千層紙素A動(dòng)員內(nèi)皮祖細(xì)胞促進(jìn)血管新生作用機(jī)制研究

冷雨澤，張璐莎，孫偉，李夢(mèng)瑤，薛岳進(jìn)，陳璐，王虹

外周血管疾病是由于外周動(dòng)脈血管狹窄或閉塞導(dǎo)致的肢體缺血性疾病，已成為威脅人類健康的主要疾病之一[1]。缺氧是組織缺血后最主要的病理表現(xiàn)，組織缺血缺氧所產(chǎn)生的信號(hào)分子可動(dòng)員骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）至外周循環(huán)，并歸巢于損傷內(nèi)皮參與新生血管的形成。Morishita等[2]研究表明，EPCs可分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞，在心肌缺血和血管損傷時(shí)，EPCs可誘導(dǎo)血管生成和血管修復(fù)。在機(jī)體缺血或細(xì)胞因子的作用下，EPCs動(dòng)員到外周循環(huán)并歸巢至缺血組織，在局部分泌血管新生相關(guān)的因子，分化、增殖形成內(nèi)皮細(xì)胞與新生血管，促進(jìn)內(nèi)皮損傷修復(fù)[3]。激活基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）通路可動(dòng)員骨髓EPCs進(jìn)入血液循環(huán)，以修復(fù)血管內(nèi)皮[4]；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）其刺激有絲分裂、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和基質(zhì)侵襲的能力使其在血管生成、腫瘤發(fā)生和組織再生中發(fā)揮中心作用，能夠顯著提高EPCs的遷移能力[5]，CXC型趨化因子配體16（CXCL16）及其受體介導(dǎo)EPCs募集和血管形成，EPCs通過分泌單核細(xì)胞趨化性蛋白1（MCP-1）提供血管生成環(huán)境[6,7]。由于缺血區(qū)細(xì)胞存活率較低，且EPCs擴(kuò)增能力及自我更新能力有限，因此如何促進(jìn)EPCs動(dòng)員仍需進(jìn)一步的研究。千層紙素A（又名千層紙黃素，木蝴蝶素），屬于次生代謝產(chǎn)物，為黃酮類化合物。本課題組前期研究結(jié)果表明，千層紙素A可通過內(nèi)皮依賴的一氧化氮途徑發(fā)揮舒張血管的作用[8]，提示千層紙素A可用于外周血管疾病的治療。證據(jù)表明，內(nèi)皮祖細(xì)胞從骨髓動(dòng)員到外周血液中，遷移到缺血部位發(fā)揮促血管新生的作用[9,10]。本研究采用小鼠后下肢缺血模型，通過激光多普勒成像儀（USA）觀察到千層紙素A對(duì)后下肢缺血損傷小鼠血流具有恢復(fù)作用，從而進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)千層紙素A可促進(jìn)后下肢缺血小鼠腓腸肌組織中EPC的動(dòng)員，最終發(fā)現(xiàn)千層紙素A可上調(diào)血管新生相關(guān)的蛋白或因子基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP-3）、MMP-9、CXCL16、MCP-1、HGF的表達(dá)。表明千層紙素A通過促進(jìn)EPCs動(dòng)員來改善缺血癥狀可能與調(diào)節(jié)血管新生相關(guān)蛋白或因子有關(guān)，可為治療缺血性疾病提供臨床前證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物30只SPF級(jí)健康ICR小鼠，雄性，體質(zhì)量（30±2）g，8周齡，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于天津市中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)放射工程研究所動(dòng)物房中分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食，飼養(yǎng)溫度22～25℃，相對(duì)濕度40%～60%。

1.1.2 藥物與試劑千層紙素A，天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院藥學(xué)部提供，由中藥杜仲中分離提取，經(jīng)核磁共振（NMR）譜數(shù)據(jù)分析鑒定；辛伐他?。ê贾菽硸|制藥有限公司，批號(hào)L0233822）；avertin（美國(guó)Sigma公司）；流式抗體PE-Flk-1，APC-Cy7-Sca-1（Becton，Dickin-son and Company；貨號(hào)分別為555308、560654）。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。全蛋白提取試劑盒，甘氨酸（glycine），Amresco公司；SDS，Sigma公司；5×SDS上樣緩沖液，碧云天公司；Anti-MMP-9 antibody（Cell Signaling公司）；Anti-MMP-3 antibody（Cell Signaling公司）；Anti-beta Actin antibody（美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)ab6276）；小鼠肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶公司，貨號(hào):SEKM-0089）。

1.1.3 儀器體式顯微鏡LEICA S8APO（德國(guó)Leica公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；64R型低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）；小動(dòng)物手術(shù)器械包（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；COMPAC5小動(dòng)物多功能麻醉機(jī)（美國(guó)VETEQUIP）；純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 單側(cè)后肢缺血模型（HLI）的建立根據(jù)文獻(xiàn)方法建立小鼠單側(cè)后肢缺血損傷模型。以15 mg/ml阿佛丁（16.5 ml/kg）腹腔注射行全身麻醉，取仰臥位固定后備皮。自右后肢腹股溝處做橫向切口，鈍性分離肌肉，暴露股動(dòng)脈、股靜脈和伴行神經(jīng)，其中股動(dòng)靜脈起源于髂外動(dòng)脈終止于隱靜脈和隱動(dòng)脈，以7/0號(hào)絲線結(jié)扎骨深動(dòng)脈起始處血管，離斷并剪掉股動(dòng)脈及其分支，逐層縫合肌肉和皮膚，左側(cè)后肢作為非缺血肢體對(duì)照。術(shù)后腹腔注射0.2 ml濃度為5 mg/ml抗生素，防止感染。采用激光多普勒掃描成像系統(tǒng)檢測(cè)小鼠結(jié)扎并離斷股動(dòng)脈前后結(jié)扎部位的血流速度，術(shù)后血流速度降至術(shù)前的10%以下，且血流的頻譜發(fā)生明顯的改變，以此作為后肢缺血模型成功建立的標(biāo)準(zhǔn)，將小鼠置于37 ℃電熱毯上直至蘇醒。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及用藥按照隨機(jī)雙盲的方法，將后下肢缺血模型造模成功的小鼠分成三組：模型組、千層紙素A組（Oroxylin A）和辛伐他汀組（Sim），每組各10只。為便于分組及觀察，在小鼠尾部涂上橫條紋，以示不同號(hào)碼。模型組采用0.2%CMC-Na的生理鹽水灌胃；千層紙素A組采用千層紙素A 10 mg/kg·d，灌胃；辛伐他汀組采用辛伐他汀10 mg/kg·d，灌胃。術(shù)后1 h給藥；模型組給予同體積的0.2%CMC-Na的生理鹽水，連續(xù)給藥3、7、14、28 d。

1.2.3 相關(guān)檢測(cè)方法

1.2.3.1 激光多普勒高分辨點(diǎn)掃描檢測(cè)小鼠后肢血流灌注為評(píng)價(jià)各組小鼠結(jié)扎肢體血流灌注恢復(fù)程度，采用激光多普勒灌注成像儀來測(cè)量術(shù)前、術(shù)后及給藥后3、7、14、28 d這6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的缺血側(cè)（右側(cè)后肢）的血流灌注情況與未缺血對(duì)側(cè)（左側(cè)后肢）的血流灌注。用分析軟件（moor LDI laser Doppler Imager Review V 6.0）分析血流灌注情況，通常把背景閾值設(shè)置為0.2，以閾值調(diào)整去除背景噪音，選擇目的檢測(cè)區(qū)域經(jīng)過軟件表示平均的激光多普勒血流值。用每只小鼠同一時(shí)間點(diǎn)的缺血側(cè)與未缺血側(cè)的血流灌注情況的比值表示這只小鼠的缺血下肢血流恢復(fù)情況。

1.2.3.2 染色法檢測(cè)缺血小鼠腓腸肌組織形態(tài)將各組小鼠的腓腸肌組織，浸入10%多聚甲醛溶液中，備用于組織切片，經(jīng)脫蠟、切片、脫蠟脫水、清洗、染色等步驟處理后，組織鏡檢觀察標(biāo)本著色情況。若著色較好，染色核漿分明，紅藍(lán)適度，透明潔凈，可用中性樹膠封片；晾片后可閱片拍照。

1.2.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EPCs動(dòng)員采用FACS流式細(xì)胞儀檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞懸液，每份標(biāo)本檢測(cè)10萬個(gè)細(xì)胞，以GFP+/Flk-1+/Sca-1+細(xì)胞占單核細(xì)胞的比例表示外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量，采用Cell Quest軟件分析并記錄外周血單個(gè)核細(xì)胞中GFP+/Flk-1+/Sca-1+內(nèi)皮祖細(xì)胞的比例。

1.2.3.4 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)血管新生相關(guān)因子嚴(yán)格按照說明書要求規(guī)范操作，采用ELISA法分別測(cè)定術(shù)后3、7、14 d，小鼠血漿中血管新生相關(guān)因子HGF的表達(dá)水平，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。

1.2.3.5 蛋白芯片檢測(cè)血管新生相關(guān)蛋白按照蛋白芯片（R＆D公司，貨號(hào)：ARY028）說明書操作，檢測(cè)術(shù)后3、7、14 d，CXCL16、MCP-1蛋白的變化。

1.2.3.6 蛋白免疫印跡法檢測(cè)血管新生相關(guān)蛋白提取骨髓總蛋白，BCA法測(cè)定骨髓組織總蛋白的濃度，分裝蛋白樣品。通過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、加入一抗Anti-MMP 9 antibody（1:500）、Anti Anti-MMP 3 antibody（1:500）、-beta Actin antibody（1:5000）孵育，加入對(duì)應(yīng)二抗（1:10000）顯色，膠片掃描分析后分析MMP3、MMP9蛋白水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用LSD-t法檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 千層紙素A對(duì)后下肢缺血損傷小鼠血流恢復(fù)作用課題組前期實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用小鼠后下肢缺血模型，發(fā)現(xiàn)千層紙素A中劑量（10 mg/kg·d）組較低劑量組和高劑量組效果顯著，本研究采用中劑量進(jìn)一步探討千層紙素A促血管新生的作用機(jī)制。模型組（Model）、千層紙素A組和辛伐他汀組（Sim）小鼠單側(cè)后肢缺血損傷模型術(shù)前、術(shù)后及術(shù)后3、7、14、28 d，采用激光多普勒成像儀測(cè)定小鼠下肢血流，激光多普勒成像系統(tǒng)采集小鼠股動(dòng)脈結(jié)扎前、結(jié)扎后、給藥后1、3、7、14、28 d的血流灌注情況和小鼠股動(dòng)脈結(jié)扎側(cè)與正常側(cè)后肢血流比值動(dòng)態(tài)分析結(jié)果圖。如圖1A所示，與模型組相比，千層紙素A組小鼠下肢血流明顯改善，術(shù)后14、28 d，與模型組相比，千層紙素A組和辛伐他汀組缺血組織血流恢復(fù)顯著提高，圖1B為量化結(jié)果。給藥28 d，小鼠腓腸肌組織HE染色結(jié)果如圖1C所示，后下肢缺血小鼠給予千層紙素A治療，與模型組相比，肌肉組織形態(tài)較規(guī)則，肌束間隙明顯變小，有較明顯的腓腸肌缺血損傷修復(fù)作用。結(jié)果表明，術(shù)后14、28 d，千層紙素A可促進(jìn)小鼠缺血下肢血流恢復(fù)。

圖1 千層紙素A對(duì)后下肢缺血小鼠血流恢復(fù)的影響

2.2 千層紙素A對(duì)HLI小鼠腓腸肌組織中EPC動(dòng)員的影響應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)采集小鼠股動(dòng)脈結(jié)扎前后、給藥1、3、7 d的外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量，外周血中GFP+/Sca-1+/Flk-1+細(xì)胞比例動(dòng)態(tài)分析結(jié)果見圖2，圖2 B結(jié)果顯示，給藥1 d，千層紙素A組（3.67±3.03）和假手術(shù)組（2.67±1.73）外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞比例顯著高于模型組（0.88±0.75），P＜0.05。

圖2 千層紙素A對(duì)后下肢缺血小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員的影響

2.3 千層紙素A對(duì)HLI小鼠血管新生相關(guān)蛋白及HGF因子的影響

2.3.1 千層紙素A對(duì)小鼠缺血腓腸肌MMP3，MMP9蛋白表達(dá)的影響給藥14 d時(shí)缺血腓腸肌組織Western blot結(jié)果顯示（圖3），在給藥第3 d時(shí)與模型組比較，千層紙素A治療組MMP3、MMP9的表達(dá)量均顯著下降；給藥第14 d時(shí)與模型組相比較，千層紙素A組MMP3的表達(dá)量呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)；千層紙素A對(duì)后下肢缺血小鼠血漿中HGF因子濃度的影響如圖4所示。給藥第3 d時(shí)與模型組比較，千層紙素A治療組HGF的濃度顯著上升（P＜0.05）。

圖3 Western blot檢測(cè)后下肢缺血小鼠給藥3、7、14 d缺血肌肉組織MMP3、MMP9蛋白和血漿HGF因子的表達(dá)

2.3.2 千層紙素A對(duì)小鼠缺血腓腸肌CXCL16、MCP-1蛋白表達(dá)及血漿中HGF因子的影響給藥14 d時(shí)缺血腓腸肌組織蛋白芯片結(jié)果如圖4所示，在給藥第3 d時(shí)與模型組比較，千層紙素A治療組CXCL16的表達(dá)量顯著上升（P＜0.001）；給藥第14 d時(shí)與假手術(shù)組相比較，模型組的CXCL16表達(dá)量呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)（P＜0.001）；給藥第7 d時(shí)與假手術(shù)組比較，模型組的MCP-1的表達(dá)量顯著下降（P＜0.01），千層紙素A組與模型組比較表達(dá)量顯著上升（P＜0.05）。

圖4 蛋白芯片和ELISA檢測(cè)后下肢缺血小鼠給藥14 d缺血肌肉組織CXCL16和MCP-1蛋白的表達(dá)

3 討論

本研究首先通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)千層紙素A對(duì)后下肢缺血損傷小鼠具有血流恢復(fù)作用，進(jìn)一步得到千層紙素A可以動(dòng)員內(nèi)皮祖細(xì)胞促進(jìn)血管新生，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)EPCs動(dòng)員和血管新生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白或因子MMP9、CXCL16、HGF、MCP-1有關(guān)。內(nèi)皮祖細(xì)胞與缺血性疾病有密切關(guān)聯(lián)，組織缺血缺氧所產(chǎn)生的信號(hào)分子可動(dòng)員骨髓EPCs至外周循環(huán)，并歸巢于損傷內(nèi)皮參與新生血管的形成，從而改善后下肢缺血的癥狀[11]。

內(nèi)皮祖細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，具有多向分化潛能，是一類能增殖、分化為血管的內(nèi)皮細(xì)胞，臨床價(jià)值巨大。在某些生理或病理因素的刺激下，從骨髓動(dòng)員到外周血參與損傷血管的修復(fù)[12]。MMP3、MMP9、CXCL16、HGF、MCP-1是促進(jìn)EPCs動(dòng)員和血管新生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。研究顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞通過產(chǎn)生肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9和MMP-3提供血管生成環(huán)境，并在小鼠中與內(nèi)皮祖細(xì)胞共注射時(shí)誘導(dǎo)血管形成[13]。

新生血管通過兩種機(jī)制產(chǎn)生：一是先前存在的微血管內(nèi)皮細(xì)胞的復(fù)制和重組；二是重新招募內(nèi)皮祖細(xì)胞，這些內(nèi)皮祖細(xì)胞隨后并入現(xiàn)有組織，分化為成熟的功能性內(nèi)皮細(xì)胞[14]。人類和小鼠的內(nèi)皮祖細(xì)胞已被證明可表達(dá)CXCL16受體CXCR6[15]，且CXCL16和MCP-1均具有促進(jìn)血管生成的作用[16]。一定條件下，EPCs可誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，還可分泌大量與血管新生相關(guān)的生長(zhǎng)因子，作用于自身和體細(xì)胞調(diào)節(jié)血管再生。因此，血管新生相關(guān)因子的分泌對(duì)于緩解缺血情況，改善缺血性疾病的癥狀尤為重要。

千層紙素A給藥后，外周血中代表內(nèi)皮祖細(xì)胞的GFP+/Sca-1+/Flk-1+細(xì)胞數(shù)量明顯高于模型組，提示千層紙素A通過改善缺血組織微環(huán)境來促進(jìn)骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的動(dòng)員。在第7 d時(shí)，千層紙素A增加對(duì)HLI小鼠腓腸肌組織中血管新生相關(guān)因子或蛋白CXCL16，MCP-1的表達(dá)，提示千層紙素A可提供更好的血管生成環(huán)境，募集EPC,促進(jìn)血管生成。病理狀態(tài)下，模型組MMP調(diào)節(jié)功能下降，不利于內(nèi)皮細(xì)胞遷移功能的發(fā)揮，使得血管新生功能降低。而千層紙素A組基質(zhì)金屬蛋白酶MMP3，MMP9蛋白的表達(dá)升高，提示千層紙素A可能通過激活MMP-9通路動(dòng)員骨髓EPCs進(jìn)入血液循環(huán)，修復(fù)血管內(nèi)皮，一定程度上可促進(jìn)血管新生，緩解下肢缺血。此外，MMP還是一種炎性介質(zhì)，適當(dāng)調(diào)節(jié)MMP表達(dá)有利于新生血管的結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定。結(jié)果顯示，在給藥后第3 d，與模型組比較，千層紙素A治療組HGF的濃度顯著上升，提示千層紙素A可能提高了EPCs的遷移能力，使其更好的促進(jìn)血管生成。

綜上可知，千層紙素A能夠促進(jìn)EPCs分泌釋放血管新生所必需的因子MMP3、MMP9、CXCL16、HGF、MCP-1，可能是千層紙素A促進(jìn)EPCs介導(dǎo)的血管新生作用機(jī)制之一。然而千層紙素A促進(jìn)骨髓EPCs動(dòng)員的機(jī)制及其促血管新生的具體過程尚待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果對(duì)于千層紙素A用于治療缺血性疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。