部分還原氧化石墨烯的制備、表征及對人宮頸癌HeLa細胞的體外殺傷作用

王雪麗，宋相偉，解顏寧，杜妮陽，王振新

（1.吉林工商學(xué)院糧食學(xué)院,長春 130507；2.長春師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,長春 130032；3.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所,長春 130022）

石墨烯因受到其制備方法的制約［1~3］而很難在生物領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用.因此，既具備良好水溶性，又具備與核酸、蛋白質(zhì)等分子作用能力的氧化石墨烯（GO）相繼出現(xiàn)［4］.GO自身結(jié)構(gòu)的獨特性使其具備了被動靶向運輸攜載分子的能力，提升了其在藥物運輸方面的應(yīng)用潛力.但是，由于GO表面的部分π鍵被破壞，其傳導(dǎo)電子能力比石墨烯弱.利用化學(xué)還原法等可將GO還原為部分還原的氧化石墨烯（pRGO）和還原氧化石墨烯（rGO）［5，6］.pRGO既保留了GO表面的含氧基團，水分散性良好；又具備較為完整的π鍵基團，可與DNA等生物分子以非共價鍵相互作用，成為較易修飾的納米材料［6］.

目前的腫瘤治療方法多種多樣［7~19］，但由于療效不理想及存在副作用，使得研究者聚焦于結(jié)合不同治療方式的協(xié)同治療（Synergistic therapy）.以GO和rGO為載體的復(fù)合物可以實現(xiàn)光動力治療（PDT）和光熱治療（PTT）的協(xié)同治療，因而受到廣泛關(guān)注.

本文以GO為原料，利用溫和方法制備了3種部分還原氧化石墨烯（pRGO1—3），并考察了其光熱轉(zhuǎn)換能力、單線態(tài)氧生成能力及近紅外激光照射下的體外細胞殺傷力，希望將pRGO開發(fā)為可實現(xiàn)PDT/PTT協(xié)同治療的新型材料.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

氧化石墨購自南京先豐納米材料公司；單線態(tài)氧熒光探針（SOSG）購自Thermo Fisher Scientific公司；HeLa細胞購自南京科佰生物科技有限公司；實驗所用其它試劑均為分析純.

ESCALAB-MKII 250型能譜儀（英國VG公司）；Vertex70型傅里葉變換紅外光譜儀（德國Bruker公司）；Fluke Ti9型紅外熱像儀（美國福祿克公司）；Renishaw 2000型拉曼光譜儀（英國Gloucestershire公司）；H600型透射電子顯微鏡（日本日立公司）；Ti-S型倒置熒光顯微鏡（日本尼康公司）；F-280型熒光分光光度計（天津港東科技）；1918-C型激光功率計（美國Newport公司）.

1.2 實驗過程

1.2.1 pRGO1—3的制備 參照文獻［6］方法制備pRGO1—3.首先制備1 mg/mL的GO分散液；然后在NaOH濃度分別為10 μmol/L，100 μmol/L和5 mmol/L條件下制備pRGO1，pRGO2和pRGO3.

1.2.2 pRGO1—3的表征 制備1 mg/mL的pRGO1—3貯存液并密封保存，備用.根據(jù)實驗需要，取一定體積的pRGO1—3貯存液，制備所需的pRGO1—3樣品液.分別用紫外可見光譜（UV-Vis）、紅外光譜（FTIR）、X射線光電子能譜（XPS）、拉曼光譜（Raman）和透射電子顯微鏡（TEM）分析測定.

1.2.3 pRGO1—3的穩(wěn)定性研究 制備20 μg/mL的GO及pRGO1—3的水溶液，分別于制備后的0，1，3，7和14 d測定樣品的紫外-可見光譜、紅外光譜和透射電子顯微鏡（TEM）.

1.2.4 pRGO1—3的光熱性能研究 制備200 μg/mL的GO及pRGO1—3的水溶液，用808 nm（光強計測定功率密度=1.65 W/cm2）光照射，測定并繪制時間-溫度曲線.

1.2.5 pRGO1—3的單線態(tài)氧檢測 將HeLa細胞（1×104個細胞/孔）培養(yǎng)過夜，利用緩沖液洗滌3次，然后用pRGO1—3培養(yǎng)基再培養(yǎng)4 h.采用NIR激光（808 nm，1.65 W/cm2）照射10 min后孵育5 min，用緩沖液洗滌3次，加入10 μmol/L SOSG染色15 min.以488 nm波長光激發(fā)后，采用熒光顯微鏡檢測（PBS緩沖液）.

1.2.6 pRGO1—3單線態(tài)氧生成量的間接檢測 將單獨的SOSG和SOSG-pRGO1—3復(fù)合物經(jīng)808 nm激光（1.65 W/cm2）照射10 min后；再經(jīng)488 nm波長光激發(fā)，采用熒光光度計檢測.

1.2.7 pRGO1—3的細胞毒性實驗 無光照條件：分別用含有pRGO1—3的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞4 h，緩沖液洗滌3次，然后用新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h.通過鈣黃綠素-AM（Calcein-AM）/碘化丙啶（PI）雙染色實驗觀察細胞存活狀態(tài)，并用MTT法檢測細胞存活率.光照條件：分別用含有pRGO1—3的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞1 h；以808 nm激光（1.65 W/cm2）照射10 min后再孵育5 min，用緩沖液洗滌3次后，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h.通過Calcein-AM/PI雙染色實驗觀察細胞存活狀態(tài)，并用MTT法檢測細胞存活率（PBS緩沖液）.

2 結(jié)果與討論

2.1 pRGO1—3的結(jié)構(gòu)與形貌表征

圖1下方插圖顯示，GO被部分還原后，顏色逐漸由黃色變?yōu)楹谏?由圖1所示UV-Vis光譜可見，相比于GO的吸收峰（230 nm），pRGO經(jīng)部分還原后，π共軛體系部分恢復(fù)，吸收峰發(fā)生紅移.還原程度最大的pRGO3的峰位紅移至232 nm.GO還原程度的不同會影響石墨烯及其衍生物的NIR吸收性能.pRGO1—3表面官能團逐漸減少，π電子的個數(shù)隨之增多，產(chǎn)生能級躍遷的概率越高，pRGO1—3在808 nm處的NIR吸收值越強［20，21］，由圖1上方插圖可見，pRGO3的吸收值比pRGO1增大了約5.6倍.

由圖2中TEM照片可見，GO與pRGO1—3形貌的差別不顯著，均為帶有褶皺的半透明薄膜.放置14 d后GO及pRGO1—3的TEM結(jié)果如圖3所示，其形貌仍為帶有褶皺的半透明薄膜.基于pRGO自身結(jié)構(gòu)上的含氧集團，其具有良好的水溶性.測定了GO及pRGO1—3溶于水后14 d內(nèi)的紫外-可見光譜，結(jié)果如表1和圖4所示.可見，14 d前后GO及pRGO1—3的吸收峰位置與強度均未出現(xiàn)明顯變化，說明pRGO1—3具有較好的穩(wěn)定性.

Fig.1 UV?Vis spectra of GO and pRGO1—3(0.02 mg/mL)

Fig.2 TEM images of GO(A),pRGO1(B),pRGO2(C)and pRGO3(D)

Fig.3 TEM images of GO(A),pRGO1(B),pRGO2(C)and pRGO3(D)after 14 days

Table 1 Peak position and absorbance of GO and pRGO1—3

Fig.4 Stability of GO(A),pRGO1(B),pRGO2(C)and pRGO3(D)(0.02 mg/mL)in water at different days

圖5（A）示出了GO和pRGO1—3的紅外光譜表征結(jié)果.其中，GO的主要吸收譜帶分別位于1070 cm?1（C—O振動），1724 cm?1（C=O振動），1604 cm?1（C=C振動）和3246 cm?1（—OH振動）處［2，3］.而pRGO的紅外光譜中歸屬于環(huán)氧上C—O的峰（1136 cm?1）消失了，且相比于GO，其它峰位均發(fā)生不同程度的紅移.圖6為放置14 d后GO和pRGO1—3的紅外光譜圖.可見，放置14 d后峰位變化較小，說明GO和pRGO1—3的穩(wěn)定性較好.

Fig.5 ATR?FTIR spectra(A),Raman spectra(B)and ID/IG(C)of GO and pRGO1—3(200 μg/mL)

采用拉曼光譜研究了C原子晶體的特征峰，GO，pRGO1，pRGO2和pRGO3的拉曼光譜結(jié)果示于圖5（B）.其中，D峰（~1300 cm?1）和G峰（~1680 cm?1）峰強的比值（ID/IG）可用來指征石墨烯結(jié)構(gòu)的變化，含氧功能團減少或者缺陷被修復(fù)可導(dǎo)致ID/IG比值降低［4］.由圖5（C）可見，ID/IG比值由GO的0.93降低到pRGO3的0.84.

GO和pRGO1—3的C1sXPS表征結(jié)果如圖7所示，可見GO的C1s峰分別位于284.4，284.8，285.9和286.7 eV處，分別歸屬于C—O，C—C，C=O和O—C=O的結(jié)合能［5］.pRGO3的C1s峰分別位于284.4，284.8和286.7 eV處，C=O消失了.相比于GO的O/C比值（0.43），pRGO1—3的O/C比值分別為0.41，0.40和0.38，均有所降低，表明其含氧官能團均有所減少.

相應(yīng)的EDS能譜表征結(jié)果如表2所示，相比于GO，pRGO1—3的氧占比逐漸降低，進一步說明pRGO1—3含氧官能團有所減少.

Fig.6 ATR?FTIR spectra of GO(A),pRGO1(B),pRGO2(C)and pRGO3(D)before(a)and after(b)14 d

Fig.7 C1s XPS spectra of GO(A),pRGO1(B),pRGO2(C)and pRGO3(D)(200 μg/mL)

Table 2 EDS data of GO and pRGO1—3

2.2 pRGO1—3的光熱轉(zhuǎn)換性能

NIR光吸收的增強使得pRGO溶液顯示出高效的光熱轉(zhuǎn)化能力.將相同濃度的GO，pRGO1，pRGO2和pRGO3在808 nm光源下以相同功率密度照射10 min后，其溫度升高曲線如圖8所示.可見，還原程度最大的pRGO3的升溫幅度最大，5 min內(nèi)從25℃升高到45℃.在42~46℃范圍內(nèi)，腫瘤細胞因蛋白功能變化可導(dǎo)致細胞死亡［4］.而pRGO1和pRGO2經(jīng)激光照射后溫度升高到約36℃，GO的最高溫度則約為30℃.利用下式可計算pRGO1—3的光熱轉(zhuǎn)換效率［22］：

式中：ηT（%）為光熱轉(zhuǎn)換效率；h為系統(tǒng)熱轉(zhuǎn)換效率；S（m2）為容器的表面積；Tmax（℃）和Tsurr（℃）分別為樣品的最高溫度和環(huán)境溫度；I（W）為激光功率；Aλ為激發(fā)波長（λ）下樣品的吸光度；Qdis（J·s?1）為對照空白樣的熱量變化.hS通過式（2）計算.其中，m（g）為溶液的質(zhì)量；CH2O（4.2 J·g?1·℃?1）為水的比熱容；τs為系統(tǒng)的時間常數(shù)（無量綱），可經(jīng)式（3）計算.其中，t（s）為冷卻過程中的時間；θ為熱驅(qū)動常數(shù)（無量綱）；T（℃）為t時刻的即時溫度.

經(jīng)計算得出GO和pRGO1—3的光熱轉(zhuǎn)換效率列于表3.其中，pRGO1—3比GO的光熱轉(zhuǎn)換能力有所增強.pRGO3的ηT與合成的MOS2納米球的ηT接近（808 nm，34.46%）［23］.pRGO1—3自身具備的光熱轉(zhuǎn)換能力及易于修飾的較大表面積使其具有開發(fā)成為腫瘤光熱療法新型載體的潛力.

Fig.8 Effects of irradiation time on photothermal heating curves of GO and pRGO1—3

Table 3 Photothermal conversion efficiency of GO and pRGO1—3

2.3 pRGO1—3的細胞毒性

由圖9可見，在未經(jīng)過808 nm激光照射的情況下，當(dāng)pRGO1—3的培養(yǎng)基濃度低于200 μg/mL時，其培養(yǎng)的HeLa細胞存活率均大于90%；而在經(jīng)過808 nm激光照射的情況下，當(dāng)pRGO1—3的濃度逐步增加時，培養(yǎng)的HeLa細胞存活率逐步下降，尤其是當(dāng)濃度大于200 μg/mL時，其HeLa細胞存活率已降到約50%甚至更低.

Fig.9 Cell viability studies with different concentrations of pRGO1(A),pRGO2(B)and pRGO3(C)

pRGO1—3本身細胞毒性的雙染色實驗結(jié)果如圖10（A）所示，未經(jīng)808 nm激光照射下，pRGO1—3存在時培養(yǎng)的HeLa細胞形態(tài)完好，其存活率與對照組基本相同，與MTT實驗結(jié)果一致，說明pRGO1—3本身的細胞毒性較低.經(jīng)808 nm激光照射下的實驗結(jié)果如圖10（B）所示，存在pRGO1—3時，培養(yǎng)的HeLa細胞存活率與對照組有較明顯的區(qū)別.證明pRGO1—3自身的光熱效應(yīng)可殺傷細胞，與MTT實驗結(jié)果一致.

Fig.10 Effect of laser irradiation[wihout(A)and with(B)]on HeLa cell treated with pRGO1—3(scale bar=40 μm)

上述實驗結(jié)果表明，一定濃度的pRGO1—3在808 nm激光照射下對細胞具備一定的殺傷效果.除了pRGO1—3自身具備的光熱轉(zhuǎn)換效應(yīng)外，也可能是其產(chǎn)生的單線態(tài)氧對細胞產(chǎn)生一定的殺傷效果.SOSG與單線態(tài)氧作用后可以產(chǎn)生極強的綠色熒光物質(zhì)SOSG-Endoperoxide（SOSG-EP）.如圖11（A）所示，pRGO1—3經(jīng)NIR激光激發(fā)后，產(chǎn)生了一定的單線態(tài)氧.檢測SOSG-EP在488 nm波長激發(fā)下的綠色熒光可間接檢測反應(yīng)體系中單線態(tài)氧產(chǎn)量［24~26］.圖11（B）為經(jīng)NIR照射后反應(yīng)體系的熒光光譜圖，可見，pRGO3反應(yīng)體系的熒光強度與單獨的SOSG相比增強了6.79倍；pRGO1和pRGO2比SOSG分別增大了1.27和2.01倍.

Fig.11 SOSG stained cell images with laser irradiation(scale bar=10 μm)(A)and fluorescence spectra of pRGO1—3?SOSG?EP after NIR irradiation(B)

3 結(jié) 論

利用納米材料的大分子表面積同時修飾光敏劑/熱療試劑/藥物/靶向分子可實現(xiàn)針對腫瘤的協(xié)同療法［27，28］.本文考察了pRGO1—3自身的細胞毒性、光熱轉(zhuǎn)換效率和單線態(tài)氧生成能力，實驗結(jié)果表明，pRGO1—3自身的細胞毒性低，但是在NIR激光照射下，其自身產(chǎn)生的光熱毒性及光毒性具備對細胞的殺傷性.由于pRGO仍具有π共軛體系，可在其表面通過非共價作用修飾具有π共軛結(jié)構(gòu)的適配體等其它分子［29，30］，具備成為被動靶向載體的潛力.綜上所述，pRGO不僅自身低毒、易修飾，且兼具光熱轉(zhuǎn)換能力和一定的光毒效應(yīng)，有望成為新的納米載體，實現(xiàn)對腫瘤細胞PTT/PDT的協(xié)同靶向治療.