環(huán)境檢測中微生物檢測的質(zhì)量控制

＊胡關(guān)燕

（廣州市建筑材料工業(yè)研究所有限公司 廣東 510663）

1.微生物檢測技術(shù)概況

隨著科學(xué)技術(shù)水平的不斷進(jìn)步，微生物檢測技術(shù)類別也越來越多。本文將微生物檢測技術(shù)大致分為四類：

（1）生化反應(yīng)鑒定檢測技術(shù)。傳統(tǒng)的生化反應(yīng)鑒定檢測技術(shù)鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但是相對耗時費(fèi)力，檢測周期長。微型、簡便、快速、自動化監(jiān)測技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，如顯色培養(yǎng)技術(shù)、免疫磁珠技術(shù)、手動或全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)、微生物快速測試片、流式細(xì)胞儀、高通量測序檢測與篩查技術(shù)等[1]。

（2）免疫學(xué)檢測技術(shù)。免疫學(xué)檢測技術(shù)的靈敏度高，重復(fù)性強(qiáng)，成本低，但是制備抗體前處理麻煩。免疫學(xué)檢測技術(shù)又分類為放射免疫分析技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)、時間分辨熒光免疫分析技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)、其他免疫學(xué)檢測技術(shù)。

（3）分析生物學(xué)檢測技術(shù)。分析生物學(xué)檢測技術(shù)又分類為PCR檢測技術(shù)、核酸等溫檢測技術(shù)、基因芯片檢測技術(shù)[2]、核酸分型檢測技術(shù)及其他核酸檢測技術(shù)。

（4）其他檢測技術(shù)。其他檢測技術(shù)有基于ATP的檢測技術(shù)、熒光標(biāo)記細(xì)胞檢測技術(shù)、流式細(xì)胞檢測技術(shù)等。

微生物檢測技術(shù)適用范圍廣泛，涉及水質(zhì)、食品、疾病預(yù)防控制、化妝品、藥品、建設(shè)工程材料、園林綠化、農(nóng)產(chǎn)品、電子電氣、日用化工產(chǎn)品、金屬制品、陶瓷制品、嬰幼產(chǎn)品、水暖衛(wèi)浴產(chǎn)品、輕紡產(chǎn)品、家具、機(jī)械設(shè)備、醫(yī)療器械、特種設(shè)備、化學(xué)品、固體廢物、土壤和沉積物等類別對象。其中，傳統(tǒng)的生化反應(yīng)鑒定檢測技術(shù)占比最高，其次是PCR檢測技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)、核酸等溫檢測技術(shù)、熒光標(biāo)記細(xì)胞檢測技術(shù)、手動或全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)、微生物快速測試片、免疫磁珠技術(shù)、流式細(xì)胞儀等。

2.環(huán)境檢測領(lǐng)域中微生物檢測概況

目前，環(huán)境檢測領(lǐng)域中，涉及資質(zhì)認(rèn)定的微生物檢測類的檢測對象有水和廢水、海水、污水處理廠污泥、化學(xué)品、海洋沉積物等。各類檢測對象中所采用的常規(guī)檢測方法有：平板計數(shù)法、紙片法、多管法、濾膜法、酶底物法等。檢測方法為傳統(tǒng)生化反應(yīng)鑒定檢測技術(shù)居多。

微生物檢測的實(shí)驗(yàn)過程，相對化學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)來說差異性比較大，同樣相應(yīng)的質(zhì)量控制也有較大的差異。為了做好微生物檢測的質(zhì)量控制，能更好地保障結(jié)果的有效性。本文將從人員、場所、儀器、物料、方法、管理體系這六大方面闡述環(huán)境檢測領(lǐng)域中常規(guī)微生物檢測的質(zhì)量控制要點(diǎn)。

3.人員

鑒于微生物檢測的特殊性，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對相應(yīng)的人員進(jìn)行專門的培訓(xùn)，培訓(xùn)需結(jié)合所檢項目的技術(shù)與質(zhì)量要求開展。

（1）采樣人員。采樣人員需要經(jīng)過培訓(xùn)，了解樣品采集需要做到的質(zhì)量控制要點(diǎn)：微生物的樣品采集需安排優(yōu)先采集或?qū)Ｓ貌杉ぞ?，避免采樣人員在樣品采集的過程中引起更多的交叉污染。采集所用的采樣裝置和容器，在使用前需要進(jìn)行滅菌。采樣人員需要了解采樣現(xiàn)場的廢水處理工藝，判斷是否需要加入能去除活性氯的硫代硫酸鈉溶液等保存劑。微生物樣品對保存時間和保存溫度都有要求，采樣人員需要了解所采集項目的時效合理安排采樣任務(wù)。實(shí)驗(yàn)室需配備足夠的保溫箱，實(shí)現(xiàn)分區(qū)域保存采集容器和樣品，從采樣到運(yùn)輸都保證樣品不受污染。

（2）樣品管理員。送回實(shí)驗(yàn)室的微生物樣品，樣品管理員需做到以下質(zhì)量控制的基本要求：檢查樣品的保存條件和時效是否符合所檢項目的要求。需要把放置微生物檢測用的樣品存放區(qū)域和其他樣品存放區(qū)域區(qū)分開，以保證領(lǐng)樣前，樣品不受污染。需定期對存放微生物樣品的區(qū)域進(jìn)行消毒和保存溫度的監(jiān)控。

（3）分析人員、審核人員等應(yīng)具備相關(guān)的培訓(xùn)、工作經(jīng)歷，了解微生物檢測分析方法的技術(shù)和質(zhì)量控制要點(diǎn)，并能按照方法和實(shí)驗(yàn)室的要求，把相應(yīng)的質(zhì)量控制活動落實(shí)執(zhí)行。

4.場所

（1）消毒。實(shí)驗(yàn)室的消毒，可以用紫外滅菌燈開啟30min；或者用75%乙醇溶液、新潔爾滅溶液、84消毒液等定期輪換擦拭[3]。

（2）驗(yàn)收。目前，環(huán)境檢測領(lǐng)域，沒有專門針對微生物檢測實(shí)驗(yàn)場所的消毒驗(yàn)收要求、技術(shù)規(guī)范等。行業(yè)內(nèi)普遍采用的是參照《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）沉降菌的測試方法》GB/T 16294-2010等方法對消毒后的實(shí)驗(yàn)場所進(jìn)行無菌驗(yàn)收測試。

（3）實(shí)驗(yàn)室布局。實(shí)驗(yàn)室的布局應(yīng)減少和避免潛在的污染：建議使用彩鋼板作為功能區(qū)的隔板，地板宜選用PVC材質(zhì)的材料，這些材質(zhì)都相對比較容易清潔和消毒干凈；總體布局宜遵循“單方向工作流程”原則[4]。

（4）新風(fēng)補(bǔ)給系統(tǒng)。無菌室為了維持無菌的環(huán)境，一般需要密閉性良好，不引入為經(jīng)過處理的新風(fēng)。微生物檢測的無菌室，一般采用新風(fēng)補(bǔ)給系統(tǒng)來維持實(shí)驗(yàn)室的新風(fēng)補(bǔ)給，同時不會因新風(fēng)補(bǔ)給而引入新的污染。

經(jīng)研究表明，紫外消毒在低溫環(huán)境下進(jìn)行空氣消毒時的有效消毒時間為30～60min[5]。因此微生物在無菌室進(jìn)行紫外消毒時，把新風(fēng)補(bǔ)給系統(tǒng)開啟，設(shè)定20℃以下溫度，消毒效果很有保障。

進(jìn)入無菌室的新風(fēng)是經(jīng)過新風(fēng)補(bǔ)給系統(tǒng)過濾消毒后帶入的，這樣才能保證：（1）新風(fēng)補(bǔ)給沒有污染；（2）檢測分析人員能在無菌室長時間的操作，不會因缺乏新風(fēng)而缺氧[6]。因此，在對消毒后的實(shí)驗(yàn)場所進(jìn)行無菌驗(yàn)收測試時，需要在打開新風(fēng)補(bǔ)給系統(tǒng)的情況下進(jìn)行驗(yàn)收測試的樣品采集。

5.儀器

微生物檢測需要的儀器設(shè)備大致有：滅菌消毒儀器、生物安全柜與超凈臺、恒溫培養(yǎng)儀器、生化分析儀器、基因檢測儀器、分子檢測儀器等。其中需要做的質(zhì)量控制活動有：

（1）計量。對于檢測結(jié)果、生物安全等方面有重大影響的設(shè)備需要進(jìn)行計量。如培養(yǎng)箱、生物安全柜等。設(shè)備經(jīng)過計量后，需要對結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)，保證設(shè)備的使用滿足標(biāo)準(zhǔn)，必要時需把校準(zhǔn)因子用到檢測工作中。

（2）消毒。檢測人員應(yīng)定期對恒溫培養(yǎng)儀器的內(nèi)部箱體進(jìn)行消毒，以保證箱體潔凈無菌，不會引起樣品或試劑的污染；對于無菌操作過程中的容器、玻儀等，也需要進(jìn)行消毒處理。

對于滅菌消毒儀器，檢測人員應(yīng)每次都監(jiān)控其滅菌消毒效果。在《水和廢水監(jiān)測分析方法（第四版）（增補(bǔ)版）》中，有對干熱、濕熱滅菌消毒儀器及紫外滅菌燈的質(zhì)控要求。其中，需要干熱滅菌箱每日進(jìn)行溫度穩(wěn)定性的校驗(yàn)；需要濕熱滅菌器每月進(jìn)行滅菌效果的檢查；需要在每個季度檢查其紫外燈光強(qiáng)度或滅菌能力[7]。隨著市場的需求越來越大，市面上也有相應(yīng)簡便的操作方式對滅菌效果進(jìn)行檢查。如滅菌指示卡，紫外線強(qiáng)度指示卡、消毒變色膠帶等。

（3）維護(hù)。儀器的日常維護(hù)，是質(zhì)量保證的重要措施之一。其中，新風(fēng)系統(tǒng)的濾芯更換未能得到實(shí)驗(yàn)室的關(guān)注和落實(shí)，這樣容易引起新風(fēng)系統(tǒng)無法正常工作，從而影響無菌室的正常使用。另外，實(shí)驗(yàn)室對儀器維護(hù)的性能驗(yàn)證要求和頻率要求不是很清晰，如若檢測分析方法沒有要求，可以參考《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品微生物檢測》GB/T 27450-2008的附錄C（資料性附錄）設(shè)備的校準(zhǔn)、維護(hù)和性能驗(yàn)證[8]。

6.物料

微生物檢測中，相對需要重點(diǎn)關(guān)注的物料有：標(biāo)準(zhǔn)菌株、培養(yǎng)基和無菌水。此外，就是輔助工具物料也相應(yīng)需要根據(jù)用途進(jìn)行質(zhì)量控制或輔助進(jìn)行其他方面的質(zhì)量控制。

（1）標(biāo)準(zhǔn)菌株。標(biāo)準(zhǔn)菌株是具有穩(wěn)定的生物學(xué)特性并具有溯源性的。在微生物檢測過程中，標(biāo)準(zhǔn)菌株的作用有：①用于檢測方法的確認(rèn)。②用于實(shí)驗(yàn)過程的質(zhì)量控制。③用于對培養(yǎng)基的性能驗(yàn)證。④用于的相關(guān)試劑的性能要求。⑤用于對相關(guān)儀器設(shè)備的性能驗(yàn)證。⑥用于對內(nèi)部質(zhì)控控制和外部質(zhì)量評估[9]。其中，上述的①②⑥在環(huán)境檢測領(lǐng)域中較為常用。

其中，檢測分析人員對于標(biāo)準(zhǔn)菌株的質(zhì)量控制需要注意以下幾個方面：

A.標(biāo)準(zhǔn)菌株的保藏方法和時效性。

B.標(biāo)準(zhǔn)菌株的傳代培養(yǎng)次數(shù)：標(biāo)準(zhǔn)菌株的傳代培養(yǎng)次數(shù)原則上是不得超過5次。其中，第一袋的活性相對于第二到第五代的活性較弱，建議傳代后從第二代開始冷凍保存更為適宜[4]。

C.原始的標(biāo)準(zhǔn)菌株傳代后應(yīng)制備成儲備菌株和工作菌株，并做好確認(rèn)試驗(yàn)。保證菌株的有效性。

（2）培養(yǎng)基。培養(yǎng)基是可供微生物細(xì)胞生長繁殖和合成各種代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)物質(zhì)。

按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分類，培養(yǎng)基可分為液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基三種。其中，液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基在環(huán)境檢測中的微生物檢測的使用頻次較大。

在微生物檢測中，培養(yǎng)基的作用是能為目標(biāo)檢測物提供營養(yǎng)且盡可能少的產(chǎn)生影響檢測目標(biāo)物的副產(chǎn)物。因此，培養(yǎng)基的驗(yàn)收，是微生物檢測質(zhì)量控制用的重要手段。在《水和廢水監(jiān)測分析方法（第四版）（增補(bǔ)版）》中，對培養(yǎng)基的驗(yàn)收，有以下要求[7]：

每批培養(yǎng)基在使用前需經(jīng)無菌驗(yàn)收。

用已知菌種檢查在此培養(yǎng)基上的生長繁殖情況或做陽性和陰性對照培養(yǎng)檢查試驗(yàn)。

配置每批培養(yǎng)基均要做好記錄，登記配置日期、批次、培養(yǎng)基名稱、成分、pH、滅菌條件、配制方法及配制人等。

除第四版的要求外，還要考慮培養(yǎng)基的存放條件。隨著微生物檢測的需求越來越大，越來越多的檢驗(yàn)檢測人員選擇商品化培養(yǎng)基，部分商品化培養(yǎng)基需要低溫保存，這也是對培養(yǎng)基的質(zhì)量控制工作之一。

（3）無菌水。無菌水的制備：適量實(shí)驗(yàn)用水，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min。對于無菌水的驗(yàn)收，往往是每次試驗(yàn)中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室空白測定來實(shí)現(xiàn)。

（4）輔助工具。為了更好地保障微生物無菌室不受污染，我們可以通過一些輔助工具或內(nèi)務(wù)管理來實(shí)現(xiàn)質(zhì)控控制：

鞋套：進(jìn)入微生物室前套上經(jīng)過消毒的鞋套，能更好地防塵和減少對外界細(xì)菌的接觸。

傳遞窗：傳遞窗是微生物實(shí)驗(yàn)室布局的關(guān)鍵，它讓“單方向工作流程”原則在實(shí)際微生物檢測中能更好地實(shí)現(xiàn)。其中，需要特別注意的是，傳遞窗的紫外燈也需要定期進(jìn)行監(jiān)控其滅菌能力。但是，在目前對紫外燈消毒效果監(jiān)測的方法中，基本要求測試儀器或指示卡需要在紫外燈下垂直距離1m處進(jìn)行測定。由于傳遞窗結(jié)構(gòu)的原因，無法實(shí)現(xiàn)，所以筆者建議參考《水和廢水監(jiān)測分析方法（第四版）（增補(bǔ)版）》的方法，用生長有200～250個細(xì)菌菌落的瓊脂平皿暴露于紫外燈下2min，99%的菌數(shù)被殺滅[7]。

瓷珠保藏管：瓷珠保藏法是將培養(yǎng)好的微生物細(xì)胞或孢子制成懸浮液，轉(zhuǎn)入裝有無菌多孔玻璃珠（或瓷珠）的無菌瓶中，使其吸附于玻璃珠表面，去除多余懸浮液，低溫冷凍保存的一種菌種保藏方法。它適用于大多數(shù)微生物，如無芽孢的細(xì)菌或葡萄球菌以及噬菌體、放線菌、絲狀真菌、金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌屬、霉菌等的保藏[10]。

其中瓷珠保藏法需要用到的工具就是瓷珠保藏管。通過瓷珠保藏管，我們可以把傳代過后的標(biāo)準(zhǔn)菌株的保存時間延長，減少標(biāo)準(zhǔn)菌株的購買成本同時可以保證有足夠數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)菌株配合質(zhì)控控制活動的需要。

7.方法

對于同一個檢測項目，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的條件，申請多方法的資質(zhì)認(rèn)定。如糞大腸菌群，可以申請《水質(zhì)糞大腸菌群的測定多管發(fā)酵法》HJ 347.2-2018、《水質(zhì)糞大腸菌群的測定濾膜法》HJ 347.1-2018、《水質(zhì)總大腸菌群和糞大腸菌群的測定紙片快速法》HJ 755-2015、《水質(zhì)總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定酶底物法》HJ 1001-2018等6種方法。方法的選擇會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和質(zhì)量控制所需的物料和手段。目前，在水（含大氣降水）和廢水的檢測對象中，比較常用的方法為多管發(fā)酵法、紙片快速法和酶底物法。

當(dāng)實(shí)驗(yàn)室申請了多個方法的時候，往往某些方法是比較常用，某些方法是不常用的。這個時候，實(shí)驗(yàn)室需要對不常用的檢測方法進(jìn)行持續(xù)能力的監(jiān)督，以保證方法的適用性和檢測人員的檢測能力持續(xù)性。

8.管理體系

良好的實(shí)驗(yàn)室管理體系運(yùn)作情況應(yīng)該是：輸出的依據(jù)來源于輸入，輸入的改進(jìn)來源于輸出，且輸出和改進(jìn)不斷持續(xù)。相對應(yīng)的質(zhì)控控制活動也是，需要有專門的技術(shù)人員對微生物檢測的質(zhì)量控制活動進(jìn)行文件性化的規(guī)定（即輸入），如把上述的質(zhì)量控制要點(diǎn)、要求等編寫成作業(yè)指導(dǎo)書等技術(shù)文件或納入質(zhì)量控制計劃：如微生物檢測實(shí)驗(yàn)室的內(nèi)務(wù)管理作業(yè)指導(dǎo)書、微生物檢測實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制作業(yè)指導(dǎo)書、微生物檢測實(shí)驗(yàn)室儀器、物理驗(yàn)收與維護(hù)作業(yè)指導(dǎo)書等。通過科學(xué)的統(tǒng)籌內(nèi)，把技術(shù)和質(zhì)量要點(diǎn)融合，監(jiān)督檢驗(yàn)檢測人員的質(zhì)量控制活動的實(shí)施情況。

9.結(jié)論

微生物檢測相對于化學(xué)檢測的差異性確實(shí)比較大，但是同樣可以從人員、場所、儀器、物料、方法、管理體系這六大方面逐一分析，做好質(zhì)量控制工作，保障分析結(jié)果的有效性。