飼用凝結(jié)芽孢桿菌益生機(jī)理及發(fā)酵制備工藝研究進(jìn)展

■張秀江 胡 虹 向凌云 張志龍 孫小玉

（1.河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450008；2.鄭州市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技服務(wù)中心，河南 鄭州 450000）

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）是一種能形成芽孢且產(chǎn)乳酸的細(xì)菌，屬厚壁菌門（Firmicutes）、桿菌綱（Bacilli）、芽孢桿菌目（Bacillales）、芽孢桿菌科（Bacillaceae）、芽孢桿菌屬（Bacillus）的革蘭氏陽(yáng)性菌，為同型乳酸發(fā)酵菌。凝結(jié)芽孢桿菌同時(shí)具有乳酸菌和芽孢桿菌共同的功效和良好的安全性。相比動(dòng)物胃腸道內(nèi)固有的乳酸菌和芽孢桿菌等益生菌，凝結(jié)芽孢桿菌不僅兼具二者的雙重功效，同時(shí)還具有高抗逆性、強(qiáng)黏附性、分泌消化酶、產(chǎn)抑菌物、易于發(fā)酵培養(yǎng)和貯存穩(wěn)定性好等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）1989 年將其認(rèn)定為公認(rèn)安全（GRAS）的微生物，并被美國(guó)農(nóng)業(yè)部（USDA）和美國(guó)飼料管理協(xié)會(huì)（AAFCO）列入可用于飼料的安全微生物菌種。歐洲食品與飼料菌種協(xié)會(huì)（EFFCA）和國(guó)際乳品聯(lián)合會(huì)（IDF）也將其認(rèn)定為GRAS菌種，獲得歐盟食品安全局（EFSA）的安全資格認(rèn)定（QPS）。凝結(jié)芽孢桿菌在美國(guó)、歐洲被廣泛用于人的臨床、食品添加劑以及作為直接飼喂的微生物用于畜牧業(yè)生產(chǎn)。2004年，我國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)凝結(jié)芽孢桿菌作為飼料添加劑在肉雞和生長(zhǎng)育肥豬飼料中應(yīng)用，2018年又將其應(yīng)用范圍擴(kuò)大至犬、貓日糧中。

在日糧中添加凝結(jié)芽孢桿菌具有改善動(dòng)物腸道功能、維持腸道菌群平衡、調(diào)節(jié)腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、提高動(dòng)物生產(chǎn)性能等功效。作為新型微生物飼料添加劑，凝結(jié)芽孢桿菌在畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖和動(dòng)物保健等行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。文章綜合國(guó)內(nèi)外凝結(jié)芽孢桿菌最新研究成果，對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌的益生機(jī)理、發(fā)酵制備工藝進(jìn)行綜述，以期為凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品開發(fā)及其在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中更加合理的應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 飼用凝結(jié)芽孢桿菌益生機(jī)理

凝結(jié)芽孢桿菌并非動(dòng)物體腸道固有微生物，其益生機(jī)理與其特有的生物學(xué)特性密切相關(guān)，主要體現(xiàn)為以下幾點(diǎn)。

1.1 安全性

凝結(jié)芽孢桿菌毒理學(xué)和抗生素耐藥性試驗(yàn)證明，本身不攜帶腸毒素和嘔吐毒素基因，沒有明顯的細(xì)胞毒性，無致誘變和致畸變以及遺傳毒性效應(yīng)，對(duì)抗生素具有一定的敏感性，且不含抗生素的耐藥性基因。嚴(yán)濤等（2018）進(jìn)行凝結(jié)芽孢桿菌BC01急性毒性試驗(yàn)表明，小鼠的最大耐受劑量（MTD）大于15 000 mg∕kg，根據(jù)物品毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，可以判定該菌無毒性。

1.2 黏附性

對(duì)腸道上皮細(xì)胞黏附能力強(qiáng)，是凝結(jié)芽孢桿菌具備益生功能的重要條件。凝結(jié)芽孢桿菌黏附于腸黏膜，并與其共同構(gòu)成生物屏障，保護(hù)宿主，抵御外來微生物的入侵。張韻等（2017）從健康仔豬糞便中獲得4 株凝結(jié)芽孢桿菌均表現(xiàn)出良好的黏附性能，其中凝結(jié)芽孢桿菌BC303 對(duì)仔豬腸黏膜的黏附率達(dá)到41.67%。通過在仔豬腸黏膜上高效定植，與致病菌形成競(jìng)爭(zhēng)性排斥，維持腸道健康。

1.3 抗逆性

凝結(jié)芽孢桿菌芽孢體狀態(tài)具有耐胃酸、耐膽鹽、耐高溫高壓、復(fù)活率高等特性，是其能夠通過動(dòng)物胃腸道、并且滿足顆粒飼料加工條件的重要保障。凝結(jié)芽孢桿菌NJ102在pH 2.5模擬胃液中處理12 h，存活率為71.9%；在pH 8.0、膽鹽濃度為0.3%的模擬腸液中處理12 h，存活率為84.4%。嚴(yán)濤等（2018）將凝結(jié)芽孢桿菌BC01 分別置于模擬胃液和0.3%膽鹽溶液處理120 min，存活率達(dá)到94.0%和84.3%。姚勇芳等（2017）發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌在pH 2.0～6.0、豬膽鹽含量為0.2%～0.4%環(huán)境中存活率為100%。韓明渠等（2020）將凝結(jié)芽孢桿菌在模擬胃液中處理180 min和0.6%膽鹽溶液中處理6 h，存活率仍然達(dá)到72.7%和54.5%。金迅等（2018）研究報(bào)道，凝結(jié)芽孢桿菌13002用0.3%膽鹽溶液處理12 h，存活率為69.8%；80 ℃高溫處理10 min，存活率為72.3%。王金果等（2010）將凝結(jié)芽孢桿菌100 ℃水浴10 min，芽孢體的存活率仍保持在96.4%。孫小沛（2013）生產(chǎn)試驗(yàn)表明，80 ℃飼料制粒，凝結(jié)芽孢桿菌存活率為92.9%，與枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌相當(dāng)。

1.4 抑菌性

凝結(jié)芽孢桿菌在其生長(zhǎng)代謝過程中分泌的L-乳酸、抗菌肽和凝固素等抑菌物質(zhì)能共同抑制腸道內(nèi)多種致病性病原菌，降低動(dòng)物發(fā)病率。另一方面，凝結(jié)芽孢桿菌抗菌譜廣，與有害菌共存具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，對(duì)宿主健康起促進(jìn)作用。體外腸道模擬試驗(yàn)證明，凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌、糞腸球菌、創(chuàng)傷弧菌和綠膿桿菌等都具有顯著溶解作用。凝結(jié)芽孢桿菌BC01對(duì)大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、豬霍亂沙門氏菌等病原菌都有較強(qiáng)的抑制作用。凝結(jié)芽孢桿菌NJ102對(duì)大腸桿菌K88、大腸桿菌K99、無乳鏈球菌和嗜水氣單胞菌有抑制作用。凝結(jié)芽孢桿菌13002 對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有抑菌活性，抑菌圈直徑達(dá)13.650 mm和14.367 mm。凝結(jié)芽孢桿菌BC147、凝結(jié)芽孢桿菌BC235、凝結(jié)芽孢桿菌BC303和凝結(jié)芽孢桿菌BC310 對(duì)大腸桿菌K88、雞腸炎沙門菌、豬腸炎沙門菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌等均表現(xiàn)出良好的抑菌作用。

1.5 調(diào)節(jié)腸道功能

凝結(jié)芽孢桿菌進(jìn)入胃腸道后，通過消耗游離氧，創(chuàng)造有利于益生菌的低氧環(huán)境，抑制需氧致病菌和腐敗微生物的生長(zhǎng)，維持腸道微生態(tài)平衡。蘇麗娟等（2015）研究報(bào)道，肉雞飲水中添加高劑量的凝結(jié)芽孢桿菌，顯著增加盲腸乳酸菌數(shù)量，顯著減少大腸桿菌類致病菌數(shù)量。與此同時(shí)，凝結(jié)芽孢桿菌還能促進(jìn)腸道形態(tài)發(fā)育，改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，維持腸黏膜完整性屏障功能，提高飼料利用率和動(dòng)物生產(chǎn)性能。Wu 等（2018）研究表明，凝結(jié)芽孢桿菌可顯著提高感染產(chǎn)氣莢膜梭菌肉雞腸黏膜完整性、小腸絨毛高度和絨隱比。

1.6 促進(jìn)消化

凝結(jié)芽孢桿菌在其生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生消化酶和多種代謝物質(zhì)可以促進(jìn)機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。分泌的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、β-半乳糖苷酶及乳酸脫氫酶等多種消化酶和酶促因子，可降解日糧中復(fù)雜碳水化合物和消除抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的消化利用。產(chǎn)生的氨基酸、維生素、短鏈脂肪酸和促生長(zhǎng)因子等可直接供動(dòng)物消化利用。凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)生的乳酸，可以促進(jìn)動(dòng)物對(duì)鐵、磷、鈣和維生素D的消化利用。

1.7 改善免疫機(jī)能

凝結(jié)芽孢桿菌可促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞增殖，刺激輔助性T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子以及增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞（NK）與吞噬細(xì)胞活力，提高體液免疫和細(xì)胞免疫水平。凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)物及細(xì)胞壁成分可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和增強(qiáng)細(xì)胞吞噬作用，提高腸道免疫功能，促進(jìn)消化道黏膜發(fā)生免疫反應(yīng)。凝結(jié)芽孢桿菌表面含眾多活性抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生非特異性免疫反應(yīng)，提升腸絨毛吞噬細(xì)胞活力，增強(qiáng)sIgA分泌量。凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)生的胞外多糖具有增強(qiáng)NK 細(xì)胞活性、提高動(dòng)物體液免疫和細(xì)胞免疫水平的功能。

1.8 增強(qiáng)抗氧化能力

凝結(jié)芽孢桿菌可以提高機(jī)體血清和肝臟抗氧化酶活性，減少自由基對(duì)機(jī)體細(xì)胞的損害，抑制由活性氧誘導(dǎo)的應(yīng)激和疾病。Amoah等（2019）研究表明，凝結(jié)芽孢桿菌能顯著提高血清肝臟抗氧化酶活性，抑制氧化損傷誘導(dǎo)的相關(guān)疾病。Yu等（2018）應(yīng)用不同劑量的凝結(jié)芽孢桿菌飼喂異育銀鯽幼魚，可顯著提高血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化物酶活性和谷胱甘肽含量。謝麗曲等（2013）對(duì)1～21日齡櫻桃谷鴨飼喂凝結(jié)芽孢桿菌，血清中谷胱甘肽過氧化物酶活性提高6.54%。宮秀燕等（2015）在肉雞日糧中添加凝結(jié)芽孢桿菌，可顯著提高血清總抗氧化能力和過氧化氫酶活性，緩解由沙門氏菌感染引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

2 飼用凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵制備工藝

2.1 飼用凝結(jié)芽孢桿菌選育

飼用凝結(jié)芽孢桿菌選育，除考慮對(duì)宿主動(dòng)物生產(chǎn)性能是否有利外，還需考慮其安全性、益生性和對(duì)胃腸道環(huán)境的適應(yīng)性，特別是對(duì)熱、酸性、膽鹽等環(huán)境的耐受性，確保凝結(jié)芽孢桿菌經(jīng)過胃進(jìn)入腸道仍保持活性，能夠到達(dá)指定位點(diǎn)定植并發(fā)揮益生作用。凝結(jié)芽孢桿菌選育方法包括采用天冬酰胺-甘露醇-瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，顯微鏡觀察菌體是否為革蘭氏陽(yáng)性、芽孢產(chǎn)生位置以及菌體運(yùn)動(dòng)等特性進(jìn)行初篩；進(jìn)行糖發(fā)酵特性、過氧化氫酶是否陽(yáng)性、是否僅產(chǎn)生L(＋)-乳酸以及吲哚測(cè)試和凝膠水解是否為陰性等特性進(jìn)行復(fù)篩；進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，測(cè)定16S rDNA基因序列并與模式菌株進(jìn)行凝結(jié)芽孢桿菌DNA同源性分析。姚曉紅等（2015）從斷奶仔豬腸道、菜園土壤、泡菜等不同來源樣品中分離獲得凝結(jié)芽孢桿菌BFS-2，抑菌試驗(yàn)表明，對(duì)大腸桿菌等腸道致病菌有較好的抑制效果，表明所篩選的菌株具有良好的益生性能。張韻等（2017）從健康仔豬糞便中篩選凝結(jié)芽孢桿菌，并對(duì)菌株的益生特性及安全性進(jìn)行研究，獲得益生性能良好，無毒、無抗生素抗性的凝結(jié)芽孢桿菌BC303、BC147、BC235、BC310菌株，為其工業(yè)化產(chǎn)品開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。汪攀等（2017）從池塘底泥分離獲得凝結(jié)芽孢桿菌NJ02，具有一定的抗逆性和益生特性，可改善肉雞的生長(zhǎng)性能，具備作為微生物飼料添加劑開發(fā)的潛力。嚴(yán)濤等（2018）自泡菜中篩選的凝結(jié)芽孢桿菌BC01，除具有乳酸菌的益生功能外，還具有較強(qiáng)的耐酸、耐膽鹽、耐高溫、易貯存等生物學(xué)特性，在飼料工業(yè)和養(yǎng)殖行業(yè)具有較好的應(yīng)用和開發(fā)前景。綜上，飼用凝結(jié)芽孢桿菌優(yōu)良菌株可依據(jù)形態(tài)特性、分子生物學(xué)及生理生化鑒定、抑菌能力和抗逆性分析等方法，從動(dòng)物腸道、土壤等環(huán)境中獲得。

2.2 發(fā)酵方法

飼用凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵方法包括液體發(fā)酵、固體發(fā)酵和液固兩相發(fā)酵。

2.2.1 液體發(fā)酵

液體發(fā)酵是將菌種接種到發(fā)酵罐中進(jìn)行液體培養(yǎng)的一種發(fā)酵方法。該發(fā)酵方法優(yōu)點(diǎn)為液體環(huán)境有利于菌種、底物、產(chǎn)物以及熱量的擴(kuò)散，所有發(fā)酵物料在均質(zhì)均熱的條件下進(jìn)行，發(fā)酵周期短，便于監(jiān)測(cè)和控制。王金和等（2017）對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌AHU1366液體發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，優(yōu)化后的培養(yǎng)基為麩皮4%、豆粕粉1.5%、NaCl 0.5%、K2HPO44%、MnSO430.8 mg∕L，在pH 7.2～7.4、接種量4%、溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速180 r∕min條件下培養(yǎng)56 h，凝結(jié)芽孢桿菌生物量（OD600nm）達(dá)到19.68，芽孢形成率達(dá)80%。陳明等（2017）在自動(dòng)發(fā)酵系統(tǒng)中進(jìn)行凝結(jié)芽孢桿菌TQ33 工業(yè)化液體發(fā)酵試驗(yàn)研究，明確該菌工業(yè)化生產(chǎn)培養(yǎng)基為豆餅粉20.0 g∕L、工業(yè)酵母膏7.5 g∕L、工業(yè)氯化鈉10.0 g∕L、乳糖10.0 g∕L、硫酸鎂1.0 g∕L、硫酸錳0.18 g∕L、磷酸氫二鉀3.0 g∕L，優(yōu)化后的培養(yǎng)條件為接種量4.0%、溫度50 ℃、裝液量70%、培養(yǎng)時(shí)間48 h、通氣量2.0 L∕min，發(fā)酵活菌數(shù)達(dá)到4.9×1010CFU∕g，為凝結(jié)芽孢桿菌規(guī)?；a(chǎn)提供了一種有效方法。孫標(biāo)等（2021）對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌QR-N323進(jìn)行高密度液體發(fā)酵研究，對(duì)以麩皮、玉米淀粉為碳源和氮源的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后培養(yǎng)基為麩皮36.91 g∕L、玉米漿干粉13.70 g∕L、MnSO40.84 g∕L，搖床發(fā)酵芽孢數(shù)達(dá)到2.848×1010CFU∕mL，500 L 發(fā)酵罐發(fā)酵芽孢數(shù)達(dá)到2.98×1010CFU∕mL，為降低凝結(jié)芽孢桿菌工業(yè)化生產(chǎn)成本、提高發(fā)酵活菌數(shù)和產(chǎn)孢率提供了有價(jià)值的嘗試。丁泓皓等（2021）以凝結(jié)芽孢桿菌CNJD液體發(fā)酵的生物量為研究對(duì)象，單因素試驗(yàn)確定了時(shí)間、溫度、接種量、初始pH、裝液量和轉(zhuǎn)速等發(fā)酵條件對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響，應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化研究，發(fā)酵凝結(jié)芽孢桿菌生物量達(dá)到7.86×1010CFU∕mL。

2.2.2 固體發(fā)酵

固體發(fā)酵培養(yǎng)基呈固態(tài)，培養(yǎng)基中沒有或幾乎沒有流動(dòng)水，利用自然底物作為碳源和氮源或利用惰性底物作為支持物的微生物發(fā)酵過程。固體發(fā)酵培養(yǎng)基簡(jiǎn)單，來源廣泛且成本低，發(fā)酵后處理方便，無需分離提純，清潔環(huán)保。楊柳等（2013）研究凝結(jié)芽孢桿菌CQ1固體發(fā)酵提高芽孢生成的方法，結(jié)果表明以麥麩為底物進(jìn)行固體發(fā)酵時(shí)，促進(jìn)芽孢形成能力最強(qiáng)。培養(yǎng)基麥麩中含葡萄糖1.00%、蛋白胨2.00%、磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.50%、硫酸錳（MnSO4）0.05%，在溫度37 ℃、含水量60%、初始pH 7.5的條件下固體發(fā)酵48 h，凝結(jié)芽孢桿菌CQ1芽孢生物量達(dá)到3.8×1010CFU∕g。劉惠知等（2014）選用凝結(jié)芽孢桿菌W-02固體發(fā)酵培養(yǎng)基底物為麥麩，其中含魚粉2.00 g∕kg、磷酸氫二鉀（K2HPO4）3.52 g∕kg、硝酸鈉0.34 g∕kg、一水硫酸錳0.17 g∕kg，在35 ℃、初始pH 7.0、含水量40%、接種量30%、發(fā)酵48 h，凝結(jié)芽孢桿菌菌體數(shù)達(dá)到1.62×1010CFU∕g。

2.2.3 液固兩相發(fā)酵

液固兩相發(fā)酵是指先通過液體發(fā)酵快速培養(yǎng)高活力菌體，再將高活力菌體接種到固體培養(yǎng)基上進(jìn)行二次發(fā)酵。該發(fā)酵方法集合了液體發(fā)酵周期短和固體發(fā)酵成本低、菌體生物量大的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)避免液體發(fā)酵復(fù)雜的后處理問題。湖南省微生物研究所通過構(gòu)建液體分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型，研究發(fā)酵參數(shù)與微生物代謝之間的規(guī)律，對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌液固兩相發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行研究，優(yōu)化發(fā)酵過程和培養(yǎng)基配方，實(shí)現(xiàn)了畜禽用凝結(jié)芽孢桿菌制劑產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

2.3 提高活菌數(shù)和芽孢率的發(fā)酵工藝優(yōu)化

活菌數(shù)和芽孢率是表明飼用凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)。通過優(yōu)化培養(yǎng)基組成和發(fā)酵技術(shù)參數(shù)，提高活菌數(shù)和芽孢率是飼用凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵過程的重要目標(biāo)。

2.3.1 提高活菌數(shù)的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化

為了提高凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵活菌數(shù)，崔東良等（2007）對(duì)以價(jià)廉易得的玉米粉、豆粕粉、玉米漿為主的工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了研究，按照優(yōu)化后凝結(jié)芽孢桿菌TW-05培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件，發(fā)酵24 h，活菌數(shù)達(dá)到7.5×109CFU∕mL，發(fā)酵36 h，活菌數(shù)達(dá)到9.3×109CFU∕mL。高書鋒等（2010，2013）對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌以葡萄糖、酵母膏和淀粉、大豆粉、魚粉為主的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，按優(yōu)化后的條件發(fā)酵凝結(jié)芽孢桿菌，活菌數(shù)分別達(dá)到3.8×109CFU∕mL和6.7×109CFU∕mL。郭茜等（2015）將凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1 的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化為大豆粕1%、玉米淀粉1%、碳酸鈣0.2%，在45 ℃、2%接種量、裝液量20%、pH 7.5、轉(zhuǎn)速為180 r∕min 條件下發(fā)酵48 h，活菌數(shù)達(dá)到9.53×109CFU∕mL。侯佳佳等（2018）優(yōu)化凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)基為無水葡萄糖20 g∕L、三水磷酸氫鉀（K2HPO4·3H2O）1 g∕L、七水硫酸錳（MgSO4·7H2O）0.2 g∕L、一水硫酸錳（MnSO4·H2O）0.02 g∕L、玉米漿粉17 g∕L，培養(yǎng)條件為溫度40 ℃、pH 5.5、裝液量30%、搖床轉(zhuǎn)速200 r∕min，培養(yǎng)20 h，菌體濃度達(dá)到1.66×109CFU∕mL。綜上，以廉價(jià)的農(nóng)副產(chǎn)品作為碳源和氮源，可以大大降低凝結(jié)芽孢桿菌工業(yè)化發(fā)酵成本，同時(shí)通過優(yōu)化培養(yǎng)基的組成和發(fā)酵條件，又可顯著提高發(fā)酵活菌數(shù)。

2.3.2 提高芽孢率的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化

芽孢是凝結(jié)芽孢桿菌生長(zhǎng)過程中形成的一種抗逆休眠體，芽孢的形成受培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)水平和發(fā)酵條件等因素影響，獲得高濃度、高活性的芽孢是制備凝結(jié)芽孢桿菌制劑的關(guān)鍵。Sen等（2005）采用響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵過程進(jìn)行建模，優(yōu)化溫度、pH和轉(zhuǎn)速等關(guān)鍵工藝參數(shù)對(duì)發(fā)酵的影響，將凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵活菌數(shù)提高到3.6×109CFU∕mL，芽孢形成率提高到87.93%。Das 等（2010）通過多變量響應(yīng)面建模和基于遺傳算法優(yōu)化的方法發(fā)酵凝結(jié)芽孢桿菌，芽孢數(shù)達(dá)到6×1012個(gè)∕g。液體發(fā)酵凝結(jié)芽孢桿菌，活菌數(shù)普遍可以達(dá)到109CFU∕mL，但芽孢形成率并不高。路程等（2009）、陳秋紅等（2009）、吳逸飛等（2013）、余岳等（2013）為了提高凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵芽孢率，先后對(duì)不同菌株的培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化研究，發(fā)酵芽孢數(shù)達(dá)到3.0×108～5.8×109CFU∕mL，芽孢率達(dá)到85.7%～96.7%。嚴(yán)濤等（2018）以優(yōu)化后的凝結(jié)芽孢桿菌BC01最適培養(yǎng)基和最適培養(yǎng)條件發(fā)酵，活菌數(shù)達(dá)到6.7×109CFU∕mL，產(chǎn)孢率達(dá)到89.2%。凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中應(yīng)用廉價(jià)的淀粉、豆粕粉、麩皮等原料，不僅能夠降低發(fā)酵成本，便于進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，同時(shí)對(duì)芽孢的形成也有促進(jìn)作用。付佳瑩等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，蛋白胨、淀粉和豆粕粉等培養(yǎng)基原料對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)芽孢有顯著影響，最佳添加量分別為0.5%、0.2%和1.0%，發(fā)酵液中芽孢數(shù)可達(dá)3.5×108CFU∕mL 以上。董佩佩等（2018）將凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化為麩皮32.12 g∕L、牛肉膏15.24 g∕L、硫酸鎂0.49 g∕L、硫酸錳0.34 g∕L、磷酸二氫鈉0.31 g∕L，發(fā)酵芽孢數(shù)達(dá)到3.38×108CFU∕mL，比優(yōu)化前提高了5.28倍。當(dāng)凝結(jié)芽孢桿菌TZB-5發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化為淀粉10 g∕L、豆粕粉10 g∕L、酵母粉5 g∕L、氯化鈉5 g∕L、硫酸鐵100 mg∕L、麩皮浸出液為80%時(shí)，發(fā)酵芽孢數(shù)可達(dá)5.1×109CFU∕mL，芽孢率高達(dá)98.15%。采用培養(yǎng)基組成為每升10%的麩皮水浸液中含葡萄糖15.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母浸粉20.0 g、氯化鈉10.0 g、硫酸錳0.2 g、K2HPO43.0 g發(fā)酵凝結(jié)芽孢桿菌13002，芽孢數(shù)可達(dá)3.31×109CFU∕mL。發(fā)酵過程中的溫度調(diào)控對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌芽孢率也會(huì)產(chǎn)生顯著影響。劉惠知等（2014）在凝結(jié)芽孢桿菌W-02固體發(fā)酵36 h時(shí)，將發(fā)酵溫度由35 ℃調(diào)整為40 ℃和45 ℃，芽孢率從63.7%提高到74.4%和75.9%。芽孢率的提升可能與發(fā)酵后期突然升溫導(dǎo)致的菌體生長(zhǎng)逆境有關(guān)。

2.4 飼用凝結(jié)芽孢桿菌制備工藝

凝結(jié)芽孢桿菌制備工藝包括發(fā)酵工藝和后處理工藝兩部分。發(fā)酵工藝與采用不同的發(fā)酵方法和不同的發(fā)酵過程有關(guān)。后處理工藝主要進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)物的過濾、濃縮、吸附、干燥等。后處理工藝的核心是盡可能保留和濃縮凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物中的活菌和芽孢，提高使用效果，并有利于產(chǎn)品的貯存、運(yùn)輸和使用。

2.4.1 發(fā)酵工藝

凝結(jié)芽孢桿菌活菌生長(zhǎng)和芽孢形成所需要的培養(yǎng)條件不同，發(fā)酵初期通過創(chuàng)造適宜菌體快速生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件，促進(jìn)產(chǎn)生更多的活菌。發(fā)酵后期改變培養(yǎng)條件，促進(jìn)更多的芽孢形成。劉馨磊等（2001）通過補(bǔ)加含有不同濃度葡萄糖與酵母膏的料液及不同添加方式分批發(fā)酵，可使凝結(jié)芽孢桿菌TQ33 菌體濃度達(dá)到4.5×109CFU∕mL，芽孢濃度達(dá)到1.2×109CFU∕mL。孫麗娜等（2017）應(yīng)用全自動(dòng)發(fā)酵罐進(jìn)行凝結(jié)芽孢桿菌13002 高密度分批補(bǔ)料方法培養(yǎng)，菌體濃度達(dá)到5.399 g∕L，活菌數(shù)達(dá)到3.095×109CFU∕mL。高書鋒等（2013）采用分段式補(bǔ)料批次發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵凝結(jié)芽孢桿菌，對(duì)數(shù)期補(bǔ)料淀粉、豆粉和魚粉，穩(wěn)定期補(bǔ)料碳酸鈣、磷酸二氫鈉和蛋氨酸，活菌數(shù)由6.8×109CFU∕mL提高到8.3×109CFU∕mL，芽孢率由75.78%提高到85.63%。通過分批或分段式改變發(fā)酵培養(yǎng)基組成，培養(yǎng)基性質(zhì)得以改變，凝結(jié)芽孢桿菌加強(qiáng)了對(duì)培養(yǎng)基的利用，菌體生長(zhǎng)受到刺激，衰退期延遲，芽孢率提升，對(duì)提高活菌數(shù)和芽孢形成均有促進(jìn)作用。凝結(jié)芽孢桿菌在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生大量的乳酸，造成pH下降，抑制菌體生長(zhǎng),只有將乳酸等代謝阻遏物去除，才能獲得高密度活菌發(fā)酵液。戚薇等（2003）用中空纖維膜過濾法進(jìn)行凝結(jié)芽孢桿菌TQ33 高密度發(fā)酵，當(dāng)乳酸質(zhì)量濃度達(dá)到15 g∕L 時(shí)，開始進(jìn)行過濾培養(yǎng)，最終菌體和芽孢濃度分別達(dá)到1.6×1010CFU∕mL 和1.2×1010CFU∕mL。中空纖維膜過濾法發(fā)酵培養(yǎng)凝結(jié)芽孢桿菌，雖然菌體和芽孢數(shù)得到顯著提高，但發(fā)酵設(shè)備和工藝復(fù)雜，成本較高，難以進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。常規(guī)培養(yǎng)基中的葡萄糖、蛋白胨等精細(xì)原料，不僅成本高，也不利于芽孢形成。陳勝杰等（2019）根據(jù)響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝，發(fā)酵過程中向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加廉價(jià)的淀粉、玉米秸稈水解液、氯化銨和豆粕粉等碳源和氮源，達(dá)到既降低成本，又可使凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)增加42.6%，芽孢率提高18.5%。黃曉雪等（2016）、王金和等（2017）研究表明，在發(fā)酵后期向基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入1.0%～5.0%紗布或木屑，可刺激芽孢的形成，對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)芽孢有促進(jìn)作用。綜上，不同發(fā)酵工藝均能提高凝結(jié)芽孢桿菌的活菌數(shù)和芽孢率。芽孢率和活菌數(shù)的提升直接有利于凝結(jié)芽孢桿菌抗逆性、延長(zhǎng)產(chǎn)品保存期和使用效果。

2.4.2 后處理工藝

高書鋒等（2012）確定凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵液最適吸附載體為麥麩，最適干燥方式為40 ℃恒溫干燥，生產(chǎn)過程粉碎時(shí)間嚴(yán)格控制在15 s 以內(nèi)。卜小麗等（2016）將凝結(jié)芽孢桿菌BCRC11592 發(fā)酵液采用陶瓷膜過濾設(shè)備進(jìn)行濃縮，在0.14～0.16 MPa、37～40 ℃、40 min，發(fā)酵液濃縮2.86 倍，用1∶1 的礦物質(zhì)吸附劑吸附。制備的產(chǎn)品在25 ℃和35 ℃儲(chǔ)存60 d，活菌數(shù)依舊保持108數(shù)量級(jí)。張梁等（2016）將凝結(jié)芽孢桿菌ZS0007 的發(fā)酵液離心后進(jìn)行噴霧干燥，控制進(jìn)風(fēng)溫度160 ℃，出風(fēng)溫度80 ℃，菌粉收率達(dá)2.50%，芽孢收率達(dá)86.07%。湖南省微生物研究所采用液固兩相連續(xù)發(fā)酵，在固體發(fā)酵后期升溫，即可促進(jìn)芽孢的形成，同時(shí)又進(jìn)行了產(chǎn)品干燥。蘇雪鋒等（2014）探討了載體不同添加量的芽孢菌泥含水量隨時(shí)間變化的關(guān)系，將含芽孢數(shù)大于2×108CFU∕mL的凝結(jié)芽孢桿菌NJ39菌泥在載體添加量為1倍、冷阱溫度-45 ℃、真空度20 Pa，冷凍干燥10 h，菌粉含水量降到5%以下，芽孢數(shù)達(dá)到1010CFU∕g。飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑的含水量影響產(chǎn)品中芽孢體的穩(wěn)定性。趙樹平等（2014）建議飼用凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品含水量應(yīng)控制在8%以下。

3 飼用凝結(jié)芽孢桿菌展望

凝結(jié)芽孢桿菌具有優(yōu)良的益生性能，作為替抗飼料添加劑有著廣闊的應(yīng)用前景，已成為我國(guó)畜牧行業(yè)重點(diǎn)研發(fā)菌株，越來越多的科技人員和企業(yè)參與其中。目前飼用凝結(jié)芽孢桿菌在益生機(jī)理、作用機(jī)制以及微生物發(fā)酵制備等方面的技術(shù)體系尚需完善，存在著一些亟待解決的問題。

凝結(jié)芽孢桿菌芽孢形成的分子生物學(xué)機(jī)理以及對(duì)動(dòng)物促生長(zhǎng)和防病的益生機(jī)制尚未完全明晰。研究不同發(fā)酵工藝及參數(shù)、凝結(jié)芽孢桿菌有效活菌數(shù)、芽孢形成相關(guān)調(diào)控因子的關(guān)聯(lián)關(guān)系，將為提高飼用凝結(jié)芽孢桿菌芽孢率、進(jìn)而提高產(chǎn)品質(zhì)量提供理論基礎(chǔ)。深入探究飼用凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)不同動(dòng)物、不同生理階段的促生長(zhǎng)和防病益生機(jī)制，將為產(chǎn)品的推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

發(fā)酵過程普遍存在易污染、發(fā)酵周期長(zhǎng)、芽孢率低、成本高等制約凝結(jié)芽孢桿菌生產(chǎn)的關(guān)鍵因素，距實(shí)現(xiàn)高科技產(chǎn)業(yè)化之路尚有距離。結(jié)合凝結(jié)芽孢桿菌特性，在工業(yè)生產(chǎn)過程中研發(fā)飼用凝結(jié)芽孢桿菌包括優(yōu)良菌株選育、培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝優(yōu)化、發(fā)酵、后處理、貯存、運(yùn)輸?shù)仍趦?nèi)的一體化系統(tǒng)工藝、技術(shù)及設(shè)備，對(duì)降低產(chǎn)品污染率、縮短發(fā)酵周期、增加芽孢率、提升飼用凝結(jié)芽孢桿菌技術(shù)經(jīng)濟(jì)性都有重要意義。