黏菌素腎毒性的分子機(jī)制及其研究進(jìn)展

李 萌，沈麟杰，代重山

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193)

多黏菌素類(Polymyxins)抗生素是一類聚陽(yáng)離子多肽類藥物，主要包括多黏菌素A、B、C、D、E。黏菌素，也叫多黏菌素E，已被廣泛應(yīng)用于治療革蘭陰性菌造成的動(dòng)物和人類的腸道及肺部感染，對(duì)多重耐藥革蘭陰性細(xì)菌(MDR-GNR)感染的治療效果尤為顯著，被稱為治療該類細(xì)菌感染的“最后一線治療希望”。目前，如何延長(zhǎng)這一臨床上重要的抗菌藥物的使用壽命，已成為一個(gè)重要的研究課題，其面臨的主要問(wèn)題有2個(gè)：一個(gè)是如何降低其臨床耐黏菌素細(xì)菌的發(fā)生概率。近年來(lái)，我國(guó)已明令禁止將黏菌素作為非治療使用的其他任何用途，明顯地減緩了耐黏菌素細(xì)菌的傳播速度，對(duì)控制黏菌素的耐藥性做出了積極的貢獻(xiàn)[1]。另一個(gè)則是如何降低黏菌素的毒性作用，提高其治療指數(shù)。神經(jīng)毒性和腎毒性是黏菌素臨床應(yīng)用過(guò)程中發(fā)生的主要毒副作用，其中腎毒性的發(fā)生率高達(dá)60%以上，遠(yuǎn)高于其神經(jīng)毒性的發(fā)生率(約7%)，是目前最主要的劑量限制性影響因素，嚴(yán)重降低其臨床治療指數(shù)[2]。因此，迫切需要深入理解和探究黏菌素腎毒性的分子機(jī)制，這對(duì)黏菌素的安全用藥及減毒策略的開(kāi)發(fā)均具有重要的科學(xué)意義。因此，本文將對(duì)黏菌素腎毒性的分子機(jī)制的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，同時(shí)對(duì)相關(guān)預(yù)防或改善黏菌素腎毒性的藥物進(jìn)行歸納總結(jié)，以期為黏菌素的安全用藥及相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 黏菌素腎毒性的分子機(jī)制研究現(xiàn)狀

1.1 破壞真核細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu) 已有研究證實(shí)，黏菌素誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞壞死與直接破壞其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)相關(guān)，這主要與黏菌素的分子結(jié)構(gòu)所攜帶的D型氨基酸和脂肪酸成分相關(guān)，通過(guò)降低細(xì)胞漿膜表面張力，造成正常腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞膜通透性增大，最終導(dǎo)致細(xì)胞腫脹和溶解，直至死亡[2]。Dai等[3]研究發(fā)現(xiàn)，雞原代神經(jīng)元細(xì)胞暴露于8.3 μg/mL黏菌素24 h后，胞外乳酸脫氫酶(LDH)水平顯著增加。LDH胞外釋放的增加被認(rèn)為是細(xì)胞膜破壞的典型生化標(biāo)志物。相似地，Mingeot-Leclercq等[4]研究發(fā)現(xiàn)，與黏菌素具有類似結(jié)構(gòu)的多黏菌素B在0.5 mmol/L和1 mmol/L暴露處理豬腎小管上皮細(xì)胞(LLC-PK1)48 h時(shí)，LDH均顯著增加。這些研究表明黏菌素可破壞真核細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性。通過(guò)體外生化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相同劑量的黏菌素對(duì)由卵磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇- 4,5-二磷酸等組成的磷脂雙分子層的破壞能力遠(yuǎn)大于其他常用的抗菌藥物，如慶大霉素、卡那霉素和鏈霉素等，表明黏菌素對(duì)真核細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)具有一定的特異性毒性作用[5]。迄今為止，關(guān)于黏菌素如何作用于真核細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，如何破壞其完整性，確切的分子機(jī)制尚不清楚，這些問(wèn)題仍有待進(jìn)一步研究。

1.2 誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷 氧化應(yīng)激是指機(jī)體由于受到內(nèi)源性或外源性刺激，使得體內(nèi)氧化與抗氧化作用間的平衡失常，自由基產(chǎn)生過(guò)多，如活性氧(ROS)和活性氮(RNS)，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而引發(fā)的一系列應(yīng)激反應(yīng)。

ROS常包括過(guò)氧化氫(H2O2)、超氧自由基(O2·-)、羥基自由基(·OH)和單線態(tài)氧(1O2)等自由基。體外多個(gè)細(xì)胞研究證實(shí)，黏菌素暴露可誘導(dǎo)小鼠原代神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)瘤Neuro-2a(N2a)、大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12)、人腎臟細(xì)胞(HK-2)、雞原代神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ROS大量釋放，ROS的過(guò)多積累導(dǎo)致氧化應(yīng)激，氧化損傷蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì)等細(xì)胞內(nèi)大分子，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[3,6-11]。本課題組前期研究證實(shí)，小鼠靜脈注射7.5 mg/(kg·bw·d)和15 mg/(kg·bw·d)黏菌素，連續(xù)注射7 d后，小鼠腎臟組織中脂質(zhì)過(guò)氧化標(biāo)志物丙二醛(MDA)含量顯著升高，抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽氧化酶(GSH-Px)活性及谷胱甘肽(GSH)含量顯著降低[8]。在細(xì)胞內(nèi)，SOD主要用于清除O2·-，CAT主要用于清除·OH，GSH主要用于清除H2O2，這些抗氧化蛋白在細(xì)胞內(nèi)的降低將加劇其氧化-抗氧化系統(tǒng)的失衡，從而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷[7]。這些研究均表明，ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷在黏菌素誘發(fā)的腎毒性中扮演著重要角色。

一些研究發(fā)現(xiàn)，黏菌素也可誘導(dǎo)RNS的過(guò)量產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷[11-12]。RNS包括一氧化氮(NO)、二氧化氮(NO2)和過(guò)氧化亞硝酸鹽(ONOO-)等自由基。體外研究證實(shí)，375 μmol/L多黏菌素B處理LLC-PK1細(xì)胞72 h，顯著上調(diào)NO的釋放[13]。Ozkan等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在黏菌素誘導(dǎo)的大鼠腎損傷模型中，腎組織中的SOD活力顯著降低，誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)及內(nèi)源性一氧化氮合酶(eNOS)均顯著升高。iNOS或eNOS表達(dá)和活性的增加，將促進(jìn)L-精氨酸(L-Arg)產(chǎn)生NO，過(guò)多的NO將直接導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷。

目前，研究者對(duì)黏菌素誘導(dǎo)的ROS或RNS過(guò)量產(chǎn)生的分子機(jī)制尚不清楚。最新研究發(fā)現(xiàn)，黏菌素可通過(guò)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)的產(chǎn)生，從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，誘導(dǎo)腎細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[6]。Wang等[14]最新研究發(fā)現(xiàn)，METTL3介導(dǎo)的N6-甲基腺苷(m6A)修飾通過(guò)調(diào)控miRNA-873-5p表達(dá)，從而影響?zhàn)ぞ卣T導(dǎo)的氧化應(yīng)激及腎毒性。然而，線粒體作為細(xì)胞內(nèi)ROS的主要來(lái)源，黏菌素誘導(dǎo)的ROS過(guò)量產(chǎn)生是否與線粒體呼吸鏈的傳遞遭到破壞直接相關(guān)，仍有待進(jìn)一步的研究。

1.3 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 凋亡是一種細(xì)胞程序化死亡，涉及內(nèi)源性及外源性凋亡途徑，主要包括線粒體、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路[8,15]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，小鼠靜脈注射15 mg/(kg·bw·d)黏菌素，連續(xù)注射7 d后，小鼠腎臟組織中B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)顯著降低，Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、細(xì)胞色素C(CytC)、凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-9和Caspase-3等蛋白表達(dá)顯著增加，這表明線粒體凋亡途徑參與黏菌素誘導(dǎo)的小鼠腎毒性，同時(shí)也證明，Caspase依賴及非依賴性凋亡均參與黏菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；小鼠腎臟組織中Fas細(xì)胞表面死亡受體(FAS)、FAS配體(FASL)、FAS相關(guān)死亡域蛋白(FADD)、Caspase-8及其剪切體表達(dá)顯著增加，表明死亡受體凋亡途徑參與黏菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；小鼠腎臟組織中葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Grp78)、活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)及其剪切體、生長(zhǎng)抑制和DNA損傷誘導(dǎo)基因153(GADD153/CHOP)和Caspase-12的表達(dá)顯著增加，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑參與黏菌素誘導(dǎo)的腎細(xì)胞凋亡[8]。

調(diào)控細(xì)胞凋亡涉及多個(gè)信號(hào)通路。有文獻(xiàn)已證實(shí)，在黏菌素誘導(dǎo)的小鼠腎毒性過(guò)程中，磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號(hào)通路、核因子κB(NF-κB)信號(hào)通路、核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)/單加氧酶(HO-1)信號(hào)通路、絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路等多種信號(hào)通路被激活[8,16]。然而，目前尚不清楚這些信號(hào)通路的激活在黏菌素誘導(dǎo)的腎毒性過(guò)程中發(fā)揮何種角色，是否與黏菌素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激及線粒體功能失調(diào)直接相關(guān)，均有待進(jìn)一步的探究。

1.4 誘導(dǎo)細(xì)胞自噬 動(dòng)物模型研究證實(shí)，在黏菌素誘導(dǎo)的腎毒性模型中，自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的表達(dá)顯著增加，使用透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細(xì)胞中可以明顯觀察到自噬體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)[8]，表明黏菌素腎毒性過(guò)程中可能激活腎臟上皮細(xì)胞內(nèi)的自噬反應(yīng)。作為一種自我降解過(guò)程，自噬可以由ROS或營(yíng)養(yǎng)缺失脅迫引起，自噬往往與細(xì)胞凋亡作用相反，其能夠消除錯(cuò)誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)，清除受損細(xì)胞器，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和過(guò)氧化物酶體等亞細(xì)胞器，從而促進(jìn)細(xì)胞存活[17]。Dai等[18]通過(guò)體外細(xì)胞試驗(yàn)證實(shí)，將轉(zhuǎn)入GFP-LC3質(zhì)粒的N2a細(xì)胞經(jīng)100 μmol/L黏菌素處理24 h后，綠色熒光斑點(diǎn)顯著增多，表明自噬被激活；同時(shí)，在細(xì)胞內(nèi)也可觀察到明顯的自噬小體、自噬溶酶體等; 在使用自噬抑制劑氯喹處理后，顯著加劇黏菌素誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞凋亡，而自噬激活劑雷帕霉素明顯改善黏菌素誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及細(xì)胞凋亡。

通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬控制藥物毒副作用、細(xì)胞衰老及感染性疾病已被廣泛研究。自噬、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡三者之間既相互依存，又相互調(diào)控，涉及多個(gè)信號(hào)通路。先前的研究已經(jīng)證實(shí)，p53信號(hào)通路、mTOR/ULK1信號(hào)通路、JNK信號(hào)通路和PI3K/Akt信號(hào)通路參與黏菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬[18-20]。但目前對(duì)這些信號(hào)通路的激活如何調(diào)控黏菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，在黏菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等諸多信號(hào)網(wǎng)絡(luò)過(guò)程中發(fā)揮怎樣的角色，仍然存在諸多疑問(wèn)。因此，研究黏菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬仍然是十分重要的科學(xué)問(wèn)題。

1.5 誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯 體外細(xì)胞及動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)，黏菌素可誘導(dǎo)腎細(xì)胞S期阻滯[21]。細(xì)胞周期的進(jìn)展和停滯過(guò)程與腎損傷后腎臟的恢復(fù)和纖維化密切相關(guān)。p21蛋白(CDKN1a)是細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(CDK)的抑制劑，在凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可依賴或非依賴于p53蛋白的控制[21]。目前，p21蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯在黏菌素誘導(dǎo)的腎毒性中發(fā)揮的作用尚不清楚，仍有待進(jìn)一步研究。

2 黏菌素腎毒性的減毒策略

2.1 通過(guò)改變黏菌素劑型或抑制細(xì)胞攝取降低黏菌素腎毒性 臨床中，黏菌素主要用于治療胞外菌感染，而黏菌素誘導(dǎo)腎毒性的直接原因是腎細(xì)胞內(nèi)藥物濃度過(guò)高，超過(guò)耐受閾值。因此，不減少血藥濃度及其殺菌活性的情況下，降低真核細(xì)胞內(nèi)的黏菌素藥物濃度是有效的減毒策略之一。目前，臨床已經(jīng)采取霧化給藥方式治療肺部感染，從而達(dá)到降低黏菌素系統(tǒng)毒性的目的[22]。還有一些研究通過(guò)抑制黏菌素的受體活性改善黏菌素的細(xì)胞內(nèi)攝取，從而達(dá)到降低黏菌素腎毒性的目的[23]。多個(gè)研究證實(shí)，內(nèi)源性受體巨蛋白(MR)、多肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(PEPT1)及有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(OCTN1)是多黏菌素類藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[23-25]。動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素C(CytC)可通過(guò)抑制MR活性明顯改善多黏菌素B誘導(dǎo)的大鼠腎毒性[26]。離子通道轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑糖蛋白預(yù)處理也可改善黏菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及腎臟損傷[27]。然而，由于這些受體自身也具有重要的生物學(xué)功能，受體抑制劑的使用導(dǎo)致對(duì)其他功能的損傷，在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用。

2.2 抗氧化劑抑制黏菌素腎毒性 基于上述的氧化應(yīng)激損傷理論，開(kāi)發(fā)有效的抗氧化劑是目前針對(duì)黏菌素腎毒性的重要減毒策略之一。多項(xiàng)研究通過(guò)小鼠及大鼠模型研究證實(shí)，傳統(tǒng)的抗氧化劑，如維生素C、維生素E、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、褪黑素和α-硫辛酸，這些藥物自身具有較強(qiáng)的抗氧化功能，用藥后能夠部分改善黏菌素誘導(dǎo)的腎臟組織氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡，從而改善黏菌素誘導(dǎo)的腎毒性[7,10,28-33]。然而，臨床研究顯示，維生素C的使用未能有效改善黏菌素臨床應(yīng)用的腎毒性，這提示傳統(tǒng)的抗氧化劑僅在動(dòng)物模型上具有一定的保護(hù)效果，主要原因可能與動(dòng)物模型使用劑量遠(yuǎn)高于臨床實(shí)際使用劑量或二者之間的生理差異相關(guān)[33]。此外，維生素C與黏菌素同時(shí)給藥可能影響?zhàn)ぞ氐乃巹?dòng)學(xué)，也可能抑制黏菌素的抗菌活性，因而在臨床應(yīng)用上極其受限。

2.3 激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路改善黏菌素腎毒性 Nrf2是細(xì)胞內(nèi)最重要的調(diào)控抗氧化應(yīng)激損傷的轉(zhuǎn)錄因子之一，Nrf2激活可促進(jìn)其下游抗氧化元件(ARE)相關(guān)基因的表達(dá)，如促進(jìn)HO-1、SOD和GSH-Px的表達(dá)。這些基因的激活常?？赏ㄟ^(guò)清除細(xì)胞內(nèi)ROS水平，達(dá)到抑制氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡，從而改善黏菌素腎毒性的目的。如Dezoti Fonseca等[16]研究發(fā)現(xiàn)，HO-1誘導(dǎo)劑血紅素能夠增加腎臟組織內(nèi)過(guò)氧化氫酶活性，保護(hù)多黏菌素B誘發(fā)的小鼠腎毒性。本課題組先前的研究證實(shí)，小鼠口服補(bǔ)充番茄紅素20 mg/(kg·bw·d)、黃芩素100 (kg·bw·d)或姜黃素200 (kg·bw·d)，連續(xù)7 d，均可有效激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路，從而改善黏菌素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷及腎毒性[25,34]。值得注意的是，這些天然活性物質(zhì)往往具有較高的臨床安全性，且來(lái)源較為豐富，價(jià)格相對(duì)低廉，在獸醫(yī)臨床更具有應(yīng)用價(jià)值。此外，一些化合物，如姜黃素，還可有效改善黏菌素誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性，協(xié)同黏菌素體外殺菌，逆轉(zhuǎn)耐藥菌對(duì)黏菌素的敏感性，具有較強(qiáng)的臨床開(kāi)發(fā)價(jià)值[25]。

3 總結(jié)與展望

黏菌素已成為臨床治療多重耐藥革蘭陰性細(xì)菌造成感染的最重要的抗菌藥物之一。腎毒性是黏菌素臨床應(yīng)用的主要毒副作用，嚴(yán)重限制其劑量應(yīng)用及臨床治療指數(shù)。同時(shí)，越來(lái)越多的研究表明，增加當(dāng)前推薦的臨床治療劑量可能會(huì)達(dá)到更好的治療效果，并且可降低臨床細(xì)菌產(chǎn)生適應(yīng)性耐受的風(fēng)險(xiǎn)，但增加劑量往往會(huì)增加其腎毒性和神經(jīng)毒性。經(jīng)過(guò)十余年的研究，關(guān)于黏菌素腎毒性的分子機(jī)制已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，已經(jīng)證實(shí)黏菌素可誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡及自噬，而氧化應(yīng)激損傷在黏菌素腎毒性過(guò)程中發(fā)揮重要作用，抑制氧化應(yīng)激能夠在一定程度上緩解黏菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和腎毒性。同時(shí)，研究也發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt、NF-κB、Nrf2/HO-1、MAPK、p53及p21等多個(gè)信號(hào)通路參與調(diào)控黏菌素誘導(dǎo)腎毒性。然而，尚不清楚這些信號(hào)通路在黏菌素腎毒性過(guò)程中的內(nèi)在聯(lián)系，它們?nèi)绾斡绊懷趸瘧?yīng)激，如何調(diào)控細(xì)胞自噬及凋亡，是否可以作為靶點(diǎn)來(lái)抑制黏菌素腎毒性，這些問(wèn)題均亟待解決，對(duì)降低黏菌素的腎毒性，開(kāi)發(fā)有效的減毒策略，提高臨床治療指數(shù)具有重要的科學(xué)意義。