǔ)中益氣湯的質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)支撐。通過二極管陣列檢測(cè)器全波長掃描，所測(cè)的7種黃酮類成分在254 nm處測(cè)得各個(gè)黃酮化合物的色譜峰均有良好響應(yīng)，并且在此波長下，其他類型的化合物對(duì)黃酮色譜峰峰面積影響較小，所以本實(shí)驗(yàn)選取254 nm作為檢測(cè)波長?？疾觳煌鲃?dòng)相組合，包括水-甲醇、水-乙腈、磷酸水-甲醇和磷酸水-乙腈，發(fā)現(xiàn)0.05%磷酸水-乙腈做為流動(dòng)相，7種黃酮類化合物的色譜分離效果最好，峰形對(duì)稱。選取等度洗脫系統(tǒng)時(shí)，各個(gè)色譜峰不能完全分離，故本實(shí)驗(yàn)采取梯度洗脫系統(tǒng)，并根據(jù)各個(gè)色譜峰出峰位置進(jìn)一步調(diào)整，優(yōu)化得到2.2.1項(xiàng)下色譜條件。

中藥含有的藥效成分復(fù)雜多樣，明確其中關(guān)鍵藥效物質(zhì)對(duì)中藥的質(zhì)量控制起到至關(guān)重要的作用。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫選篩選補(bǔ)中益氣湯中治療子宮脫垂可能的關(guān)鍵化合物，然后建立高效液相色譜測(cè)定篩選出的7種黃酮類成分在補(bǔ)中益氣湯中的含量方法，經(jīng)過線性關(guān)系考察、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)和標(biāo)準(zhǔn)加入實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該含量測(cè)定方法靈敏度高，線性關(guān)系良好，可重復(fù)性高，表明該方法穩(wěn)定、可靠、準(zhǔn)確，為補(bǔ)中益氣湯的質(zhì)量控制綜合評(píng)價(jià)提供了更加全面的參考。

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（收稿日期：2021-09-26）