經(jīng)顱磁刺激聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療對(duì)脊髓損傷大鼠功能恢復(fù)的作用機(jī)制

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是由脊柱外傷、脊髓腫瘤等原因造成的脊髓結(jié)構(gòu)、功能的損害，主要表現(xiàn)為損傷平面以下的運(yùn)動(dòng)和感覺部分或完全消失，伴或者不伴二便功能障礙。其中外傷是最常見的發(fā)病原因。在國內(nèi)經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)，例如北京、上海等地，SCI發(fā)病率約為百萬分之50～60，并且有逐年上升的趨勢(shì)

。脊髓損傷患者除了肢體功能障礙外還可能出現(xiàn)肺部感染、泌尿系感染和壓瘡等一系列并發(fā)癥

，影響患者生活質(zhì)量的同時(shí)也給家庭和社會(huì)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。如何改善患者的肢體功能，提高日常生活能力及生存質(zhì)量，便成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟需解決的難題。

近年來,有研究者采用細(xì)胞移植的方法治療脊髓損傷動(dòng)物,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞移植法可能修復(fù)損傷脊髓結(jié)構(gòu)的連續(xù)性及促進(jìn)脊髓的神經(jīng)功能恢復(fù)

。而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)因其來源豐富、易于提取及分離和純化、多向分化潛能

、低抗原性等特點(diǎn)

，使其成為研究熱點(diǎn)。利用BMSCs治療SCI已日漸成熟，國外已有多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，行BMSCs移植治療SCI后病灶囊腔縮小，感覺及運(yùn)動(dòng)功能均有較大的改善。但其移植后促進(jìn)脊髓損傷功能恢復(fù)的機(jī)制尚無定論

。

磁刺激是使用隨時(shí)間變化的電流流入線圈，產(chǎn)生時(shí)變磁場(chǎng)，在組織內(nèi)產(chǎn)生感應(yīng)電流，從而達(dá)到興奮或抑制組織的效果。它作為一種無創(chuàng)的診斷及治療方法逐漸走進(jìn)人們的視線。已發(fā)現(xiàn)磁刺激治療是促進(jìn)脊髓損傷后功能恢復(fù)的有效方法

。先前有研究報(bào)道BMSCs和經(jīng)顱磁刺激(Transcranial magnetic stimulation，TMS)對(duì)血管性癡呆模型大鼠有協(xié)同作用

。本文旨在觀察BMSCs移植聯(lián)合TMS治療對(duì)脊髓損傷大鼠功能恢復(fù)的影響，初步探討兩者聯(lián)合作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 取8周齡的清潔級(jí)SD雌性大鼠60只，體質(zhì)量180～250g，隨機(jī)分成5組，每組12只，即：假手術(shù)組，模型組， BMSCs組，TMS組，TMS+BMSCs組。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 ①假手術(shù)組：SD大鼠按脊髓損傷制作模型方法咬除T10及部分T9、T11椎體椎板，暴露T10處脊髓背側(cè)硬脊膜，之后逐層縫合，不做打擊處理。術(shù)后7d再次暴露脊髓背側(cè)硬脊膜，注射DEME/F12培養(yǎng)基5μL。②模型組：大鼠SCI術(shù)后7d再次暴露T10處脊髓背側(cè)硬脊膜，于損傷處注射DEME/F12培養(yǎng)基5μL。③BMSCs組：大鼠SCI術(shù)后7d，用10μlHamilton微量注射器向損傷區(qū)的中心區(qū)注射5μL細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度為1×10

/μL)，注射后留針2～3min。然后緩慢退出，術(shù)畢逐層縫合。④TMS組：大鼠SCI術(shù)后24h后給予磁刺激治療。磁刺激治療方案為：頻率10Hz，刺激強(qiáng)度70%靜息運(yùn)動(dòng)閾值，刺激5s，間歇10s，共計(jì)500脈沖，治療時(shí)間總長(zhǎng)750s

。每天1次，每周5d，共4周。刺激部位：應(yīng)用直徑6cm線圈，將線圈磁場(chǎng)中心貼近大鼠頭骨正中心。術(shù)后7d于脊髓損傷處注射DEME/F12培養(yǎng)基5μL，24 h后繼續(xù)磁刺激治療。⑤TMS+BMSCs組:大鼠術(shù)后24h后給予10Hz磁刺激治療，每天1次，每周5次，共4周，術(shù)后7d于損傷處注射5μL細(xì)胞懸液，24 h后繼續(xù)磁刺激治療。

2.4 BMSCs和TMS聯(lián)合治療SCI模型脊髓軸突再生微環(huán)境的影響

脊髓損傷的治療一直是一個(gè)世界性難題，局部神經(jīng)組織破壞導(dǎo)致的神經(jīng)再生受限和神經(jīng)功能恢復(fù)障礙是治療脊髓損傷的主要障礙

。

1.3.2 免疫熒光NeuN分析 脊髓冰凍切片切成10μm厚的組織切片，用抗原復(fù)活劑處理，用PBS沖洗后用山羊血清(北京索拉寶科技有限公司)封閉15min。然后用神經(jīng)元特異性核蛋白(neuron specific nuclear protein ，NeuN)多克隆抗體(1∶100；Proteintech)，在4℃過夜，然后用Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(1∶300，Beyotime)，室溫下保持60min。用DAPI染色后，組織切片用抗熒光猝滅劑封閉。每只大鼠隨機(jī)從縱切的脊髓組織的上、中、下端每個(gè)位置隨機(jī)抽取2張片子；染色后采用熒光顯微鏡在同一光強(qiáng)度(放大倍率x400；Olympus公司)下拍攝圖像(紅、綠激光強(qiáng)度100ms用于觀察靶蛋白；藍(lán)色激光10ms)，使用Image J進(jìn)行光強(qiáng)度值的計(jì)算。以損傷區(qū)域?yàn)橹行倪M(jìn)行前、中、后取3張照片，平均每張片子上前、中、后數(shù)據(jù)后每只大鼠共有6個(gè)數(shù)據(jù)，每組共計(jì)收集36個(gè)數(shù)據(jù)。

1.2.4 脊髓組織灌流固定 取術(shù)后4周大鼠，2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉(50 mg/Kg)行腹腔麻醉，將大鼠仰臥位剪開上腹部，并將膈肌沿兩側(cè)向上剪開，以“V”字形剪短肋骨，用止血鉗翻開，充分暴露心臟。4℃預(yù)冷PBS溶液用輸液袋裝滿，并連接20ml注射器針頭，剪開心外膜，將針頭經(jīng)心尖刺入主動(dòng)脈，剪開右心耳。每組中取6只應(yīng)用4℃PBS 250ml進(jìn)行心臟灌洗，觀察肝臟紅變白后，改用4%多聚甲醛，直到大鼠出現(xiàn)肢體震顫及僵硬，停止灌注。4℃冰箱固定5min后進(jìn)行取材。剪取大鼠胸腰段脊髓，取以損傷處為中心長(zhǎng)約2cm的脊髓，用PBS漂洗后，放入4%多聚甲醛中4℃固定24h。隨后采用15%、20%、30%蔗糖溶液4℃梯度沉糖脫水，OCT包埋后放置于冷凍冰箱用于后續(xù)免疫熒光染色。每組取另外6只大鼠直接用4℃PBS進(jìn)行脊髓灌注，取胸腰段脊髓損傷處中心長(zhǎng)約1cm的脊髓，-80℃超低溫冰箱中保存以進(jìn)行免疫印跡分析。

畫有不落纖塵之明澈，是林容生藝術(shù)最大的特色。林容生的畫以“具體”為勝，山石坡峰，林木莊稼，房屋的窗欞階壁，溪流的委婉走向，在他的畫中都清晰如許。正是由于他的用筆用線十分豐富并有著極深的線造型功力，他才能如此悉心而從容地勾勒物象的形貌，使筆線在塑形的同時(shí)，盡情展現(xiàn)出變化的意趣， 透溢出使驅(qū)者的興味與情懷。另一方面，他長(zhǎng)期研究墨與色的關(guān)系，將“隨類敷彩”上升為“以意敷彩”，控制墨與色的比度，把握色調(diào)的美感，讓人看到一種滲透了當(dāng)代意識(shí)的“青綠山水”。面對(duì)他的山水，一股無有霧霾的清爽氣息拂面而來，總是讓人滿目明澈。

1.3 評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

2.3 BMSCs和TMS治療對(duì)SCI模型神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白的影響 Westernblot檢測(cè) SCI 28d后各組大鼠脊髓損傷處GFAP蛋白表達(dá)：脊髓損傷后，GFAP表達(dá)明顯增高。與模型組比較，TMS、BMSCs組及TMS+BMSCs聯(lián)合治療組GFAP蛋白表達(dá)均明顯降低(

<0.01)，聯(lián)合組較BMSCs組及TMS組表達(dá)明顯降低(

<0.01)。見圖3。

1.2.3 BMSCs的分離提取

取4周齡體質(zhì)量90～110g的GFP幼鼠，2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉(50 mg/Kg)行腹腔麻醉，在無菌操作臺(tái)下分離取出幼鼠的股骨和脛骨，除去其上所附的軟組織及肌肉。無菌條件下剪斷股骨和脛骨骨干兩端，用5 ml注射器吸取DMEM/F12培養(yǎng)基，插入露出的骨髓腔反復(fù)沖洗、吹打，將沖洗出的細(xì)胞制成均勻的細(xì)胞懸液，取310g的細(xì)胞懸液離心后棄上清，加入3ml的紅細(xì)胞裂解液，吸管吹均靜置后再次離心，棄上清，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。取形態(tài)較均一、生長(zhǎng)速度較快的P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)第3代細(xì)胞表面標(biāo)記物CD11b、CD29、CD90和CD45，流式結(jié)果顯示，分離得到的BMSCs細(xì)胞表面標(biāo)記物CD11b和CD45為陰性，CD29和CD90為陽性。提示BMSCs分離提取成功。

2.2 BMSCs與TMS治療對(duì)SCI模型損傷處神經(jīng)元的影響 免疫熒光檢測(cè)SCI 28d后各組脊髓NeuN的表達(dá)，脊髓損傷組較假手術(shù)組NeuN表達(dá)明顯減少；同SCI組比較，BMSCs移植后，NeuN表達(dá)較模型組增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TMS治療后，NeuN表達(dá)較模型組增加(

<0.05)；TMS和BMSCs聯(lián)合組與模型組及BMSCs組和TMS組比較，NeuN陽性表達(dá)明顯增加(

<0.01)。見圖1。 Westernblot檢測(cè)SCI 28d后各組大鼠脊髓損傷處NeuN的蛋白表達(dá),與模型組比較，BMSCs、TMS、TMS+BMSCs聯(lián)合組較模型組NeuN表達(dá)顯著增加(

<0.01)；TMS+BMSCs聯(lián)合組較BMSCs組及TMS組NeuN的蛋白表達(dá)增加(

<0.01)。見圖2。

現(xiàn)代多自由度并聯(lián)式力控末端執(zhí)行器屬于多輸入多輸出系統(tǒng)。它由多個(gè)支鏈組成，支鏈間存在耦合，且每個(gè)支鏈至少有1個(gè)恒力補(bǔ)償作動(dòng)部件，工具頭的最終輸出力和姿態(tài)由各支鏈及其恒力補(bǔ)償作動(dòng)部件決定。因此，應(yīng)對(duì)它進(jìn)行解耦控制技術(shù)研究，減小或消除各支鏈間的相互干擾，提高力控末端執(zhí)行器的動(dòng)靜態(tài)性能及其可靠性。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs移植、TMS及TMS聯(lián)合BMSCs治療促進(jìn)大鼠SCI后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù) 所有大鼠術(shù)后即出現(xiàn)雙后肢癱瘓，24h后BBB評(píng)分為0分，提示SCI模型建立成功。術(shù)后14d，進(jìn)行各治療組間BBB評(píng)分比較，BMSCs及TMS治療組較模型組評(píng)分有所提高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TMS聯(lián)合BMSCs組評(píng)分較模型組及BMSCs組和TMS組提高(

<0.01)，BMSCs組和TMS組組間評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后28d，BMSCs組、TMS組及TMS聯(lián)合BMSCs組評(píng)分均較模型組提高(

<0.01)，且TMS聯(lián)合BMSCs組較BMSCs組和TMS組評(píng)分提高(

<0.01)，BMSCs組和TMS組組間評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

1.3.3 蛋白免疫印跡 GFAP、GAP-43、Nogo-A分析用全細(xì)胞裂解試劑盒(沈陽萬類生物有限公司)從大鼠脊髓組織中提取總蛋白，然后用BCA蛋白分析試劑盒(沈陽萬類生物有限公司)定量。用40%的聚丙烯酰胺凝膠(PVDF)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到微孔膜上(每孔用PVDF分離12%)。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1h后，將細(xì)胞膜與以下主要抗體在4℃下培養(yǎng)過夜：抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein ，GFAP)兔多克隆抗體(1∶500；沈陽萬類生物有限公司)；抗生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(Growth associated protein 43，GAP-43)兔單克隆抗體(1∶10000；Abcam)；抗神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子A(Neurite outgrowth inhibitor -A ，Nogo-A)兔多克隆抗體(1∶1500；novusbio)與β-肌動(dòng)蛋白兔多克隆抗體(1∶1000；沈陽萬類生物有限公司)。然后用TBS-T緩沖液沖洗膜，并與HRP結(jié)合的羊抗兔IgG(1∶5000)或山羊抗兔IgG(1∶5000)抗體(沈陽萬類生物有限公司)在37℃下孵育45min。使用ECL發(fā)光試劑(沈陽萬類生物有限公司)觀察蛋白質(zhì)，并使用Gel Pro分析儀4.0版(媒體控制論公司)對(duì)條帶的光密度值進(jìn)行量化。

1.3.1 大鼠雙后肢的運(yùn)動(dòng)功能觀察 按運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分(Basso Beattie Bresnahan，BBB)評(píng)定細(xì)則，評(píng)價(jià)所有實(shí)驗(yàn)大鼠的后肢關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)、步行能力、四肢的協(xié)調(diào)性及穩(wěn)定性。分別在術(shù)前、術(shù)后1d、14d、28d進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)定時(shí)，將大鼠置于直徑100cm、高30cm的透明空心圓柱體內(nèi)，雙人盲法觀察并進(jìn)行大鼠后肢的行走和肢體活動(dòng)評(píng)定。BBB評(píng)分完全癱瘓的大鼠為0分，正常大鼠21分，SCI大鼠的功能情況介于兩者之間，每只動(dòng)物觀察4min。

學(xué)前教育專業(yè)學(xué)生今后的教學(xué)對(duì)象主要是學(xué)齡前的兒童，在學(xué)前鋼琴基礎(chǔ)、幼兒歌曲彈唱與律動(dòng)、兒歌即興伴奏等課程中加入一定比例的畬族童謠的歌曲，不僅繼承了傳統(tǒng)畬族音樂，同時(shí)隨著畢業(yè)生的就業(yè)，還可無形中在學(xué)齡前的孩子們心中埋下傳播寧德特有的畬族傳統(tǒng)民歌的種子。

按照黨中央、國務(wù)院決策部署，我國自2019年1月1日起，調(diào)整跨境電商零售進(jìn)口稅收政策，提高享受稅收優(yōu)惠政策的交易限制，并且擴(kuò)大商品清單范圍。稅收政策調(diào)整包括：將年度交易限值由每人每年20000元調(diào)整至26000元，今后隨著居民收入的提高，相機(jī)調(diào)增；將單次交易限值由每人每次2000元調(diào)整至5000元，并明確已經(jīng)購買的跨境電商零售進(jìn)口商品不得進(jìn)入國內(nèi)市場(chǎng)再次銷售。

因人員流動(dòng)較慢，上升渠道狹窄等原因，鄉(xiāng)鎮(zhèn)財(cái)政人員存在整體水平普遍不高、年齡偏大、學(xué)歷偏低、素質(zhì)較弱的問題。許多新參加工作的大學(xué)生更傾向于在鄉(xiāng)鎮(zhèn)組織辦等工作出彩多的部門工作，致使專業(yè)人才難以補(bǔ)充到鄉(xiāng)鎮(zhèn)財(cái)所隊(duì)伍，出現(xiàn)人才斷檔。

在購買者表現(xiàn)出自我感知時(shí)，購買者會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)樽晕腋兄男睦斫嚯x中。在對(duì)商品進(jìn)行促銷時(shí)，價(jià)格促銷給予購買者感知性利潤(rùn)，能夠立即出現(xiàn)自我感知。而贈(zèng)送式促銷，通過贈(zèng)品的方式使得消費(fèi)者獲得實(shí)際可感的實(shí)惠，在心理近距離背景下，其購買力也能產(chǎn)生良好的作用。

2.4.1 Westernblot檢測(cè)SCI 28d后各組大鼠脊髓損傷處GAP-43蛋白表達(dá) 與模型組比較，BMSCs、TMS組及TMS+BMSCs組GAP-43蛋白表達(dá)增加(

<0.01)，其中TMS+BMSCs組較BMSCs組GAP-43蛋白表達(dá)增加(

<0.01)，TMS+BMSCs組較TMS組比較有所增加，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4。

2.4.2 Westernblot檢測(cè)SCI 4周后各組大鼠脊髓損傷處Nogo-A蛋白表達(dá) 脊髓損傷后Nogo-A表達(dá)明顯增高。與模型組比較，BMSCs組、TMS組及TMS+BMSCs組Nogo-A蛋白表達(dá)明顯降低(

<0.01)，聯(lián)合組較單一治療組Nogo-A蛋白表達(dá)降低(

<0.01)。見圖5。

本文提出了一種基于改進(jìn)的OCS調(diào)制方式，利用UFBG-AOTF光學(xué)生成多倍頻可調(diào)諧毫米波的方法.在調(diào)制指數(shù)m=2.5π的條件下，最高倍頻因子可達(dá)22.該方案通過控制UFBG-AOTF的聲波頻率實(shí)現(xiàn)FMF的線性調(diào)諧，僅使用一個(gè)DD-MZM，靈活、簡(jiǎn)單且成本較低，同時(shí)也降低了對(duì)振蕩器及調(diào)制器的頻率要求.此外，提高DD-MZM的調(diào)制系數(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)更高倍頻因子毫米波信號(hào)的產(chǎn)生.同時(shí)，對(duì)倍頻因子為22時(shí)系統(tǒng)下行鏈路傳輸性能的分析表明，在只將基帶數(shù)據(jù)信號(hào)調(diào)制到其中一個(gè)邊帶上的OCS改進(jìn)方案中，信號(hào)可以進(jìn)行長(zhǎng)距離且性能更穩(wěn)定的傳輸，有效避免了色散所導(dǎo)致的碼元時(shí)移效應(yīng).

3 討論

1.2.2 SCI模型制作 實(shí)驗(yàn)大鼠用2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉(50mg/Kg)進(jìn)行腹腔麻醉，大鼠俯臥于操作臺(tái)，背部剃毛備皮，常規(guī)皮膚消毒，以T10棘突為中心作長(zhǎng)約3cm的切口，剝離周圍軟組織及椎旁肌肉，顯露并用血管鉗咬除T10及部分上、下椎體的棘突和兩側(cè)椎板，暴露脊髓背側(cè)硬脊膜。采用Allen’s法

，制備大鼠T10脊髓打擊傷模型。將大鼠固定在致傷裝置底座上，調(diào)整沖擊棒套管下端使其弧面緊貼脊髓背側(cè)硬脊膜，之后用10g沖擊棒自10 cm高處自由下落擊打脊髓，造成急性脊髓損傷模型，沖擊棒直徑2mm，致傷能量為100 gcf。打擊后大鼠暴露硬脊膜處可見血腫，硬脊膜完整呈紫紅色，膨隆，大鼠若出現(xiàn)短暫的雙后肢痙攣及擺尾動(dòng)作，則標(biāo)志造模成功。在脊髓損傷正上方留置硅膠薄膜，方便二次注射時(shí)找出損傷部位。切口處用生理鹽水沖洗，并滴加小劑量青霉素，逐層縫合肌肉、軟組織。術(shù)后直至大鼠麻醉蘇醒時(shí)注意保溫，術(shù)后每日行青霉素腹腔注射，連續(xù)3日。每日輔助排尿2次，直至排尿反射建立。

早在20世紀(jì)初，即有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，BMSCs具有促進(jìn)神經(jīng)功能再生的潛能，與BMSCs共培養(yǎng)，促進(jìn)了神經(jīng)元細(xì)胞的分化，顯著提高了脊髓損傷大鼠的功能恢復(fù)

。趙文濤等人對(duì)國內(nèi)外領(lǐng)域相關(guān)發(fā)表文章進(jìn)行了一項(xiàng)系統(tǒng)評(píng)價(jià)及Meta分析，其中共納入6個(gè)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，252名患者

，通過分析指出：間充質(zhì)干細(xì)胞能提高脊髓損傷患者的ASIA觸覺及日常生活能力評(píng)分及Frankel損傷分級(jí)；但在ASIA運(yùn)動(dòng)評(píng)分和膀胱殘余尿量方面效果不顯著。說明間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷有一定療效。

雖然BMSCs對(duì)脊髓損傷治療有著一定的效果，但其治療機(jī)制至今仍然沒有定論。目前認(rèn)為BMSCs治療脊髓損傷的機(jī)制主要有：①有研究認(rèn)為，在一定條件下，BMSCs可以被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞

，遷移至損傷部位，填充脊髓損傷后形成的囊腔，縮小囊腔范圍。②BMSCs通過分泌神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)因子，如：神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)

，對(duì)突觸的傳遞及可塑性亦發(fā)揮重要的作用

。③BMSCs可以通過抑制不利于再生的膠質(zhì)瘢痕形成，促進(jìn)軸突再生。在亞急性期和慢性期和下調(diào)瘢痕組織區(qū)域軸突生長(zhǎng)抑制因子Nogo-A的釋放。同時(shí)，以旁分泌形式釋放的神經(jīng)營養(yǎng)因子亦為軸突再生創(chuàng)造了良好的微環(huán)境。

經(jīng)顱磁刺激自1985年發(fā)現(xiàn)以來，已被廣泛應(yīng)用于治療多種神經(jīng)退行性疾病。例如，重復(fù)性經(jīng)顱磁刺激通過激活β-catenin促進(jìn)Alzheimer病大鼠的認(rèn)知功能和神經(jīng)元存活

。由經(jīng)顱磁刺激產(chǎn)生的磁場(chǎng)，通過延長(zhǎng)神經(jīng)元的壽命、增加神經(jīng)元的數(shù)量改善了帕金森病大鼠的認(rèn)知功能

。磁刺激已被發(fā)現(xiàn)可作為促進(jìn)脊髓損傷后功能恢復(fù)的有效方法，對(duì)脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)、疼痛、痙攣、二便功能障礙等均有不同的治療作用。磁刺激的治療機(jī)制與其抑制神經(jīng)元的過度興奮、降低神經(jīng)炎性反應(yīng)、改變血腦屏障通透性、促進(jìn)神經(jīng)元存活有關(guān)。有研究顯示，皮層抑制功能降低與脊髓損傷后自然恢復(fù)相關(guān)，磁刺激能夠通過調(diào)節(jié)皮質(zhì)束的功能促進(jìn)脊髓損傷后的功能恢復(fù)。

由于TMS和BMSCs都有改善脊髓損傷后功能障礙的作用，BMSCs與TMS聯(lián)合治療對(duì)脊髓損傷大鼠的神經(jīng)損傷是否有更好的修復(fù)作用值得探討。以往的研究表明BMSCs與TMS聯(lián)合治療對(duì)血管性癡呆大鼠有協(xié)同作用，BMSCs+TMS聯(lián)合治療后VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的恢復(fù)較單純TMS治療更為顯著，提示BMSCs+TMS聯(lián)合應(yīng)用治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病更為有效

。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BMSCs+TMS聯(lián)合治療較單一治療組顯著提高了SCI大鼠BBB評(píng)分，同時(shí)脊髓損傷處NeuN陽性細(xì)胞數(shù)增加，聯(lián)合治療效果更為顯著，提示TMS可能通過促進(jìn)BMSCs分泌神經(jīng)生長(zhǎng)因子及改善局部微環(huán)境促進(jìn)脊髓損傷后大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，與以前的研究結(jié)果一致。

SCI損傷后影響功能恢復(fù)的因素主要包括繼發(fā)性損傷；炎性因子的分泌；微環(huán)境的變化；膠質(zhì)瘢痕的形成等。中樞神經(jīng)系統(tǒng)可塑性理論不同于傳統(tǒng)的中樞神經(jīng)損傷不可逆的觀點(diǎn)，認(rèn)為脊髓損傷后軸突的生長(zhǎng)對(duì)神經(jīng)再生及功能恢復(fù)至關(guān)重要。損傷處的軸突可通過殘端出芽的形式再生，或通過殘留軸突側(cè)支出芽的形式再生，并延伸至到相應(yīng)的靶細(xì)胞以形成新的突觸聯(lián)系，并在一定程度上恢復(fù)對(duì)靶細(xì)胞的神經(jīng)支配。同時(shí)，也可以在重塑代償機(jī)制發(fā)揮作用，例如上調(diào)神經(jīng)遞質(zhì)分泌，改善軸突周圍的生長(zhǎng)環(huán)境等

。但是成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)再生能力極其微弱，這除了因?yàn)镃NS神經(jīng)元自身的再生能力下降以外，更重要的是CNS神經(jīng)元內(nèi)外環(huán)境受各種外源性抑制性因子的影響，其中髓鞘碎片分泌的髓鞘相關(guān)抑制因子Nogo-A具有限制軸突的延伸及中樞系統(tǒng)損傷后軸突再生的能力

。研究發(fā)現(xiàn)，SCI后Nogo-A的表達(dá)逐漸升高，導(dǎo)致神經(jīng)再生困難

。與Nogo-A作用相反的是，生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(GAP-43)在SCI后可以通過加速生長(zhǎng)錐基底部細(xì)胞膜的擴(kuò)張而促進(jìn)軸突再生。GAP-43是一種神經(jīng)組織特異性磷酸蛋白，廣泛存在于神經(jīng)組織中,尤其是在生長(zhǎng)、分化和再生的軸突末端以及突觸前膜。因?yàn)镚AP-43在神經(jīng)元生長(zhǎng)錐中特異表達(dá)，在突起生長(zhǎng)和突觸形成過程中表達(dá)上調(diào)，使其成為神經(jīng)再生的理想標(biāo)志物

。而膠質(zhì)瘢痕的主要成分GFAP則通過抑制軸突再生來阻止神經(jīng)元再生，脊髓損傷的嚙齒動(dòng)物中GFAP表達(dá)升高

。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：①脊髓損傷后GFAP表達(dá)顯著上調(diào)，BMSCs及TMS治療后GFAP陽性細(xì)胞數(shù)有所減少，但聯(lián)合治療組陽性細(xì)胞數(shù)減少最為顯著，且較單一治療組陽性細(xì)胞數(shù)亦有減少。②脊髓損傷后GAP-43的表達(dá)顯著降低，BMSCs及TMS治療組可見GAP-43上調(diào)，而TMS聯(lián)合BMSCs組GAP-43上調(diào)最為顯著，且上調(diào)效果優(yōu)于BMSCs組。③脊髓損傷后Nogo-A的表達(dá)顯著增加，BMSCs及TMS治療組可見Nogo-A下調(diào)，但對(duì)比模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而TMS聯(lián)合BMSCs組Nogo-A下調(diào)最為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3.1 小鼠LLC細(xì)胞培養(yǎng)及肺癌移植瘤模型建立 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LLC細(xì)胞，制成1×106個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液；0.2 mL/只，皮下注射入30只C57/BL6小鼠左側(cè)腋下，觀察、記錄LLC小鼠生長(zhǎng)及成瘤情況。

本研究通過應(yīng)用BMSCs、TMS及TMS+BMSCs聯(lián)合治療SCI大鼠，觀察發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組SCI大鼠BBB評(píng)分顯著高于單一治療組，即聯(lián)合治療組大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)優(yōu)于單一治療組，可能與TMS促進(jìn)BMSCs分泌GAP-43，抑制GFAP及Nogo-A的分泌，從而改善了脊髓損傷后局部的微環(huán)境，促進(jìn)了軸突的再生相關(guān)。聯(lián)合治療組神經(jīng)元較單純治療組增多，是否因TMS促進(jìn)了BMSCs向神經(jīng)元的分化，或因局部微環(huán)境改善促進(jìn)了神經(jīng)元的存活，仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)以證實(shí)。

[1] National Spinal Cord Injury Statistical Center．Spinal cord injury(SCI)：facts and figures at a glance[R/OL]．2017,1-2．https://www.nscisc.uab.edu/reports.aspx.

[2] Eckert MJ, Martin MJ. Trauma: spinal cord injury[J]. Surg Clin North Am, 2017, 97(5): 1031-1045.

[3] Lee BB, Cripps RA, Fitzharris M, et al. The global map for traumatic spinal cord injury epidemiology: update 2011, global incidence rate[J]. Spinal Cord, 2014, 52(2): 110-116.

[4] Garbossa D, Fontanella M, Fronda C, et al. New strategies for repairing the injured spinal cord: the role of stem cells[J]. Neurol Res, 2006, 28(5):500-504.

[5] Okano H, Okada S, Nakamura M, et al. Neural stem cells and regeneration of injure sPinal cord[J]. Kidney Int, 2005, 68(5):1927-1931.

[6] Xiang SY, Dusaban SS, Brown JH. Lysophospholipid receptor activation of RhoA and lipid signaling pathways[J]. Biochim Biophys Acta, 2013, 1831(1):213-222.

[7] Carrade DD, Affolter VK, Outerbridge CA, et al. Intradermal injections of equine allogeneic umbilical cord-derived mesenchymal stem cells are well tolerated and do not elicit immediate or delayed hypersensitivity reactions[J]. Cytotherapy, 2011, 13(10):1180-1192.

[8] Courtney p, Samdani AF, Betz RR, et al. Grafting of human bone marrow stromal cells into spinal cord injury: a comparison of delivery methods[J]. Spine, 2009, 34(4):328-334.

[9] Boido M, Garbossa D, Fontanella M, et al. Mesenchymal stem cell transplantation reduces glial cyst and improves functional outcome after spinal cord compression[J]. World Neurosurg, 2014, 81(1):183-190.

[10]孫劍淵,顧琦,吳勤峰,等.重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對(duì)不完全性脊髓損傷患者的臨床療效觀察[J].中國康復(fù),2019,34(6):303-306.

[11]Wang F,Zhang C, Hou S,et al. Synergistic effects of mesenchymal stem cell transplantation and repetitive transcranial magnetic stimulation on promoting autophagy and synaptic plasticity in vascular dementia[J]. Gerontol A Biol Sci Med Sci,2019,8(16): 1341-1350.

[12]向艷平,唐峰，黃曉琳等.不同頻率重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對(duì)脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能的影響[J].中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2013,28(1):3-13.

[13]Allen AR.Srugery of experimental lesion of spinal cord equivalentto crush injury of fracture dislocation of spinal column[J].Apreliminary report,1911,57(1):878-880.

[14]Yin YM,Lu Y,Zhang LX,et al.Bone marrow stromal cells transplantation combined with Ultrashortwave therapy promotes functional recovery on spinal cord injury in rats[J].Synapse,2015 Mar;69(3):139-47.

[15]Chow DS, Teng Y, Toups EG, et al. pharmacology of riluzole in acute spinal cord injury[J]. J Neurosurg Spine, 2012, 17(1): 129-140.

[16]Wu S, Suzuki Y, Ejiri Y, et al. Bone marrow stromal cells enhance differentiation of coculturedneurosphere cells and promote regeneration of injured spinal cord[J]. J Neurosci Res, 2003, 72(3): 343-351.

[17]趙文濤,李盼盼,張海峰,等.間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷：系統(tǒng)評(píng)價(jià)及Meta分析[J].中國組織工程研究,2015, 19,(36):5865-5871.

[18]Zeng X, Qiu XC, Ma YH, et a1．Integration of donor mesenchymal stem cell derived neuron like cells into host neural network after rat spinal cord transection[J]. Biomaterials, 2015, 53(2)：184-201．

[19]Zeng R, Wang LW, Hu ZB, et a1. Differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into neuron-like cells in vitro[J]. Spine, 2011, 36(13):997-1005．

[20]Hawryluk GW, Mothe A, Wang J, et a1．An in vivo characterization of trophic factor production following neural precursor cell or bone marrow stromal cell transplantation for spinal cord injury[J]. Stem Cells Dev, 2012, 21(12):2222-2238．

[21]Waterhouse EG, Xu B. New insights into the role of brain-derived neurotrophic factor in synaptic plasticity[J]. Mol. Cell. Neurosci, 2009, 42(2): 81-89.

[22]Chen X, Chen S, Liang W, et al. Administration of repetitive transcranial magnetic stimulation attenuates A(1-42)-induced Alzheimer's disease in mice by activating beta-catenin signaling[J]. Biomed Res Int, 2019, 20(9): 1431760.

[23]Ba F, Zhou Y, Zhou J, et al. Repetitive transcranial magnetic stimulation protects mice against 6-OHDA-induced parkinson's disease symptoms by regulating brain amyloid beta1-42 level[J]. Mol Cell Biochem, 2019, 458(1):71-78.

[24]Filli L, Schwab ME. Structural and functional reorganization of propriospinal connections promotes functional recovery after spinal cord injury[J]. Neural Regen Res, 2015, 10(4): 509-513.

[25]葉超群,孫天勝,劉智.脊髓損傷后軸突再生的研究進(jìn)展[J].中國脊柱脊髓雜志,2007,17(9): 715-718.

[26]黃海珍,桑鋒,王玉霞,等.Nogo在中樞神經(jīng)損傷再生中的作用機(jī)制[J].生物學(xué)雜志,2009,26(4):61-64.

[27]岳巖.小鼠脊髓損傷后Nogo-A的免疫組織化學(xué)研究[J].局解手術(shù)學(xué)雜志,2011,20(3):237-241.

[28]Wang F, Zhang C, Hou S, et al. Synergistic effects of mesenchymal stem cell transplantation and repetitive transcranial magnetic stimulation on promoting autophagy and synaptic plasticity in vascular dementia[J]. J Gerontol A Biol Sci Med Sci, 2018,74(9):1341-1350.

[29]Liu F, Liao F, Li W, et al. progesterone alters Nogo-A, GFAP and GAP-43 expression in a rat model of traumatic brain injury[J]. Mol Med Rep, 2014, 9(4): 1225-1231.