基于RhoA/ROCKⅡ通路探討原發(fā)性高血壓病與炎性因子相關(guān)性研究

薛文靜，楊一格，柴若寧，石樹青，石晶晶，張雪松，胡元會

炎癥與大多數(shù)心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有學(xué)者[1]指出高血壓病是一種輕微炎癥性疾病，其發(fā)生發(fā)展與血管炎癥有著重要聯(lián)系。慢性炎癥可能是原發(fā)性高血壓與動脈粥樣硬化（AS）相互關(guān)聯(lián)的重要指標(biāo)。炎癥細(xì)胞因子是一組小分子多肽由機(jī)體的免疫和非免疫細(xì)胞合成、分泌，具有廣泛的生物學(xué)活性，可以調(diào)節(jié)多種免疫應(yīng)答和細(xì)胞炎癥。炎癥細(xì)胞因子根據(jù)其功能可分為兩種不同的類別，即促炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子。與原發(fā)性高血壓病密切相關(guān)的促炎性因子包括超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）、C反應(yīng)蛋白（CRP）[2]、白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）[3]及纖溶酶原激活物抑制劑等?？寡滓蜃觿t白介素-10（IL-10）為代表。此外，有研究表明Rho/ROCK可通過改變巨噬細(xì)胞表型（M1/M2），介導(dǎo)T輔助細(xì)胞釋放細(xì)胞因子以及在成纖維細(xì)胞中介導(dǎo)MRTF/SRF、YAP/TAZ/TEAD、TGF-β等信號通路參與炎癥反應(yīng)[4]。

Rho/ROCK通路與細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化以及遷移密切相關(guān)[5]。大量研究表明Rho/ROCK途徑與炎癥細(xì)胞因子相互作用對糖尿病、炎癥性疾病、腫瘤、肺損傷、心臟病和神經(jīng)損傷性疾病發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生了一定的影響[6]，以該通路作為疾病的治療靶點(diǎn)越來越得到人們的廣泛關(guān)注[7]，關(guān)于藥物對該通路的干預(yù)研究也越來越多。關(guān)于Rho/ROCK對炎癥細(xì)胞因子影響的研究，目前較集中于幾類常見的促炎因子：IL-6、IL-1、TNF-α、TNF-β、單控細(xì)胞趨化因子（MCP-1）等。本研究旨在探討RhoA/ROCK信號通路及相關(guān)炎癥因子在原發(fā)性高血壓病中的表達(dá)及其與疾病的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取廣安門醫(yī)院于2020年8月至2020年12月收治的120例原發(fā)性高血壓病患者為觀察組。并同期納入本院體檢的30例無高血壓的健康人群（年齡與高血壓病組相當(dāng)）為對照組。收集年齡、性別、身高、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、吸煙史、家族史等一般資料。病史、用藥史、血常規(guī)、生化檢查、血壓記錄等臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)性高血壓組：符合《中國高血壓防治指南2018修訂版》[8]原發(fā)性高血壓病診斷標(biāo)準(zhǔn)；且年齡在30～80歲之間，男女不限，自愿參加并簽署知情同意書。健康人組：符合臨床認(rèn)證的健康人診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；且年齡30～80歲，男女不限、自愿參加并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床相關(guān)資料不完整者；妊娠或哺乳期婦女；高血壓危象；繼發(fā)性高血壓；合并嚴(yán)重肝腎功能不全；有心、腦嚴(yán)重原發(fā)疾病、精神病患者；合并活動性結(jié)核病或風(fēng)濕免疫疾病患者；近2周內(nèi)使用抗生素、抗感染藥物治療者；近1個月內(nèi)有感染、發(fā)熱、創(chuàng)傷、燒傷、手術(shù)史和炎癥；合并有嚴(yán)重造血系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤；過敏體質(zhì)者。凡符合上述10項(xiàng)中任意一項(xiàng)者即予以排除。

1.2 研究方法患者入院次日空腹采靜脈血2 ml，離心機(jī)2500 rpm×10 min，提取血清分裝至1.5 ml EP管中，-80 ℃保存。采用EDTA抗凝管抽取 5 ml靜脈血。先將5 ml人外周血淋巴細(xì)胞分離液置入15 ml離心管后將5 ml EDTA抗凝全血緩慢注入外周血淋巴細(xì)胞分離液液面上，使血液和分離液間形成清晰的間限。離心機(jī)2000 r/m離心20 min。吸取中間層白色絮狀物注入新的15 ml離心管，加10 ml PBS后混勻，以2000 r/m離心20 min。棄去上清液，再次用PBS清洗。重復(fù)該步驟1～2次后，去上清，加1 ml Trizol并吹打后保存至1.5 ml EP管中，-80 ℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測ROCKⅡ、NF-κBp65、TIMP-1、ICAM-1表達(dá)水平，ELISA試劑盒由上海酶聯(lián)提供，多功能酶聯(lián)免疫分析儀由深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司提供。并采用PCR檢測外周靜脈血單核細(xì)胞中RhoAmRNA、ROCKⅡmRNA表達(dá)水平。試劑盒由康為世紀(jì)提供，實(shí)時定量 PCR 儀由ABI公司提供的StepOne Plus。儀器經(jīng)過校標(biāo)和質(zhì)控以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，相關(guān)操作嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)流程及試劑說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用EpiData收集數(shù)據(jù)，整理為Excel表格，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析處理，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)、構(gòu)成比描述。組間比較采用卡方檢驗(yàn)。計(jì)量資料檢驗(yàn)是否符合正態(tài)分布，近似于正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）的形式描述，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不滿足正態(tài)分布的計(jì)量資料以四分位數(shù)的形式描述，并采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-WhitneyU）。此外相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析。以原發(fā)性高血壓病的危險因素及通路相關(guān)指標(biāo)ROCKⅡ、NF-κBp65、ICAM-1、TIMP-1和RhoAmRNA、ROCKⅡmRNA為自變量，是否患有原發(fā)性高血壓病為因變量，以比值比（OR）作為效應(yīng)值，進(jìn)行單因素及多因素二元Logistic回歸分析，并通過繪制ROC曲線，篩選切點(diǎn)，計(jì)算曲線下面積評估參數(shù)預(yù)測效力。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原發(fā)性高血壓病患者與健康人一般資料比較兩組研究對象年齡、性別、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、肌酐（Scr）尿素氮（BUN）等基本資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，表1。

表1 原發(fā)性高血壓病組與健康組基本資料對比

2.2 原發(fā)性高血壓病患者ROCKⅡ、NFκBp65、ICAM-1、TIMP-1、RhoAmRNA、ROCKⅡmRNA表達(dá)水平與健康組相比，原發(fā)性高血壓病組的ROCKⅡ、NF-κBp65、ICAM-1、TIMP-1、RhoAmRNA、ROCKⅡmRNA的表達(dá)水平均有不同程度升高（P＜0.01），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表2。

表2 原發(fā)性高血壓病組與健康組ROCKⅡ、NF-κBp65、ICAM-1、TIMP-1、RhoAmRNA、ROCKⅡmRNA結(jié)果對比

2.3 原發(fā)性高血壓病與上述各指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果將原發(fā)性高血壓病與ROCKⅡ、NFκBp65、ICAM-1、TIMP-1和RhoAmRNA、ROCKⅡmRNA進(jìn)行Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，原發(fā)性高血壓病與ROCKⅡ、NF-κBp65、ICAM-1、TIMP-1和RhoAmRNA、ROCKⅡmRNA呈正相關(guān)（P＜0.05），表3。

表3 原發(fā)性高血壓病與各指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果

2.4 原發(fā)性高血壓病與各個指標(biāo)的二元Logistic回歸分析對以原發(fā)性高血壓病的相關(guān)危險因素及通路相關(guān)指標(biāo)ROCKⅡ、NF-κBp65、ICAM-1、TIMP-1和RhoAmRNA、ROCKⅡmRNA進(jìn)行單因素Logistic回歸分析，表4。并以單因素分析所得的結(jié)果為基礎(chǔ)，將RhoAmRNA、ROCKⅡmRNA、ROCKⅡ、NF-κBp65作為自變量，以是否患有原發(fā)性高血壓病為因變量進(jìn)一步進(jìn)行多因素二元Logistic 分析，結(jié)果顯示ROCKⅡmRNA、ROCKⅡ、NF-κBp65與原發(fā)性高血壓病密切相關(guān)（P＜0.05），表5。

表4 原發(fā)性高血壓病與各指標(biāo)的的單因素Logistic回歸分析

表5 原發(fā)性高血壓病多因素Logistic回歸分析

2.5 原發(fā)性高血壓病患者ROCKⅡmRNA、ROCKⅡ、NF-κBp65的ROC曲線分析通過繪制ROC曲線，篩選切點(diǎn)，計(jì)算ROCKⅡ、ROCKⅡ、NF-κBp65曲線下面積評估參數(shù)預(yù)測效力，表6和圖1。

圖1 ROCKⅡmRNA、ROCKⅡ、NF-κBp65的ROC曲線分析

表6 ROCKⅡmRNA、ROCKⅡ、NF-κBp65的參數(shù)預(yù)測效力分析結(jié)果

3 討論

高血壓是指以體循環(huán)動脈血壓（收縮壓和/或舒張壓）增高為主要特征，或伴有心、腦、腎等器官的功能或器質(zhì)性損害的臨床綜合征。根據(jù)其病因是否明確[10]分為原發(fā)性和繼發(fā)性。原發(fā)性高血壓是由于內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞的變化[11]，粘附分子和細(xì)胞外基質(zhì)成分導(dǎo)致高血壓血管表型的分子，結(jié)構(gòu)和功能變化，增加外周阻力。交感神經(jīng)系統(tǒng)、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、ET系統(tǒng)和其他血管活性劑，以及與鹽誘導(dǎo)的腸道微生物組營養(yǎng)不良有關(guān)的炎癥和免疫成分的激活觸發(fā)，共同導(dǎo)致高血壓的血管變化。大量文獻(xiàn)表明，Rho/ROCK信號通路與血管內(nèi)皮通透性、細(xì)胞骨架構(gòu)成、細(xì)胞遷移黏附、及血管平滑肌收縮等多種生理功能有關(guān)[12]。并對炎癥因子有一定的調(diào)節(jié)作用。國內(nèi)外文獻(xiàn)均已證實(shí)炎癥因子與原發(fā)性高血壓病的發(fā)生發(fā)展以及并發(fā)癥的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。此外，高血壓本身也可通過改變血液流變學(xué)而加重炎癥反應(yīng)。RhoA/ROCKⅡ?qū)ρ装Y因子的調(diào)控可能通過NF-κBp65介導(dǎo)。TIMP-1由結(jié)締組織細(xì)胞與巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，廣泛存在于組織、體液中，可以被多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生，可與活化的MMP-1、3、9形成復(fù)合物而抑制其活性，降低細(xì)胞外基質(zhì)的降解，還具有細(xì)胞生長因子樣作用，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生及膠原合成，使細(xì)胞外基質(zhì)沉積并抑制其降解[13]。MMP-9與TIMP-1的動態(tài)改變調(diào)節(jié)ECM，從而對原發(fā)性高血壓的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。ICAM-1是公認(rèn)的內(nèi)皮損傷標(biāo)記物。在炎癥過程中被多種細(xì)胞上調(diào)。ICAM-1以其介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和引導(dǎo)白細(xì)胞穿過血管壁而聞名。當(dāng)血管內(nèi)皮受損時，在細(xì)胞因子的刺激作用下，ICAM-1作為血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附以及白細(xì)胞 浸潤功能的介導(dǎo)因子，表達(dá)水平顯著上調(diào)[14]。有研究結(jié)果顯示，壓力負(fù)荷本身是具有強(qiáng)大的促炎效應(yīng)，由于機(jī)械應(yīng)變可以誘導(dǎo)血管壁內(nèi)存在的細(xì)胞，包括內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤，從而誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子、生長因子的聚集，氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，這些因子的相互作用可以上調(diào) ICAM-1的表達(dá)[15]。

本研究通過橫斷面分析，探討了原發(fā)性高血壓病與上述指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果表明，原發(fā)性高血壓病患者外周血單核細(xì)胞中RhoAmRNA、ROCKⅡmRNA表達(dá)水平，外周血中ROCKⅡ、NF-κBp65、TIMP-1、ICAM-1表達(dá)水平均明顯高于健康對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示：原發(fā)性高血壓病與ROCKⅡ、NF-κBp65、TIMP-1、ICAM-1和RhoAmRNA、ROCKⅡmRNA呈正相關(guān)。二元 Logistic回歸分析結(jié)果提示ROCKⅡmRNA（OR=3.698，95%CI：1.365～10.014，P＜0.05）、ROCKⅡ（OR=1.143，95%CI：1.068～1.223，P＜0.001）、NF-κBp65（OR=1.486，95%CI：1.106～1.997，P＜0.01）與原發(fā)性高血壓病密切相關(guān)。繪制其與原發(fā)性高血壓病相關(guān)的ROC曲線，計(jì)算曲線下面積評估參數(shù)預(yù)測效力。根據(jù)最佳cutoff值，計(jì)算靈敏度和特異性。ROCKⅡmRNA曲線下面積為0.791，當(dāng)臨界值為1.79時，其診斷原發(fā)性高血壓病的敏感度為86.7%，特異性為70%；ROCKⅡ曲線下面積為0.887，當(dāng)臨界值為34.51 pg/ml時，其診斷原發(fā)性高血壓病的敏感度為86.7%，特異性為82.5%；NF-κBp65曲線下面積為0.807，當(dāng)臨界值為6.49 pg/ml時，其診斷原發(fā)性高血壓病的敏感度為93.3%，特異性為58.3%。對原發(fā)性高血壓病，ROCKⅡ具有一定的預(yù)測價值。本研究表明RhoA/ROCKⅡ通路相關(guān)指標(biāo)與原發(fā)性高血壓病具有顯著相關(guān)性，特別是ROCKⅡmRNA、ROCKⅡ及NF-κBp65。此外，ROCKⅡ?qū)υl(fā)性高血壓病具有較好的預(yù)測價值，敏感度和特異性較強(qiáng)。在原發(fā)性高血壓病的發(fā)生、發(fā)展中可能起到關(guān)鍵作用[16]。此外，本研究中兩個炎性因子雖與原發(fā)性高血壓病具有一定的相關(guān)性，但并非疾病的顯著相關(guān)因素。之后的研究中需要納入更多RhoA/ROCKⅡ通路相關(guān)的炎性因子，并進(jìn)一步落實(shí)亞組研究。在當(dāng)今的臨床環(huán)境和小鼠模型中，許多研究已將 ROCK與動脈粥樣硬化和高血壓病聯(lián)系起來。由于本研究為橫斷面研究，且未對原發(fā)性高血壓患者動脈硬化情況進(jìn)行評估，未了解其發(fā)展情況；ROCKⅡmRNA、ROCKⅡ及NF-κBp65的水平變化與原發(fā)性高血壓病動脈硬化的相關(guān)性仍有待進(jìn)一步研究，后續(xù)將豐富實(shí)驗(yàn)方法，并了解RhoA/ROCKⅡ通路相關(guān)指標(biāo)對患者血管長期的影響，以獲得更有價值的研究結(jié)果。