NLRP3/IL-1β/TGF-β1信號(hào)軸在AngⅡ誘導(dǎo)高血壓心肌纖維化小鼠中的作用研究

劉孟楠，楊廷富，羅鋼，劉顏，楊思進(jìn)

高血壓是指流動(dòng)的血液對(duì)血管壁的壓力值持續(xù)高于正常。2012～2015年流行病學(xué)調(diào)查顯示我國(guó)成人高血壓患病率為27.9%，且有持續(xù)上升的趨勢(shì)[1,2]。高血壓是常見(jiàn)的慢性疾病，常伴循環(huán)系統(tǒng)的靶器官損傷，持續(xù)的血壓增高會(huì)導(dǎo)致心肌纖維化，嚴(yán)重影響心臟的收縮和舒張功能[2]。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）為體內(nèi)腎臟所產(chǎn)生的一種升壓調(diào)節(jié)體系，該系統(tǒng)的激活會(huì)導(dǎo)致血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）在體內(nèi)的分泌增高致使血管收縮，血壓增高。抑制RAAS系統(tǒng)的激活及拮抗AngⅡ是治療高血壓心肌纖維化的重要途徑[3]。

有研究表明與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）有關(guān)的多條信號(hào)通路的激活與多種器官纖維化密切相關(guān)[4]；核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體所介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡被認(rèn)為是一種新型的細(xì)胞程序性死亡方式，其下游炎癥因子白介素-1β（IL-1β）可在局部甚至全身引起廣泛炎癥，亦有研究表明，NLRP3炎癥小體在各種器官纖維化過(guò)程中起重要作用[5,6]。本研究擬探討NLRP3/IL-1β/TGF-β1信號(hào)軸在AngⅡ誘導(dǎo)高血壓心肌纖維化小鼠中的作用，借此說(shuō)明該信號(hào)軸之間的內(nèi)部聯(lián)系并為高血壓心肌纖維化的治療提供靶點(diǎn)依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料福辛普利鈉片購(gòu)自中美上海施貴寶制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H19 980197；AngⅡ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)：A9525-50MG；Alzet滲透壓泵購(gòu)自美國(guó)Alzet公司，型號(hào)：Model2004；NLRP3、Caspase-1、IL-1β、TGF-β1和GAPDH抗體均購(gòu)自美國(guó)Affinity公司，貨號(hào)分別為DF7438、AF5418、AF4006、BF8012、AF7021；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：ChemiScope 6200；熒光定量PCR儀，瑞士ROche公司，型號(hào)：LightCycler 480Ⅱ；尾套管無(wú)創(chuàng)血壓儀，日本軟隆株式會(huì)社，型號(hào)：BP98A；超高分辨小動(dòng)物超聲成像機(jī)，加拿大FUJIFILM VisualSonics公司，型號(hào)：Vevo 3100。

1.2 模型建立及分組SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠30只，體重19～21 g，動(dòng)物可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)在西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和福辛普利組。模型組和福辛普利組均以背部皮下植入劑量為1.46 mg/kg·d的滲透壓泵持續(xù)輸注Ang Ⅱ連續(xù)28 d的方式建立高血壓心肌纖維化模型，福辛普利組予以福辛普利鈉1.2 mg/kg·d灌胃。各組均普食，不限飲水。造模后每周第5 d上午8時(shí)使用鼠尾套管無(wú)創(chuàng)血壓儀檢測(cè)血壓1次，收縮壓持續(xù)高于150 mmHg（1 mmHg=0.133kPa）表明造模有效，造模結(jié)束后處死小鼠取心臟行馬松染色，可見(jiàn)明顯膠原增生及血管周圍纖維化則造模成功。以上研究方案均通過(guò)西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查，倫理審批編號(hào)：20200812。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 血壓監(jiān)測(cè)采用尾套法監(jiān)測(cè)收縮壓（SBP），測(cè)量前將大鼠在35 ℃下保溫5 min，重復(fù)測(cè)量3次。

1.3.2 超聲心動(dòng)圖造模第28 d，小鼠經(jīng)2%異氟烷麻醉后剃毛后進(jìn)行超聲心動(dòng)圖評(píng)估心臟功能。指標(biāo)包括左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左心室縮短分?jǐn)?shù)（LVFS）。

1.3.3 組織學(xué)和免疫組織化學(xué)心臟標(biāo)本用4%多聚甲醛固定24 h，次日石蠟包埋、切片，進(jìn)行蘇木精和伊紅（HE）染色和馬松（Masson）染色，完成后進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.3.4 RT-PCR使用Trizol法從心臟組織中提取總RNA。DNase處理后，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，擴(kuò)增后使用熒光定量PCR儀進(jìn)行常規(guī)溶解曲線分析測(cè)定Ct值，以2-ΔΔCt的計(jì)算值作為相對(duì)表達(dá)水平，GAPDH用作內(nèi)參進(jìn)行對(duì)照。實(shí)驗(yàn)所需引物由上海生工公司合成（表1）。

表1 引物序列

1.3.5 Western blot檢測(cè)將心臟組織在RIPA裂解緩沖液中裂解。使用考馬斯法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度?？偟鞍淄ㄟ^(guò)SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。膜在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h，然后使用1:1000的一抗（NLRP3、Caspase-1、IL-1β、TGF-β1）在4 ℃搖床過(guò)夜。用TBST洗滌后，將膜放置于適量二抗（1:5000）中在室溫下孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光法曝光，并用Image J軟件分析灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用one-way ANOVA和Tukey’s檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AngⅡ?qū)π∈笱獕鹤兓挠绊懶∈笠话銧顩r良好，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各組未出現(xiàn)厭食、消瘦、明顯不能耐受藥物副作用的表現(xiàn)及突發(fā)的急性死亡。血壓監(jiān)測(cè)顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠收縮壓明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，福辛普利組小鼠收縮壓明顯降低（P＜0.05），圖1。

圖1 小鼠收縮壓情況（n=10，具體數(shù)值以±s表示，**P＜0.01）

2.2 AngⅡ?qū)π∈笮墓δ芗靶呐K結(jié)構(gòu)的影響行彩超檢查后，與對(duì)照組比較，模型組小鼠LVESd和LVEDd明顯升高，LVEF和LVFS明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，福辛普利組小鼠LVESd和LVEDd明顯降低，LVEF和LVFS明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），圖2。

圖2 小鼠心臟彩超情況（n=10，具體數(shù)值以±s表示，**P＜0.01）

2.3 AngⅡ?qū)π∈笮募±w維化的影響HE及馬松染色顯示，對(duì)照組小鼠心肌間心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，排列整齊，無(wú)腫脹、斷裂，肌纖維呈紅色，心肌間質(zhì)間幾乎無(wú)藍(lán)色膠原纖維分布，心血管形態(tài)正常，血管內(nèi)中膜無(wú)增厚；模型組小鼠心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂，部分細(xì)胞腫脹變形、溶解，心肌間質(zhì)及血管周圍可見(jiàn)互連接成網(wǎng)狀的大量藍(lán)色膠原纖維；經(jīng)福辛普利干預(yù)后，可見(jiàn)小鼠心肌細(xì)胞排列紊亂明顯改善，心肌間質(zhì)藍(lán)染的膠原纖維也較模型組顯著減少，心肌及血管周圍的纖維化損傷均得到有效改善，圖3。

圖3 小鼠心肌HE染色及馬松染色情況（×200）

2.4 AngⅡ?qū)π∈笮呐KNLRP3/IL-1β/TGF-β1信號(hào)軸的影響RT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組NLRP3，IL-1β及TGF-β1均顯著顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，福辛普利組NLRP3，IL-1β及TGF-β1均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），圖4。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組NLRP3、Caspase-1、IL-1β及TGF-β1均顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，福辛普利組NLRP3、IL-1β及Caspase-1顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），TGF-β1顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），圖5。

圖4 小鼠心肌組織NLRP3、IL-1β、TGF-β1 mRNA的表達(dá)情況（n=3，具體數(shù)值以±s表示，*P＜0.05，**P＜0.01）

圖5 小鼠心肌組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β及TGF-β1蛋白的表達(dá)情況（n=3，具體數(shù)值以±s表示，*P＜0.05，**P＜0.01）

3 討論

纖維化心臟中始終發(fā)現(xiàn)RAAS系統(tǒng)的激活，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶是生成AngⅡ所必需的分子。心肌纖維化是高血壓心臟病患者心肌重構(gòu)的典型表現(xiàn)，在多項(xiàng)臨床研究中均發(fā)現(xiàn)高血壓心臟病患者心肌出現(xiàn)膠原間質(zhì)和血管周圍的過(guò)度聚集，損害心臟收縮和舒張功能，它持續(xù)發(fā)展對(duì)于包括心衰、冠心病及各種心律失常在內(nèi)的多種心血管疾病都有不利影響[7,8]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI）和血管緊張素受體阻斷劑（ARB）廣泛運(yùn)用于心血管疾病的治療，ACEI可抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶，ARB可靶向拮抗AngⅡ受體，二者均可有效降低患者血壓，但使用的同時(shí)亦伴隨著一些限制或副作用，如使用ACEI類降壓藥易出現(xiàn)刺激性干咳，二者均具有高血鉀、妊娠期婦女、雙側(cè)腎動(dòng)脈狹窄等情況的禁忌癥[9]。因此，除消除血壓升高所帶來(lái)的影響外，尋找減輕甚至逆轉(zhuǎn)纖維化的精準(zhǔn)靶點(diǎn)在高血壓心臟病患者的臨床治療中至關(guān)重，研究在心肌纖維化過(guò)程中關(guān)鍵蛋白的變化有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)該疾病發(fā)生發(fā)展并為其治療開(kāi)拓新方向。

NLRP3炎癥小體是一種細(xì)胞內(nèi)蛋白復(fù)合物，是激活先天免疫和無(wú)菌性炎癥必不可少的。一旦NLRP3被激活，它會(huì)募集下游的調(diào)亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白和半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解-1（Caspase-1）組裝成完整的NLRP3炎性復(fù)合體。Caspase-1被稱為IL-1β轉(zhuǎn)化酶，其前體Caspase-1本身無(wú)催化活性，其一旦被激活，即可將無(wú)活性的促炎因子IL-1β和IL-18的前體剪切加工為能夠引起炎癥反應(yīng)的成熟體，并且在體內(nèi)引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。已有研究表明IL-1β和IL-18的成熟和分泌會(huì)引起心臟成纖維細(xì)胞的增殖和活化，導(dǎo)致心肌纖維化[10]。在我們建立的高血壓小鼠模型中，觀察到小鼠心臟心功能顯著下降，心肌纖維化、心臟重塑、NLRP3高表達(dá)和心臟炎癥，在使用福辛普利阻斷AngⅡ生成后，上述表現(xiàn)顯著減少。Gan等[11]研究表明，通過(guò)阻斷NLRP3炎癥小體激活可以改善巨噬細(xì)胞中AngⅡ刺激的IL-1β分泌從而抑制成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，因此抑制NLRP3/IL-1β軸能夠減輕AngⅡ誘導(dǎo)的心臟炎癥和纖維化。Gao等[12]的體內(nèi)研究表明，NLRP3靶向抑制劑可通過(guò)抑制心肌梗死后的早期炎癥反應(yīng)來(lái)減輕小鼠模型的纖維化和改善心臟功能。

NLRP3炎癥小體會(huì)激活炎性因子IL-1β，而IL-1β可調(diào)控TGF-β1生成，因此研究NLRP3/I-1β/TGF-β1信號(hào)軸在高血壓心肌纖維化發(fā)生發(fā)展具有重要意義[13]。

TGF-β家族被發(fā)現(xiàn)能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，在促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)上具有巨大的作用，一般來(lái)說(shuō)TGF-β家族功能相似，但TGF-β1的功能最為強(qiáng)大，亦是目前的研究熱點(diǎn)[14]。通常情況下TGF-β存在于正常心臟中但無(wú)法與其受體結(jié)合。當(dāng)心臟損傷后，TGF-β以潛伏形式轉(zhuǎn)化為活性形式并對(duì)下游蛋白進(jìn)行調(diào)節(jié)，而相對(duì)少量的激活即能夠引發(fā)巨大的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[4,15]。本研究所建立的小鼠高血壓心肌纖維化模型中驗(yàn)證了TGF-β1在疾病模型中的表達(dá)，與所報(bào)道的研究一致，且福辛普利能夠顯著抑制這一信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。多項(xiàng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明心臟TGF-β1過(guò)表達(dá)可直接誘導(dǎo)心室纖維化，而在心臟壓力超負(fù)荷的大鼠模型中，TGF-β阻斷劑可預(yù)防心肌纖維化[16,17]。雖然已經(jīng)明確如ACEI類藥物通過(guò)控制血壓升高能夠抑制高血壓心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展，但對(duì)于靶向修復(fù)心肌細(xì)胞及抑制心肌纖維化仍是亟待解決的問(wèn)題。TGF-β對(duì)心臟成纖維細(xì)胞的增殖激活作用可能會(huì)成為一個(gè)具有前景的治療靶點(diǎn)[18]。

本研究表明，NLRP3/IL-1β/TGF-β1信號(hào)軸與高血壓心肌纖維化密切關(guān)聯(lián)，ACEI類藥物具有控制血壓和減輕高血壓所造成的心肌纖維化。這種關(guān)聯(lián)對(duì)于該疾病的研究提供了新的思路，基于該信號(hào)軸作為新的治療靶點(diǎn)具有研究前景。