甲真菌病患者甲微生物群分析

胡堅 張舒煜,2 張文革 閆紫恒 李厚敏

(1. 北京大學(xué)人民醫(yī)院皮膚科，北京 100044；2. 廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，廈門 361003)

健康皮膚的表面存在著常駐微生物群，在抵御外來微生物入侵、激活固有免疫、維持皮膚微生態(tài)平衡等方面起著重要作用[1]。隨著第二代測序技術(shù)的發(fā)展與廣泛應(yīng)用，對常駐微生物群的構(gòu)成及其與免疫系統(tǒng)相互作用的了解逐漸深入[2]。以往的研究證實足癬患者與健康人的足部皮膚具有不同的微生物群，可能與足癬的發(fā)病具有密切聯(lián)系[3-4]。甲真菌病常與足癬伴發(fā)，病程長且治療困難，病甲作為身體其他部位真菌感染的潛在來源，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[5]。雖然依靠培養(yǎng)的方法，也能發(fā)現(xiàn)某些甲真菌病病甲中存在多種真菌的混合感染或真菌合并細(xì)菌的多重感染，但目前仍缺乏對甲真菌病微生物群的了解，深入分析和比較微生物群的構(gòu)成，研究共生真菌、細(xì)菌與致病真菌的相互作用，能夠為更好地理解甲真菌病的發(fā)病機制、為發(fā)現(xiàn)治療甲真菌病的潛在靶點提供思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集來源于2019年9月至2019年12月期間，就診于北京大學(xué)人民醫(yī)院皮膚科、診斷為甲真菌病的患者(入選標(biāo)準(zhǔn)為：①具有典型的臨床表現(xiàn)；②真菌鏡檢陽性；③就診前3個月內(nèi)未口服抗真菌、抗細(xì)菌藥，1個月內(nèi)未外用抗真菌藥、抗細(xì)菌藥)。

1.2 真菌鏡檢、培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)鑒定

直接鏡檢 75%的酒精消毒，無菌鈍刀刮取病變明顯部位的甲屑，熒光染色后制片，顯微鏡下觀察菌絲的形態(tài)。

真菌培養(yǎng)及鑒定 將真菌鏡檢陽性的甲屑多點接種于含氯霉素(50 mg/L)的沙堡弱培養(yǎng)基，置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～4周，觀察菌落生長情況，若4周后仍無菌落生長則為陰性。培養(yǎng)陽性的致病菌進行分離純化，形態(tài)學(xué)及ITS區(qū)序列鑒定。

1.3 致病菌微生態(tài)分析

分組及取材 共收集47例患者及7例健康志愿者的甲屑。47例患者病甲甲屑為病例組，取其中29例僅單側(cè)受累患者的對側(cè)健甲甲屑為自身對照組，健康志愿者的正常甲屑為健康對照組。75%酒精消毒，用無菌生理鹽水潤濕棉簽，擦拭指(趾)甲表面，再用鈍刀片或指甲剪刮取/剪下甲屑，最后用同一棉簽再次擦拭甲面。收集棉簽與刮刀采集的全部甲屑于1.5 mL無菌EP管內(nèi)，并于-80℃凍存。

分子生物學(xué)鑒定 提取甲屑DNA，對細(xì)菌16S rDNA V3-V4區(qū)、真菌ITS1及ITS4進行擴增。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建，并通過Q-PCR定量。利用Uparse軟件(V7.0.1，http://www.drive5.com/uparse/)進行聚類，對OTUs序列進行物種注釋，用Mothur法與Silva132(http://www.arb-silva.de/)的SSU rRNA數(shù)據(jù)庫進行物種注釋分析。使用MUSCLE軟件(V3.8.31，http://www.drive5.com/muscle/)進行快速多序列比對。使用QIIME軟件(V1.9.1)和R軟件(V2.15.3)，進行α多樣性、β多樣性、Simper分析及Spearman相關(guān)性分析。α多樣性通過Observed Species指數(shù)和Shannon指數(shù)進行分析，β多樣性通過Unweighted Unifrac距離來進行PCoA分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。菌屬及菌種分布的比較采用χ2檢驗。α多樣性O(shè)bserved Species和Shannon指數(shù)的組間差異性分析采用t檢驗或Wilcoxon檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 甲真菌病患者的臨床和真菌學(xué)結(jié)果

最終納入47例甲真菌病患者，其中男性22例，女性25例；年齡分布18～79歲，平均48.0歲(見表1)。按工作的強度和性質(zhì)對職業(yè)進行分類，純文職工作者13例(27.66%)，少量體力勞動工作者28例(59.57%)，體力勞動為主工作者6例(12.77%)。病程1個月～50年，平均62.6個月。累及趾甲者36例，指甲者5例，指/趾甲均有感染者6例。受累最多的為拇趾甲(37例)，其次是足第五趾甲(15例)。臨床表現(xiàn)分類示遠(yuǎn)端側(cè)位甲下型28例，全甲損毀型14例，淺表白斑型2例，近端甲下型1例，甲板內(nèi)型2例。

表1 47例甲真菌病患者的性別及年齡段分布Tab.1 Gener and age distribution of 47 patients with onychomycosis 例(%)

47例甲屑標(biāo)本全部鏡檢陽性，培養(yǎng)陽性22例(46.81%)。共分離出致病真菌25株：包括皮膚癬菌15株(60.0%)，其中紅色毛癬菌12株(48.0%)、趾間毛癬菌3株(12.0%)；酵母菌2株(8.0%)：白念珠菌1株(4.0%)、毛孢子菌屬1株(4.0%)；非皮膚癬菌性霉菌8株(32.0%)：青霉屬3株(12.0%)、枝孢霉屬3株(12.0%)、曲霉屬1株(4.0%)、球毛殼菌1株?；旌细腥?例(6.38%)，分別為紅色毛癬菌合并毛孢子菌屬、青霉屬合并枝孢霉屬、青霉屬合并曲霉屬感染。

2.2 測序得到的真菌和細(xì)菌的相對豐度

病例組真菌DNA擴增合格14例、細(xì)菌DNA擴增合格13例、真菌和細(xì)菌DNA擴增同時合格13例；自身對照組真菌DNA擴增合格2例、細(xì)菌DNA擴增合格19例、真菌和細(xì)菌DNA擴增同時合格1例；健康對照組真菌DNA擴增合格0例、細(xì)菌DNA擴增合格5例。

在種水平上，共發(fā)現(xiàn)291個真菌菌種。病例組和自身對照組均以紅色毛癬菌為主(比例分別為66.49% 、43.40%)。病例組的菌種其次為白念珠菌(5.36%)、近平滑念珠菌(1.35%)。自身對照組的菌種其次為三葉草浪梗霉(13.21%)、互隔交鏈孢霉(1.99%)。差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖1)。

圖1 甲癬患者病甲及對側(cè)健甲真菌菌種豐度Fig.1 Abundance of fungal community in diseased nails and healthy nails of patients with onychomycosis

在種水平上，共發(fā)現(xiàn)422個細(xì)菌菌種。病例組、自身對照組、健康對照組均以結(jié)核硬脂酸棒狀桿菌為主(比例分別為7.01%、 9.20% 、6.19%)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。病例組菌種相對豐度第2位為口腔放線菌(2.45%)，第3位為污泥羅氏菌(2.28%)。自身對照組菌種相對豐度第2位為污泥羅氏菌(4.54%)，第3位為杰氏棒狀桿菌(2.70%)。健康對照組菌種相對豐度第2位為混棒狀桿菌(2.27%)。污泥羅氏菌在健康對照組檢出比例很小，顯著低于病例組和自身對照組；杰氏棒狀桿菌和混棒狀桿菌在病例組中檢出比例很小，顯著低于自身對照組和健康對照組；以上差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖2)。

2.3 α多樣性分析

Observed species指數(shù)代表了每個樣本中觀察到的菌種數(shù)目，其數(shù)值越高，說明菌種豐富度越高。Shannon指數(shù)用來描述菌種豐富度和均勻度，Shannon指數(shù)值越高，表明菌群的α多樣性越高。病例組的真菌菌群的Observed species顯著高于自身對照組(P<0.01)，因此病例組的真菌菌群豐富度高于自身對照組。而細(xì)菌菌群在健康對照組的豐富度最高，之后依次為自身對照組、病例組。病例組真菌菌群的Shannon指數(shù)中位數(shù)稍低于自身對照組，但其箱型圖的離散程度高于自身對照組，說明病例組與自身對照組的多樣性差異不大。細(xì)菌菌群的Shannon指數(shù)箱形圖對比發(fā)現(xiàn)，自身對照組的中位數(shù)最高，說明自身對照組細(xì)菌菌群的多樣性較高(見圖3)。

2.4 β多樣性分析

β多樣性的比較發(fā)現(xiàn)，真菌菌群在病例組和對照組間的聚集不明顯，而細(xì)菌菌群在病例組、自身對照組和健康對照組間的聚集較明顯，自身對照組的細(xì)菌菌群與病例組和健康對照組均有部分重疊(見圖4)。

2.5 Simper分析

真菌屬水平上差異貢獻最大的菌屬依次為毛癬菌屬、念珠菌屬、浪梗霉屬、畢赤酵母菌屬等；細(xì)菌屬水平上差異貢獻最大的菌屬依次為葡萄球菌屬、羅氏菌屬、棒狀桿菌屬等。

2.6 Spearman相關(guān)性分析

在病甲的微生物群中，葡萄球菌屬與毛癬菌屬呈顯著正相關(guān)。羅氏菌屬與馬拉色菌屬和Naganishia菌屬呈顯著正相關(guān)。棒狀桿菌屬與擬鎖瑚菌屬呈顯著正相關(guān)，而與馬拉色菌屬等其他真菌呈負(fù)相關(guān)。放線菌屬與真菌的關(guān)系較為密切，其與念珠菌屬、馬拉色菌屬、Naganishia菌屬、紅酵母屬呈顯著正相關(guān)，而與毛癬菌屬顯著負(fù)相關(guān)(見圖5)。

3 討 論

本研究共分離、培養(yǎng)并鑒定致病真菌25株，其中皮膚癬菌占60.0%。盡管皮膚癬菌仍是甲真菌病最重要的致病菌，但與地區(qū)甲真菌病病原菌流行病學(xué)調(diào)查資料一致，其總體占比呈下降趨勢[6-8]；酵母菌和非皮膚癬菌性霉菌的感染比例呈上升趨勢，可能與免疫功能受損人群的增加有關(guān)[9]。本研究通過真菌培養(yǎng)分離出毛孢子菌1株，以及球毛殼菌1株，兩者均為少見的甲真菌病致病菌；此外發(fā)現(xiàn)混合感染3例，提示了甲真菌病致病菌的構(gòu)成存在復(fù)雜性，當(dāng)治療效果不佳時需根據(jù)病原菌菌種選擇合適的抗真菌藥。

趾間皮膚汗腺發(fā)達但缺乏皮脂腺，由于密閉不透氣致溫暖潮濕，利于真菌及細(xì)菌的生長。足部出汗較多的人更易發(fā)生足癬及趾甲的甲真菌病，由于長期搔抓和接觸，還可引起手癬及指甲的甲真菌病。對趾間型足癬患者及健康人趾間皮膚的微生物群研究發(fā)現(xiàn)趾間皮膚的細(xì)菌菌群主要為葡萄球菌屬、棒狀桿菌屬，并且趾間型足癬患者的鏈球菌屬豐度增加[4]。本研究揭示了甲真菌病的細(xì)菌菌群的構(gòu)成。通過Simper分析發(fā)現(xiàn)，病甲中對細(xì)菌菌群差異貢獻最大的菌屬依次為葡萄球菌屬、羅氏菌屬、棒狀桿菌屬等，與趾間皮膚的細(xì)菌菌群分布具有很大的相似性。

通過測序結(jié)果的α多樣性比較發(fā)現(xiàn)，甲真菌病患者病甲的真菌菌群的豐富度高于對側(cè)健康甲，但兩者的多樣性差異不明顯，推測甲真菌病患者的病甲和健康甲由于密切接觸具有相似的真菌菌群。而甲真菌病患者的健甲由于皮膚感染也更易被致病真菌定植，發(fā)生成為病甲的可能性增大。另一方面，甲真菌病患者健甲細(xì)菌菌群的多樣性高于病甲及健康人甲，這與β多樣性比較所發(fā)現(xiàn)的自身對照組的樣本點與病例組和健康對照組均有部分重疊具有一致性[3-4]。

β多樣性比較發(fā)現(xiàn)，真菌菌群在病例組和對照組間的聚集不明顯，推測與自身對照組樣本量過少有關(guān)，代表性不足；細(xì)菌菌群在病例組、自身對照組和健康對照組間的聚集較明顯，自身對照組的樣本點較為分散，與病例組和健康對照組均有部分重疊，提示自身對照組的細(xì)菌菌群分布有可能會由健甲向病甲轉(zhuǎn)變，首先失去健甲正常的細(xì)菌菌群分布，繼而轉(zhuǎn)變?yōu)椴〖住?/p>

Spearman相關(guān)性分析表明，真菌和細(xì)菌菌群間可能存在相互聯(lián)系。以往研究認(rèn)為，真菌可以通過多種方式與細(xì)菌相互作用，包括通過分泌信號分子、改變局部微環(huán)境和形成生物膜等[10]；微生物群之間相互合作或?qū)?，有利于菌群保持平衡，而在某些?nèi)因或外因的作用下，某些菌群的變化可能會導(dǎo)致甲內(nèi)菌群失衡，從而促進感染發(fā)生。通過上述研究結(jié)果，我們推測甲真菌病的發(fā)展可能依賴于多種微生物的協(xié)同作用，但其具體的作用方式還需要進一步的研究。

第二代測序技術(shù)的發(fā)展及廣泛應(yīng)用為我們打開了全新的視野，既往認(rèn)知中的無菌組織如乳腺組織被發(fā)現(xiàn)存在著微生物群[11]，且測序?qū)τ谖⑸锶簷z測的敏感性遠(yuǎn)高于培養(yǎng)，鑒定結(jié)果能夠精確到菌種，彌補了培養(yǎng)鑒定的不足[12]。不同種屬的微生物之間如何相互拮抗、保持平衡；這些微生物如何與宿主的免疫系統(tǒng)相互作用，與人體健康和疾病息息相關(guān)。目前對于淺部真菌感染性疾病的微生物群研究尚處于早期階段，微生物群分布的信息將為我們解決感染發(fā)生機制、新的治療方法提供新思路。