基于調(diào)控Calpain/GSK-3β信號通路對抑制大鼠酒精性心肌病心肌細胞凋亡的研究

王檬，張潔，趙繼義

酒精性心肌病（ACM）指長期大量飲酒導致左心室擴張，左室收縮功能進行性受損的一種繼發(fā)性心肌病，若不徹底戒酒及早期藥物干預，最終發(fā)展為難治性心律失常和頑固性心力衰竭[1-3]。大量研究發(fā)現(xiàn)酒精攝入可引起心肌細胞凋亡[4-6]。細胞凋亡是在多種生理性或病理性刺激下，為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，細胞信號轉(zhuǎn)導通路激活啟動細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應，導致細胞的程序化死亡。糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）的激活促進線粒體途徑誘導的內(nèi)源性細胞凋亡[7]，進而激活半胱天冬蛋白酶-9（caspase-9）及下游半胱天冬蛋白酶的級聯(lián)反應。鈣激活中性蛋白酶（Calpain）的激活可片段化GSK-3β并使其活性升高[7]。本實驗通過酒精灌胃法建立早期大鼠酒精性心肌病模型，一方面檢測大鼠心肌細胞凋亡水平，另一方面給予鈣激活中性蛋白酶-1（Calpain-1）的特異抑制劑（ALLN），探討特異性的抑制鈣激活中性蛋白酶（Calpain）能否通過干預Calpain/GSK-3β信號通路降低酒精致大鼠心肌細胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 研究對象健康雄性Wistar大鼠100只（體重220±20 g，清潔級），由哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物學部提供，哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院實驗動物中心飼養(yǎng)。

1.2 實驗方法

1.2.1 ACM大鼠造模100只雄性wistar大鼠隨機分為四組：生理鹽水對照組（n=10）、酒精組（n=30）、酒精+Calpain-1抑制劑（ALLN）組（n=30）、酒精+二甲基亞砜溶劑（DMSO）組（n=30）。采用酒精灌胃+自由飲用方法造模。第1周10%酒精自由飲用，60%酒精5 ml/kg·d灌胃1次；第2周10%酒精自由飲用，60%酒精10 ml/kg·d灌胃2次；第3～16周20%酒精自由飲用，60%酒精15 ml/kg·d灌胃2次。酒精+ALLN 組與酒精+DMSO 組在第15周酒精灌胃前15 min分別給予腹腔注射Calpain 1抑制劑ALLN 1 ml/kg·d（溶于1% DMSO 0.3 ml）及1% DMSO 0.3 ml至第16周末進行檢測。正常組相同時間、相同劑量生理鹽水灌胃，普通顆粒食料無差別給予。

1.2.2 心臟彩超檢查用10%水合氯醛以3 ml/kg對大鼠行腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，剃凈大鼠胸毛。使用GE心臟超聲診斷儀，采用頻率為10 MHz探頭，軀體左傾30°，探頭至于胸骨左側(cè)，與胸骨中線呈10°～30°。顯示胸骨旁左室長軸、心尖四腔切面聲像圖，觀察心室腔的內(nèi)膜面是否清晰。由心內(nèi)科專業(yè)超生醫(yī)師檢測大鼠心臟結(jié)構(gòu)。測定指標：左室舒張末期內(nèi)徑（LVDD）、左室后壁舒張末期厚度（LVPWD）、左室射血分數(shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）。每一超聲測定值取三個連續(xù)心動周期測量的平均值。

1.2.3 組織標本采集取大鼠心肌組織，4%中性甲醛中固定24 h，按常規(guī)石蠟包埋后，各組織塊做連續(xù)切片（厚度5 μm），行蘇木素-伊紅（HE）染色。戊二醛固定組織用于電鏡檢查。剩余組織立即置于-80 ℃冰箱凍存。

1.2.4 組織化學檢測大鼠心肌組織常規(guī)脫水石蠟包埋切片（厚度4 μm）HE染色觀察心肌細胞形態(tài)學特征。CD31免疫組化染色（SP法）進行微血管標記染色?！?00視野下觀察微血管密度。

1.2.5 電鏡觀察各組大鼠心肌細胞的變化心肌組織依次于2.5%戊二醛、1%鋨酸中固定后，梯度濃度酒精處理，預制包埋塊，超薄切片機將其切成70～90 nm超薄切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色。

1.2.6 TUNEL法檢測細胞凋亡心肌組織石蠟包埋后切片，厚度為4 μm，二甲苯中脫蠟2次，每次10 min，濃度梯度酒精處理，滴加20 pg/ml不含DNA酶的蛋白酶K，常溫作用30 min，PBS洗滌后加TUNEL檢測液，37 ℃度孵育60 min，加入抗熒光淬滅劑，熒光顯微鏡下觀察并分析。每張切片隨機選取10個非重疊400倍陽性視野，計數(shù)凋亡心肌細胞數(shù)及心肌細胞總數(shù)，心肌細胞凋亡指數(shù)=凋亡心肌細胞數(shù)/心肌細胞總數(shù)×100%。

1.2.7 Western Blot方法檢測細胞樣品中的蛋白蛋白提取：用含蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液抽提組織蛋白，BCA法繪制標準曲線定量蛋白濃度并稀釋配平。Western Blot檢測：SDS-PAGE電泳法（10%分離膠、5%濃縮膠）分離蛋白并轉(zhuǎn)移到PVDF膜，Calpain-1抗體（1:400，美國Santa Cruz公司）、GSK-3β抗體（1:400，美國Santa Cruz公司）、Caspase-9抗體（1:400、美國Santa Cruz公司）、激活型Caspase-3抗體（1:400，美國Santa Cruz公司）、β-actin（1:2000 ，美國Santa Cruz公司），4℃冰箱過夜，二抗孵育1 h后顯影，實驗重復四次，應用Quanty 1軟件進行分析，將目的蛋白與β-actin相比得到實驗結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示。多組數(shù)據(jù)間均數(shù)比較采用F檢驗，多組數(shù)據(jù)間均數(shù)兩兩比較采用SNK檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 心臟彩超測定各組大鼠的心臟超聲指標左室舒張末期內(nèi)徑（LVDD）、左室后壁舒張末期厚度（LVPWD）、左室射血分數(shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS），比較各組大鼠心臟超聲指標的變化。結(jié)果得知：與對照組相比，酒精組、酒精+ALLN組、酒精+DMSO組大鼠心臟LVDD增大，LVPWD增厚（P＜0.05）。酒精+ALLN組與酒精組相比，LVDD略小，LVPWD相對稍薄，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。各組大鼠LVEF、LVFS均位于正常范圍之間，無明顯差異。酒精組與酒精+DMSO組大鼠相比較，LVDD、LVPMD、LVEF、LVFS均無明顯差異（P＞0.05）。心臟超聲測值提示攝入大量酒精可導致大鼠左心腔擴大，左室后壁增厚，收縮功能正常，但已出現(xiàn)舒張功能障礙，符合早期酒精性心肌病改變（表1）。

表1 各組大鼠LVDD、LVPWD、LVEF和LVFS值

2.2 HE染色光鏡下觀察各組大鼠心肌細胞形態(tài)學改變對照組心肌纖維排列整齊緊密，細胞膜完整、細胞質(zhì)均勻，細胞間隙未見擴大，無明顯的水腫及炎性細胞浸潤。酒精組及酒精+DMSO組顯示心肌纖維排列紊亂，結(jié)構(gòu)消失，心肌細胞固縮，細胞間質(zhì)增大水腫，可見大量炎性細胞滲出。酒精+ALLN組較酒精組減輕明顯，細胞排列較緊密，有少量炎性細胞滲出（圖1）。

圖1 各組HE染色（×400）

2.3 電鏡下觀察各組大鼠心肌細胞形態(tài)學改變對照組心肌細胞肌絲排列整齊緊密，無斷裂， 線粒體結(jié)構(gòu)正常，酒精組及酒精+DMSO組線粒體腫脹、空變，部分線粒體嵴不完整，肌纖維排列紊亂、分離，發(fā)生斷裂，肌溶解。酒精+ALLN組線粒體腫脹、肌纖維排列紊亂程度均較酒精組有所減輕（圖2）。

圖2 透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)（×15 000）

2.4 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡TUNEL法檢測心肌細胞凋亡（圖3）。每張切片觀察10個非重疊400倍陽性視野，根據(jù)陽性細胞所占百分比計算心肌細胞的凋亡率。與對照組比較，酒精組心肌細胞凋亡率增加[（61.14±2.84）%vs. （2.24±1.92）%，P＜0.01]，差異有統(tǒng)計學意義；酒精+ALLN組與對照組比較有較多的心肌細胞凋亡[（34.60±3.54）%vs. （2.24±1.92）%，P＜0.01]，但與酒精組比較心肌細胞凋亡明顯減少[（34.60±3.54）%vs. （61.14±2.84）%，P＜0.01]，差異具有統(tǒng)計學意義（表2）。

表2 各組的凋亡率

圖3 各組凋亡水平（×200）

2.5 免疫組化檢測比較各組大鼠心肌組織中Calpain-1、GSK-3β、caspase-9、caspase-3的蛋白表達量應用計算機圖像分析軟件（Image-Pro Plus，version 6.0），計算結(jié)果用切片中細胞質(zhì)著色的面積及累計光密度值來間接反映蛋白表達量。與對照組比較，酒精組Calpain-1、GSK-3β（H-76）、caspase-9、caspase-3的表達明顯升高（P＜0.05），酒精+ALLN組與對照組比較Calpain-1、GSK-3β（H-76）、caspase-9、caspase-3的表達也有升高（P＜0.05），但與酒精組比較其表達明顯減少（P＜0.05），酒精組與酒精+DMSO組比較Calpain-1、GSK-3β（H-76）、caspase-9、caspase-3的表達無明顯差異（P＞0.05），（圖4～8）。

圖4 Calpain-1 免疫組化（×400）

2.6 Westorn blot檢測比較各組大鼠心肌組織中Calpain-1、GSK-3β、caspase-9、caspase-3的蛋白表達量與對照組比較，酒精組Calpain-1、GSK-3β（H-76）、caspase-9 p10、caspase-3 p17蛋白表達水平上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。酒精組+ALLN組與酒精組比較Calpain-1、GSK-3β（H-76）、caspase-9 p10、caspase-3 p17蛋白表達水平下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。酒精組與酒精+DMSO組比較各蛋白表達水平無明顯差異（P＞0.05），（圖9～10）。

圖9 Calpain-1、GSK-3β（H-76）、caspase-9 p10、caspase-3 p17在各組的表達情況

圖5 GSK-3β（H-76） 免疫組化（×400）

圖6 caspase-9 p10 免疫組化（×400）

圖7 激活型caspase-3 免疫組化（×400）

3 討論

ACM是酒精誘導的心臟損傷最常見的形式。ACM導致心肌收縮力和心腔擴張的逐漸降低，心肌細胞在受到缺血、缺氧、壓力超負荷、線粒體毒素等刺激下，可出現(xiàn)心肌細胞凋亡，長期而持續(xù)的凋亡導致心室重構(gòu)，進而發(fā)展為心力衰竭[8]。在酒精誘導的心臟損傷過程中，研究人員發(fā)現(xiàn)酒精在多個位點（膜、受體、線粒體、核糖體、肌膜、DNA或細胞骨架）對心肌細胞施加有害影響[9-11]。新策略旨在控制細胞凋亡和病理性心臟重構(gòu)[12]。

圖8 Calpain-1、GSK-3β（H-76）、caspase-9 p10、caspase-3 p17在各組的相對表達量

圖10 Calpain-1、GSK-3β（H-76）、caspase-9 p10、caspase-3 p17在各組的相對表達量

細胞凋亡是在多種生理性或病理性刺激下，為維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，通過細胞信號轉(zhuǎn)導通路激活啟動細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應，最終導致細胞的程序化死亡。研究發(fā)現(xiàn)酒精攝入可引起細胞死亡[8,13,14]。研究結(jié)果顯示酒精誘導的細胞凋亡的大鼠心肌組織中caspase-9 p10、caspase-3 p17凋亡相關(guān)蛋白水平明顯升高，說明大量酒精攝入可促進心肌細胞凋亡，具體機制仍需進一步研究。

GSK-3是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛表達于多種真核細胞中。GSK-3β是眾多細胞信號轉(zhuǎn)導途徑的交叉匯點，其活性必然受到極其復雜且精細的調(diào)節(jié)[15]。GSK-3β的激活促進線粒體途徑誘導的內(nèi)源性細胞凋亡[16,17]。由此推斷，GSK-3β的過表達可以促進細胞凋亡，抑制GSK-3β的活性，有可能保護組織器官。

Calpain是一類鈣離子依賴性的半胱氨酸蛋白激酶家族,參與調(diào)解細胞的多種生理過程，如細胞信號轉(zhuǎn)導、細胞增殖分化、細胞凋亡、細胞骨架和細胞膜的構(gòu)型重建等。Calpain激活可降解心房肌的收縮和結(jié)構(gòu)蛋白參與心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)[18]，Calpain抑制劑可明顯減輕細胞凋亡[19]。本研究顯示，酒精誘導的細胞凋亡的大鼠心肌組織中Calpain-1、GSK-3β表達顯著升高，提示酒精誘導的心肌細胞凋亡可能與Calpain-1、GSK-3β的促凋亡有關(guān)。

近年來發(fā)現(xiàn)關(guān)于GSK-3β活性調(diào)解的一種新機制。Calpain的激活可片段化GSK-3β并使其活性升高Calpain還可使GSK-3β的C末端分解為幾個片段，導致活性升高[7,20]。本研究通過Calpain抑制劑作用于酒精誘導的細胞凋亡的大鼠心肌組織，觀察到心肌細胞凋亡顯著減少。我們提出假設(shè)：Calpain切割掉具有活性抑制的磷酸化位點，更好地改善酒精誘導的心肌細胞凋亡。但Calpain如何切割截斷GSK-3β，其分子機制目前仍不清楚，進一步研究證實。

綜上所述，本實驗通過建立大鼠酒精性心肌病模型，探討Calpain抑制劑能否通過干預Calpain/GSK-3β信號通路降低酒精致大鼠心肌細胞凋亡。結(jié)果提示Calapin-1抑制劑具有降低酒精誘導的心肌細胞凋亡的效應，其機制可能與Calpain 對GSK-3β的片段化導致其活性增高，上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白的表達有關(guān)。