一種SARS-CoV-2 快速檢測方法的建立與應(yīng)用*

魯 靜，孫 靜，張順皓，劉慧敏，宣世海，王旭東**

(1 南通大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，南通 226001；2 江蘇省東臺(tái)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科；3 江蘇省南通市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科)

新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)疫情自2019 年底爆發(fā)以來[1]，在國內(nèi)外對(duì)社會(huì)生活各方面造成了很大的影響。我國采取“動(dòng)態(tài)清零”政策并結(jié)合疫苗接種在控制疫情方面取得了很大的成功。由于病毒的突變，出現(xiàn)了高傳播能力的德爾塔、奧密克戎等突變株[2]，造成國內(nèi)部分地區(qū)疫情的反復(fù)。為快速扼住疫情的發(fā)展，對(duì)病毒快速檢測的需求越來越大。目前，用于診斷新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARSCoV-2)感染的方法有很多，如檢測病毒抗原的免疫學(xué)方法[3]、檢測病毒核酸的分子生物學(xué)方法[3-5]。但抗原的檢測受檢測靈敏度限制，主要用于個(gè)人自檢或一些特殊的現(xiàn)場篩查。衛(wèi)健委發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第九版)》明確提出病毒核酸是COVID-19 的臨床確診標(biāo)準(zhǔn)。WHO 也推薦COVID-19 感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RTPCR)[6]。常規(guī)的熒光PCR 檢測技術(shù)檢測全過程時(shí)間超過3 h[7]，遠(yuǎn)不能滿足醫(yī)院急診、高速路口等時(shí)效性要求高的場所。

SARS-CoV-2 是一種正鏈RNA 病毒，基因組長29 903 bp[3,8]，其中有14 個(gè)開放閱讀框(open reading frame,ORF)編碼27 種蛋白質(zhì)。目前常用的檢測靶點(diǎn)包括ORF1ab 基因、核衣殼(N)基因、刺突蛋白(S)基因和包膜蛋白(E)基因[8]。本研究開發(fā)了一種一步法快速檢測技術(shù)，分別設(shè)計(jì)兩對(duì)針對(duì)病毒保守序列ORF1ab 基因和N 基因的引物和熒光探針，另外設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)人細(xì)胞內(nèi)參基因(如Rnase P)的引物和探針用于監(jiān)控核酸提取過程和采樣的質(zhì)量。通過優(yōu)化反應(yīng)條件，整個(gè)檢測過程在1 h 內(nèi)完成。

1 材料和方法

1.1 材料及來源 實(shí)驗(yàn)陰性樣本39 例來自南通大學(xué)附屬醫(yī)院的普通篩查標(biāo)本，臨床驗(yàn)證的陽性樣本25 例來自南通市第三人民醫(yī)院(陽性標(biāo)本檢測在三院核酸實(shí)驗(yàn)室完成)。實(shí)驗(yàn)用試劑高性能Taq 酶及2× PCR 反應(yīng)液購自北京TAKARA 公司，焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)水購自Biosharp公司，引物由上海睿勉公司合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀采用16 孔小型化學(xué)專用擴(kuò)增儀，購自南通EGENS生物技術(shù)有限公司(YS-qRCR-1 型)。

1.2 檢測方法與結(jié)果判讀

1.2.1 引物探針序列的設(shè)計(jì) 使用引物設(shè)計(jì)軟件Snapgene V4.0，導(dǎo)入SARS-CoV-2 的全部基因組，分別設(shè)計(jì)ORF1ab 基因、N 基因和內(nèi)參基因的上下引物及探針片段，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.2 核酸提取方法 按照廠家說明書的步驟快速提取核酸(碩世生物科技股份有限公司)，其采用具有分離作用的磁珠和緩沖系統(tǒng)，與核酸提取儀配合使用，從樣品中分離純化得到高質(zhì)量的核酸。

1.2.3 PCR 反應(yīng)體系 Buffer 12.5 μL，Taq 酶1 μL，DEPC 水4 μL，Rd 引物混合物0.625 μL(終濃度625 nmol/L)，Rd 探針0.3 μL(終濃度150 nmol/L)，N引物混合物0.625 μL(終濃度625 nmol/L)，N 探針0.25 μL(終濃度125 nmol/L)，IC 引物混合物0.5 μL(終濃度500 nmol/L)，IC 探針0.2 μL(終濃度100 nmol/L)，待測樣本RNA 模板5 μL，共25 μL。

1.2.4 PCR 擴(kuò)增條件 逆轉(zhuǎn)錄50 ℃恒溫3 min；94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃2 s，58 ℃12 s 循環(huán)40 次，在循環(huán)步驟58 ℃時(shí)讀取熒光值。

1.2.5 結(jié)果判讀 在儀器正常、陽性對(duì)照和空白對(duì)照均正常的情況下進(jìn)行結(jié)果分析：FAM 通道為SARSCoV-2 的ORF1ab 基因、VIC 通道為N 基因，當(dāng)待測樣本單通道或雙通道檢測結(jié)果Ct≤38，曲線呈S 型且有明顯指數(shù)增長期判定為陽性；當(dāng)所有通道Ct＞38或未檢出時(shí)判定為陰性。CY5 通道為內(nèi)標(biāo)，Ct 應(yīng)≤37，否則采樣復(fù)測。

1.3 驗(yàn)證方法和指標(biāo)

1.3.1 陰、陽性符合率 選取64 例鼻咽拭子標(biāo)本，采用已經(jīng)上市且經(jīng)過性能驗(yàn)證的A 和B 兩種廠家試劑盒檢測樣本，分別與本研究候選方法比較陰、陽性符合率和總體符合率。

1.3.2 精密度評(píng)價(jià) 批間精密度是使用1 份精密度校準(zhǔn)品檢測4 次/d，連續(xù)檢測5 d，共測定20 次。批內(nèi)精密度是用1 份精密度校準(zhǔn)品連續(xù)檢測10 次/d。根據(jù)檢測結(jié)果，分別計(jì)算樣本Ct 值的標(biāo)準(zhǔn)差(stan dard deviation,SD)及變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)，如CV<5%，則精密度符合要求。

1.3.3 最低檢出限 使用定值為1 000 copies/mL的室間質(zhì)評(píng)樣本與無核糖核酸酶水按倍比混合，配置濃度為500、250、125、62.5、31.25 copies/mL的樣本重復(fù)檢測3 次(圖1)。由于62.5 copies/mL 和31.25 copies/mL 的樣本重復(fù)檢測10 次未能滿足95%以上的檢出率，故最低檢出限視為125 copies/mL(圖2)。

圖1 線性評(píng)估

圖2 最低檢出限

1.3.4 穩(wěn)定性驗(yàn)證 將配好的試劑放入-20 ℃冰箱，避免反復(fù)凍融，2 個(gè)月后取出重新檢測125 copies/mL的樣本3 次。

1.3.5 干擾物質(zhì) 用試劑檢測分別有甲型流感病毒(H1N1)、EB 病毒、輪狀病毒的混合液觀察ORF 基因和N 基因有無交叉反應(yīng)。將1 份弱陽性樣本分別混入奧司他韋、青霉素、地塞米松等藥物，與加入無核糖核酸酶水作為對(duì)照。提取后重復(fù)檢測3 次，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組Ct 值的絕對(duì)偏差≤1.6 為符合要求。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Excel 2019 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理；在SPSS 26.0 軟件采用χ2檢驗(yàn)分析陰、陽性符合率和總體符合率，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；利用GraphPad Prism7.0 軟件制作折線圖分析最低檢出限。

2 結(jié)果

2.1 陰、陽性符合率 選取64 例鼻咽拭子標(biāo)本分別用A 廠家、B 廠家和候選方法進(jìn)行符合率比較，A 廠家的陽性樣本均有明顯擴(kuò)增曲線，且Ct 值≤37；B廠家的陽性樣本均有明顯擴(kuò)增曲線，且Ct 值≤38。由表2 可見，與A 廠家相比，候選方法陽性符合率為100.0%，陰性符合率為61.5%，總符合率為76.5%；與B 廠家相比，候選方法陽性符合率為92.5%，陰性符合率為87.5%，總符合率為90.6%；3 組數(shù)據(jù)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.458,P=0.009)。

表2 A、B 廠家方法符合率驗(yàn)證比較

2.2 精密度 ORF1ab 基因和N 基因批間精密度的Ct 值分別為32.98±0.62 和32.58±0.60，CV 值分別為1.9%、1.8%，均<5%，結(jié)果符合要求；批內(nèi)精密度的Ct 值分別為32.92±0.06 和32.54±0.08，CV 值均為0.2%<5%，結(jié)果符合要求。

2.3 最低檢出限 重復(fù)檢測濃度為125 copies/mL的樣本20 次，ORF1ab 基因和N 基因均有明顯擴(kuò)增曲線且Ct 值<38，陽性檢出率為100%。此外還檢測國家靈敏度參考品，S1、S2、S3、S5 為陽性，S4 為陰性，均符合要求。

2.4 穩(wěn)定性 125 copies/mL 樣本的3 次檢測結(jié)果，ORF1ab 基因和N 基因均有明顯擴(kuò)增曲線且Ct 平均值<38，表明試劑在-20 ℃冰箱放置2 個(gè)月仍可保持穩(wěn)定。

2.5 抗干擾能力 對(duì)H1N1、EB 病毒、輪狀病毒均無交叉反應(yīng)，奧司他韋、青霉素、地塞米松等藥物不會(huì)對(duì)SARS-CoV-2 核酸結(jié)果產(chǎn)生明顯干擾。

3 討論

常規(guī)的熒光PCR 檢測技術(shù)耗時(shí)較長，需要昂貴的儀器設(shè)備、復(fù)雜的樣本預(yù)處理以及專業(yè)的技術(shù)人員。對(duì)醫(yī)院急診、高速路口等時(shí)效性要求高的場所，有必要發(fā)展快速準(zhǔn)確的核酸檢測技術(shù)。因此本研究針對(duì)SARS-CoV-2 開發(fā)了一種特異、靈敏且快速的檢測方法，全部檢測在1 h 內(nèi)完成。該方法主要通過3 個(gè)方面縮短檢測時(shí)間：(1)通過核酸釋放劑直接裂解細(xì)胞釋放病毒核酸，省略核酸提取環(huán)節(jié)；(2)設(shè)計(jì)較短的擴(kuò)增子并采用高性能的Taq 酶，優(yōu)化擴(kuò)增反應(yīng)條件等方法來縮短反應(yīng)時(shí)間，普通的Taq 酶催化效率150 bp/s，高性能Taq 酶催化效率更快；(3)采用16孔小型化的專用擴(kuò)增儀，提高儀器反應(yīng)速度。

候選方法與另兩個(gè)廠家的陽性符合率均>90%。與兩種廠家的符合率存在差異，可能是設(shè)計(jì)的SARS-CoV-2 引物序列不同導(dǎo)致與靶序列結(jié)合的差異，提示一方面可以通過增加簡并引物的方式提高檢出率，另一方面有必要用第二廠家的試劑驗(yàn)證陽性結(jié)果，特別是一些所謂“翹尾”的現(xiàn)象。

綜上所述，本研究成功建立了一種新型的SARS-CoV-2 核酸快速檢測方法，對(duì)SARS-CoV-2的ORF1ab 基因、N 基因檢測并結(jié)合人類RNase P作為內(nèi)參基因，利用實(shí)際的陽性樣本進(jìn)行比較分析，建立的快速檢測方法與已有市售的試劑盒對(duì)比，靈敏度更高。非常適合當(dāng)前疫情防控下快速檢測SARS-CoV-2 的要求，有較好的應(yīng)用前景。