喹啉酮-香豆素類Hg2+比色熒光探針的合成及應用

唐 倩，但飛君，郭 濤，蘭海闖

（三峽大學生物與制藥學院,宜昌 443002）

Hg2+被認為是毒性最強的離子之一，它能夠通過食物鏈轉移，在生物體內累積［1~4］.對于人類來說，即使很低濃度的Hg2+也可能會永久破壞腎臟、心臟及神經(jīng)系統(tǒng)［5~8］.鑒于Hg2+的高毒性，中華人民共和國國家標準規(guī)定生活飲用水中Hg2+含量不得高于0.001 mg/L（0.5×10?8mol/L），地表水中Hg2+含量不得高于0.05 mg/L（2.5×10?7mol/L）［9］.因此，探索具有高靈敏度、高選擇性、原位實時以及低成本的Hg2+檢測方法具有重要意義.目前，將原子熒光光譜分析法［10］、電感耦合等離子體質譜法［11］和高效液相色譜法［12，13］等方法用于檢測Hg2+已有研究報道.與這些方法相比，比色法和熒光法具有操作簡便［14］、原位實時監(jiān)測［15］及成本低［16，17］等優(yōu)點，在離子檢測、環(huán)境和生命等領域應用廣泛［18，19］.比色法和熒光法的核心之一是識別離子的探針，已報道的Hg2+探針多是基于單一信號的探針［20，21］，相比之下，利用2個或多個不同波長的信號比值變化的比率型探針自帶內標效應，可以在一定程度上抵消外界干擾因素，提高分析結果的準確度［22，23］.

喹啉酮和香豆素結構類似，其分子結構剛性，具有較大的共軛平面［24］和較好的光學性能［25~27］，其結構中的雜原子與金屬離子作用后［28］，可引起其溶液顏色、吸收和發(fā)射光譜的改變.本文通過縮合反應得到含有喹啉酮和香豆素結構的探針7-二乙氨基-3-［3-（7-二乙氨基）香豆素基-3-氧代丙烯基］喹啉-2-酮（QCO）.該探針分子中的雜原子選擇性地與Hg2+作用后，其最大吸收峰明顯藍移（約120 nm），溶液顏色由紅色變?yōu)辄S色；同時，位于650 nm最大發(fā)射峰的熒光強度顯著降低，溶液由紅色熒光變?yōu)樗{色熒光.通過測定吸收值比（A500/A380）和650 nm發(fā)射強度，探針QCO可以實現(xiàn)對Hg2+快速、準確的比色及熒光雙通道檢測.該方法可用于實際水樣中Hg2+的測定.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

3-二乙氨基乙酰苯胺、4-二乙氨基水楊醛和乙酰乙酸乙酯購于上海安耐吉化學有限公司；固體光氣（BTC）、乙醇（EtOH）、乙酸（AcOH）、1，2-二氯乙烷、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、哌啶（Pip）、甲醇和乙酸乙酯購于國藥集團化學試劑有限公司；所用試劑及溶劑均為分析純；實驗用水為二次蒸餾水.

Bruker AV 400 MHz型核磁共振波譜儀（NMR，瑞士Bruker公司）；Amazon SL-ESI-trap-MS型質譜儀（MS，德國Bruker公司）；WRS-1A型熔點儀（上海索光光電技術有限公司）；F-4600型熒光光譜儀（日本Hitachi公司）；UV-2600型紫外-可見分光光度儀（UV-Vis，日本Shimadzu公司）；Nicolet NEXUS 470型紅外光譜儀（IR，美國Perkin-Elmer公司）.

1.2 實驗過程

探針QCO的合成路線如Scheme 1所示.

Scheme 1 Synthesis of probe QCO

1.2.1 2-氯-7-二乙氨基喹啉-3-甲醛（1）的合成 參照文獻［29］方法合成化合物1，產(chǎn)率74.77%，m.p.98.6~99.1℃（文獻值［29］：98.6~99.1℃），核磁共振譜圖見本文支持信息圖S1和圖S2.

1.2.2 3-甲?；?7-二乙氨基喹啉-2（1H）-酮（2）的合成 向50 mL兩口瓶中加入1.00 g（3.8 mmol）化合物1和10 mL 70%（體積分數(shù)）乙酸水溶液，升溫至80℃攪拌4 h.反應完成后（薄層色譜法監(jiān)測），冷卻至室溫，抽濾，濾餅用甲醇和水重結晶，干燥，得到0.84 g褐色固體2，產(chǎn)率90%，m.p.245.2~246.5℃.1H NMR（400 MHz，CDCl3），δ：12.06（s，1H），10.40（s，1H），8.33（s，1H），7.50（d，J=9.1 Hz，1H），6.69（dd，J=9.1，2.3 Hz，1H），6.51（s，1H），3.53（q，J=7.1 Hz，4H），1.31（t，J=7.1 Hz，6H）；13C NMR（100 MHz，CDCl3），δ：189.19，165.05，152.08，144.08，142.15，132.32，119.05，110.49，94.75，45.14，12.57（核磁共振譜圖見本文支持信息圖S3和圖S4）.

1.2.3 3-乙酰基-7-二乙胺基香豆素（3）的合成 參照文獻［30］方法合成化合物3，產(chǎn)率為90.0%，m.p.156~158℃（文獻值［31］：148~149℃），核磁共振譜圖見本文支持信息圖S5和圖S6）.

1.2.4 探針QCO的合成 向100 mL兩口瓶中依次加入2.60 g（10.0 mmol）化合物2，2.44 g（10.0 mmol）化合物3和50 mL乙醇，再加入1.0 mL乙酸和1.0 mL哌啶，攪拌溶解，回流反應12 h.將反應液冷卻至室溫，抽濾，用甲醇重結晶，干燥，得到QCO紅色固體4.22 g，產(chǎn)率87.0%，m.p.248.1~249.3℃.IR（KBr），ν?/cm?1：3300，1690，1630，1570；1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：11.43（s，1H），8.54（s，1H），8.22（s，1H），8.17（d，J=9.6 Hz，1H），7.71（dd，J=15.6，10.8 Hz，2H），7.51（d，J=9.2 Hz，1H），6.80（d，J=10.0 Hz，1H），6.69（d，J=9.2 Hz，1H），6.61（s，1H），6.48（s，1H），3.50（q，J=6.4 Hz，4H），3.42（q，J=13.2 Hz，4H），1.15（t，J=6.4 Hz，12H）；13C NMR（100 MHz，DMSOd6），δ：186.40，161.88，160.21，158.52，153.17，150.71，148.35，142.28，141.44，139.42，132.58，130.75，123.76，119.66，116.74，110.44，109.42，108.34，96.35，94.20，44.88，44.63，12.95，12.84；ESI-MS（C29H31N3O4理論值），m/z：486.23（486.03）；核磁共振譜圖及質譜圖見本文支持信息圖S7~圖S9.

1.2.5 光譜測量方法 將探針QCO溶于N，N-二甲基甲酰胺中配制成1.0×10?3mol/L的儲備液.將儲備液用甲醇/水（體積比7∶3）稀釋至1.0×10?5mol/L用于光譜測試.實驗中光譜測試均在甲醇/水（體積比7∶3）體系中進行，金屬離子的濃度為1.0×10?4mol/L.不加入待測樣品的溶液即為空白試液.將待測液放置1.0 h后，測定紫外-可見光譜和熒光光譜（激發(fā)波長為500 nm）.

1.2.6 實際樣品的檢測 分別以自來水和江水（取自長江宜昌段，測試前先過濾掉其中的泥沙）作為待測水樣，所取水樣經(jīng)過濾和除雜后，與甲醇以體積比7∶3混合，測定并調整pH后，加入探針QCO及不同量的Hg2+，測定650 nm處的熒光強度.

2 結果與討論

2.1 探針QCO對Hg2+的選擇性識別

Fig.1 UV?Vis spectra and photos(A),fluorescence spectra and photos(B)of probe QCO(1.0×10?5 mol/L)with different metal ions(Na+,K+,Ag+,Ca2+,Ba2+,Mn2+,Co2+,Cu2+,Ni2+,Zn2+,Cd 2+,Hg2+,Pb2+,Fe3+,Al3+and Cr3+,1.0×10?4 mol/L)in MeOH/H2O solution

為了考察探針QCO對金屬離子的識別能力，分別測定空白試液和添加各種金屬離子（Na+，K+，Ag+，Ca2+，Ba2+，Mn2+，Co2+，Cu2+，Ni2+，Zn2+，Cd2+，Hg2+，Pb2+，F(xiàn)e3+，Al3+及Cr3+）后探針QCO溶液的紫外-可見光譜和熒光光譜（圖1）.結果表明，探針QCO的吸收峰位于500 nm處，當加入不同金屬離子后，僅Hg2+使探針QCO在500 nm處的吸收峰消失，在380和450 nm處產(chǎn)生新的吸收峰，且探針QCO溶液由淺粉紅色變?yōu)辄S色［圖1（A）］.同時，探針QCO溶液呈現(xiàn)深粉紅色熒光，最大發(fā)射峰位于650 nm，當加入不同金屬離子后，也只有Hg2+能引起探針QCO溶液發(fā)射光變?yōu)榍嗌?50 nm處的熒光強度明顯減弱［圖1（B）］.可見，探針QCO對Hg2+的檢測具有高選擇性，可裸眼識別.

為了進一步考察在其它金屬離子存在下，探針QCO檢測Hg2+的選擇性識別，嘗試了在相同檢測條件下，其它金屬離子與Hg2+共存時對探針QCO的紫外-可見光譜和熒光光譜的影響.由圖2可見，其它金屬離子與Hg2+共存時，探針QCO的吸收值和熒光強度幾乎不變.表明探針QCO對Hg2+的檢測幾乎不受其它金屬離子的干擾.

Fig.2 Absorbance(A)and fluorescence intensity(B)changes of probe QCO(1.0×10?5 mol/L)upon addition of various metal ions(1.0×10?4 mol/L)in the presence of Hg2+

2.2 探針QCO對Hg2+的定量識別

為了考察Hg2+對探針QCO的紫外-可見吸收光譜和熒光光譜的影響，測定了甲醇/水（體積比7∶3）溶液中含不同濃度的Hg2+時探針QCO的光譜.由紫外-可見吸收光譜［圖3（A）］可見，隨著Hg2+的濃度逐漸增加，探針QCO在500 nm的吸收峰不斷降低，在380和450 nm處的吸收峰不斷增強，且在465 nm處出現(xiàn)1個等吸收點.Hg2+濃度在0~32.5 μmol/L范圍內，探針QCO在500和380 nm處吸收值的比值（y）與Hg2+濃度（x）呈現(xiàn)良好的線性關系（y=?0.2524x+9.1169，R2=0.9904），檢出限（LOD）為2.62×10?8mol/L［圖3（B）］.同時，隨著Hg2+濃度的增加，QCO在650 nm處的熒光強度不斷降低［圖4（A）］，熒光強度與Hg2+濃度（0~40 μmol/L）呈現(xiàn)出良好的線性相關［圖4（B）］，其方程為y=?17.2785x+844.018，R2=0.9914，檢出限為5.42×10?8mol/L.上述結果可知，在一定范圍內，探針QCO可用于Hg2+的比色、熒光定量檢測，且具有高靈敏性，檢出限均低于工業(yè)廢水中Hg2+的最大允許濃度，可用于工業(yè)廢水中Hg2+的檢測.

Fig.3 UV?Vis spectra of probe QCO(1.0×10?5 mol/L)with different concentrations of Hg2+in MeOH/H2O solution(pH=6.5)(A)and the linearity of the absorbance ratio A500/A380 at 500 and 380 nm as a function of Hg2+concentration(B)

Fig.4 Fluorescence spectra of probe QCO(1.0×10?5 mol/L)with different concentrations of Hg2+in MeOH/H2O solution(pH=6.5)(A)and the linearity of the fluorescence intensity vs.concentration of Hg2+(B)

2.3 時間和pH值對探針QCO識別Hg2+的影響

通過隨時間變化的熒光光譜研究了探針QCO和Hg2+之間的反應動力學行為.由圖5可見，向探針QCO溶液中添加Hg2+后，5 min內探針QCO在650 nm處的熒光強度迅速降低，延長至60 min，熒光強度基本保持不變.此現(xiàn)象表明，QCO和Hg2+結合反應迅速且穩(wěn)定，探針QCO可以實時檢測水溶液中Hg2+.進一步考察了pH對探針QCO識別Hg2+的影響（圖6）.在pH=4.5~13.5范圍內，探針QCO的吸收值和熒光強度基本保持穩(wěn)定，表明探針QCO可在較寬的pH范圍內應用.添加Hg2+后，探針QCO的吸收值與熒光強度在pH=6.5~9.5范圍內變化不大.產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是探針QCO有多個質子化位點，在酸性條件下探針質子化，影響了對Hg2+的識別；另外，強堿性條件下Hg2+會產(chǎn)生氧化物沉淀.基于此，推斷探針QCO適合在中性或弱堿性條件下識別Hg2+.

Fig.5 Effect of time on the fluorescence intensity of probe QCO(1.0×10?5 mol/L)to Hg2+(1.0×10?4 mol/L)

Fig.6 Effect of pH on absorbance（A）and fluorescence intensity（B）of probe QCO（1.0×10?5 mol/L）to Hg2+（1.0×10?4 mol/L）

2.4 探針QCO對Hg2+的識別機理

采用Job’s Plot法、質譜和紅外光譜探究了探針QCO對Hg2+的識別機理.為了確定探針QCO與Hg2+絡合的化學計量比，運用Job’s Plot法進行分析測定.由圖7（A）可知，當［Hg2+］/（［Hg2+］+［QCO］）=0.5時，探針QCO在650 nm處的熒光強度達到最大值，表明探針QCO與Hg2+絡合的摩爾比為1∶1.

Fig.7 Job’s plot of the binding between probe QCO and Hg2+(A)and IR spectra of probe QCO,QCO and Hg2+complex in KBr disks(B)

為了進一步確定探針QCO對Hg2+的識別機理，測定了探針了QCO與Hg2+絡合物的質譜，結果見圖8.在探針QCO與Hg2+絡合物的質譜圖中，碎片峰m/z486.73和683.78分別歸屬于［QCO+H］+和［QCO+Hg］+.這表明探針QCO與Hg2+通過絡合作用形成了摩爾比為1∶1的絡合物.

Fig.8 Mass spectra of probe QCO and Hg2+complex

通過探針QCO，QCO與Hg2+絡合物的紅外光譜進一步推測了QCO對Hg2+的識別機理［圖7（B）］.在QCO的紅外光譜中，1690 cm?1處的峰歸屬為香豆素C=O的拉伸振動［32］，1630和1570 cm?1處的峰為喹啉酮中酰胺的吸收峰［33］.QCO與Hg2+絡合物的紅外光譜中進行實驗，香豆素和喹啉酮的C=O吸收峰分別紅移至1700和1640 cm?1處.根據(jù)以上實驗結果，推測了QCO對Hg2+的可能識別機理（見Scheme 2），探針QCO與Hg2+的絡合位點可能是香豆素C=O的O和喹啉酮C=O的O.

Scheme 2 Possible recognition mechanism of probe QCO to Hg2+

2.5 探針QCO對Hg2+的實際檢測

為了研究探針在Hg2+檢測中的實際應用，將含QCO的硅膠板浸入到不同濃度（0，1.0×10?6，1.0×10?5，1.0×10?4，1.0×10?3和1.0×10?2mol/L）的Hg2+溶液中進行實驗.由圖9可見，隨著Hg2+濃度的增加，在自然光下，TLC板的顏色從淺粉紅色變?yōu)辄S色；在365 nm的紫外燈照射下，其顏色從深粉紅色變?yōu)榍嗌?即使當Hg2+濃度為1.0×10?6mol/L時，仍然可以區(qū)分出差異.此結果表明，采用探針QCO可通過裸眼識別痕量的Hg2+.

Fig.9 Photos of the TLC plates coated QCO with various concentrations of Hg2+under the natural light(A)and a 365 nm UV lamp(B)

為了評估探針QCO對Hg2+識別的實際應用價值，采用自來水和江水2種水樣，加入不同濃度的Hg2+，用探針QCO檢測其Hg2+濃度.測試結果如表1所示，不同水樣中Hg2+的回收率在87%~105%之間，RSD小于2%.此結果表明，探針QCO可應用于實際水樣中的Hg2+的檢測.

Table 1 Detection of Hg2+in actual water samples

3 結 論

通過醛酮縮合反應得到新型喹啉酮-香豆素類探針QCO，其合成方法簡單、產(chǎn)率高.探針QCO能以比色法和熒光法識別Hg2+，選擇性好、靈敏度高.尤其是探針QCO在330~600 nm范圍內的吸收光譜顯著藍移（120 nm），其可作為比率型探針裸眼識別Hg2+；探針QCO的發(fā)射波長在520~850 nm范圍內，其可作為近紅外探針應用于實際水樣中Hg2+的檢測.因此，這些優(yōu)異的性能為探針QCO用于環(huán)境中Hg2+的監(jiān)測和生物樣品中Hg2+的檢測提供了重要依據(jù).

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/20210660.