烏司他丁調(diào)控PI3K/AKT通路對(duì)大鼠心臟術(shù)后心臟收縮及舒張功能的影響及其機(jī)制研究

苗婷，王道金，湛守青

在心臟手術(shù)期間使用的體外循環(huán)可導(dǎo)致白細(xì)胞激活，進(jìn)而引發(fā)全身的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，損傷心肌組織并引起心功能障礙[1]。保護(hù)心肌組織，及時(shí)恢復(fù)心功能具有重要臨床意義。烏司他丁是在尿液中發(fā)現(xiàn)的一種庫(kù)尼茨型人類(lèi)蛋白酶抑制劑，具有抑制中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和抑制促炎細(xì)胞因子激活的能力[2]。研究顯示，烏司他丁可以在心臟手術(shù)后抑制促炎細(xì)胞因子水平的增加[3]，但其對(duì)心臟功能的影響和作用機(jī)制仍不清楚。肌醇磷脂-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）是細(xì)胞內(nèi)激酶通路，該通路水平的升高能夠促進(jìn)抗氧化和抗炎因子的分泌[4]。研究表明提高PI3K/AKT通路能夠緩解由缺血/再灌注引起的心肌組織損傷[5]。本文主要分析烏司他丁調(diào)控PI3K/AKT通路對(duì)大鼠心臟術(shù)后心臟收縮及舒張功能的影響，為臨床更好的提高心臟手術(shù)預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料Sprague-Dawley（SD）大鼠（SPF級(jí)，雄性，8～10周，270～290 g）。HP SONOS 5500型的超聲心動(dòng)圖儀（飛利浦公司，美國(guó)）。烏司他?。℉19990131，常州天普制藥）。HE染色試劑盒購(gòu)自武漢華美公司（中國(guó)）。顯微鏡（蔡司，德國(guó)）。ELISA染色試劑盒（碧云天公司，中國(guó)）。酶標(biāo)儀（Model 680，Bio-Rad，美國(guó)）。抗體（Abcam公司，美國(guó)）。聚偏二氟乙烯膜（EMD 心臟手術(shù)llipore，美國(guó)）。ECL顯色試劑盒（Thermo Fisher公司，美國(guó)）。

1.2 分組、建模和干預(yù)45只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、心臟手術(shù)組、心臟手術(shù)+烏司他丁組（每組各15只）三組。根據(jù)參考文獻(xiàn)建立心臟手術(shù)大鼠模型[6]，將心臟手術(shù)組和心臟手術(shù)+烏司他丁組的大鼠連接心電圖，麻醉（4%水合氯醛）后連接心電圖，迅速打開(kāi)胸小心撕開(kāi)心包腔暴露心臟，在結(jié)扎心臟的同時(shí)進(jìn)行體外循環(huán)，持續(xù)2 h。將心臟迅速放回胸腔內(nèi)，簡(jiǎn)單縫合胸腔，腹腔注射8×105U的青霉素預(yù)防感染。對(duì)照組大鼠僅暴露心臟相同時(shí)間但不結(jié)扎。心臟手術(shù)+烏司他丁組大鼠在建模后通過(guò)烏司他丁腹腔注射處理，劑量為100 kU/kg，1/d，連續(xù)7 d[7]。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.3.1 心功能檢測(cè)通過(guò)HP SONOS 5500型的超聲心動(dòng)圖儀的雙通道左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左心室縮短分?jǐn)?shù)（LVFS），評(píng)估左心室收縮功能。

1.3.2 HE染色大鼠吸入過(guò)量二氧化碳安樂(lè)死，心肌組織用10%甲醛溶液固定48 h，流水沖洗。不同濃度的乙醇脫水，將組織浸入蠟中，切成4～7 μm的厚度。將載玻片置于65 ℃恒溫烘箱中30 min。脫蠟切片用不同濃度乙醇浸泡5 min，自來(lái)水沖洗10 min。切片分別用伊紅溶液染色1～2 min。細(xì)胞核用蘇木精染色5 min。染色切片用純酒精脫水并在光學(xué)顯微鏡下檢查。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）大鼠安樂(lè)死前收集微靜脈血，離心（4 ℃，20 min，12 000 rpm）后使用移液槍小心吸取上層清液，加入抗體孵育2 h后加入顯色劑，10 min后終止反應(yīng)。在450 nm下檢測(cè)吸光度，根據(jù)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算單位質(zhì)量黑質(zhì)組織中白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6的水平。

1.3.4 Western blot檢測(cè)蛋白將心肌組織用勻漿機(jī)均勻研磨萃取總蛋白，通過(guò)BCA試劑盒測(cè)量濃度。每組取40 μg的總蛋白使用SDS-PAGE分離（10%，80～120 V，90 min）。在100 mV的恒定電壓下與PVDF膜進(jìn)行濕轉(zhuǎn)移。在5%牛血清白蛋白（BSA）中于室溫孵育1 h。將1:500稀釋的PI3K和AKT一抗添加膜中（4 ℃，12 h）。洗滌后在加入1:2000稀釋的二抗孵育室溫下1 h。利用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色。用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 19.0軟件。每個(gè)檢測(cè)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。多組間的差異采用單因素方差分析進(jìn)行比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 烏司他丁對(duì)心臟手術(shù)大鼠心功能的影響三組大鼠的左心室舒縮功能比較差異顯著（P＜0.05）。心臟手術(shù)組的心臟指數(shù)[LVEF（63.84±4.37）%和LVFS（34.57±2.76 ）%]顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），心臟手術(shù)+烏司他丁組的心臟指數(shù)[LVEF（81.49±5.21）%和LVFS（41.86±3.05）%]顯著高于心臟手術(shù)組（P＜0.05），表1。

表1 烏司他丁對(duì)心臟手術(shù)大鼠心功能的影響

2.2 烏司他丁對(duì)心臟手術(shù)大鼠左心室心肌組織損傷的影響對(duì)照組細(xì)胞核染色清晰，細(xì)胞質(zhì)染色均勻，細(xì)胞排列有序。心臟手術(shù)組細(xì)胞核染色變深或變淺，心肌細(xì)胞染色變淺，形狀發(fā)生改變，排列紊亂，并且出現(xiàn)炎性浸潤(rùn)。心臟手術(shù)+烏司他丁組組細(xì)胞排列異常和損傷情況均較輕（圖1）。

圖1 HE染色檢測(cè)烏司他丁對(duì)心臟手術(shù)大鼠左心室心肌組織損傷的影響（×200）

2.3 烏司他丁對(duì)心臟手術(shù)大鼠炎性因子水平的影響三組大鼠血清炎性因子比較差異顯著（P＜0.05）。心臟手術(shù)組的IL-1β（641.23±58.67 μg/L）和IL-6（1128.31±98.21 μg/L）水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），心臟手術(shù)+烏司他丁組的IL-1β（297.85±33.04 μg/L）和IL-6（405.66±42.50 μg/L）水平顯著低于心臟手術(shù)組（P＜0.05），表2。

表2 烏司他丁對(duì)心臟手術(shù)大鼠炎性因子水平的影響

2.4 烏司他丁對(duì)心臟手術(shù)大鼠PI3K和AKT蛋白表達(dá)水平的影響三組大鼠左心室心肌組織中PI3K和AKT蛋白表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。心臟手術(shù)組的PI3K和AKT蛋白水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），心臟手術(shù)+烏司他丁組的PI3K和AKT蛋白水平顯著高于心臟手術(shù)組（P＜0.05），（圖2，表3）。

圖2 Western blot檢測(cè)烏司他丁對(duì)心臟手術(shù)大鼠PI3K和AKT蛋白表達(dá)水平的影響

表3 烏司他丁對(duì)心臟手術(shù)大鼠PI3K和AKT蛋白相對(duì)表達(dá)水平的影響

3 討論

心臟相關(guān)手術(shù)需要在體外循環(huán)下進(jìn)行，而體外循環(huán)接收后機(jī)體炎性反應(yīng)升高，可能會(huì)引起心功能障礙、急性肺損傷和多器官衰竭等并發(fā)癥，并導(dǎo)致術(shù)后恢復(fù)時(shí)間、遲拔管時(shí)間和重癥監(jiān)護(hù)病房住院時(shí)間的延長(zhǎng)[8]。而有效的保護(hù)心肌組織及時(shí)恢復(fù)心臟灌注功能則具有重要的臨床意義。

烏司他丁是一種尿胰蛋白酶抑制劑，可抑制胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶等多種炎性蛋白酶[9]。目前，烏司他丁在中、日、韓等國(guó)廣泛用于炎癥性疾病患者的治療、術(shù)后器官保護(hù)、休克、和胰腺炎的治療[10]。近年來(lái)研究顯示烏司他丁具有提高心臟手術(shù)患者預(yù)后的作用，一項(xiàng)臨床研究顯示，烏司他丁能夠顯著抑制心臟手術(shù)術(shù)后的輸血和紅細(xì)胞輸注，促進(jìn)患者的恢復(fù)[11]。為分析烏司他丁對(duì)心臟手術(shù)后炎性反應(yīng)和和心功能的影響，本研究根據(jù)參考文獻(xiàn)利用暴露心臟+體外循環(huán)的方式模擬心臟手術(shù)。結(jié)果顯示心臟手術(shù)組大鼠血清炎性因子顯著升高，心肌組織出現(xiàn)炎性損傷，且心臟的射血功能和舒縮功能降低。而烏司他丁干預(yù)后，炎性細(xì)胞因子顯著降低，心肌組織損傷緩解，心功能顯著恢復(fù)。陳玉紅等[12]的研究結(jié)果表明烏司他丁能夠緩解由膿毒癥引起的心功能損傷。也有研究顯示烏司他丁能夠通過(guò)激活抗氧化通路保護(hù)心肌梗死大鼠的心功能[13]。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道和本次研究結(jié)果，說(shuō)明烏司他丁能夠緩解心臟手術(shù)大鼠的心肌損傷，并保護(hù)心臟的舒縮功能。

為進(jìn)一步分析烏司他丁保護(hù)心臟手術(shù)大鼠心功能的機(jī)制，本研究檢測(cè)了烏司他丁對(duì)心肌組織中PI3K/AKT通路的影響。如前所述，心臟手術(shù)后誘發(fā)的氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)是導(dǎo)致心肌損傷的重要機(jī)制，而PI3K/AKT通路不但具有抗氧化功能，還需有抗炎功能[14]。Yang等[15]的研究結(jié)果表明提高PI3K/AKT通路的水平能夠提高缺血性心力衰竭的心功能。本次研究結(jié)果顯示，心臟手術(shù)模型大鼠心肌組織中的PI3K和AKT蛋白表達(dá)水平顯著降低，而烏司他丁干預(yù)后，PI3K和AKT蛋白表達(dá)水平顯著升高。王宇霆等[16]的研究結(jié)果顯示烏司他丁可通過(guò)激活PI3K/AKT通路緩解氧化應(yīng)激引起的心肌細(xì)胞損傷。也有研究顯示烏司他丁可通過(guò)促進(jìn)PI3K/AKT通路緩解異丙腎上腺素引起的慢性心臟衰竭，保護(hù)心臟功能[17]。結(jié)合文獻(xiàn)，本次研究結(jié)果提示烏司他丁的保護(hù)心臟手術(shù)模型大鼠心功能的作用可能與促進(jìn)PI3K/AKT通路有關(guān)。

本此研究也有一定的局限性，本研究?jī)H為定性研究，關(guān)于烏司他丁的使用劑量和安全性仍需要進(jìn)一步的臨床研究。此外，關(guān)于烏司他丁調(diào)控PI3K/AKT通路的分子機(jī)制，以及通過(guò)PI3K/AKT通路保護(hù)心功能的機(jī)制仍需要體內(nèi)或者體外的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，烏司他丁可提高心臟手術(shù)大鼠的心功能，并促進(jìn)PI3K/AKT通路。本研究結(jié)果提示烏司他丁可有效的保護(hù)心臟手術(shù)后的心臟功能，可能成為改善心臟手術(shù)預(yù)后的新方法。