雙氫青蒿素通過調(diào)控TGF-β1/Smad信號通路抑制AngⅡ誘導大鼠心肌纖維化

范紅娟,栗志英,李俊嬌,張素華，蔡安盛,姚曉華，杜相珠

(1.邯鄲市中心醫(yī)院 老年病一科,河北 邯鄲056002；2.河北工程大學附屬醫(yī)院 a心血管內(nèi)一科；b急診科；c呼吸內(nèi)科；3.邯鄲市精神病醫(yī)院；4.邯鄲市第一醫(yī)院 血液科)

慢性心力衰竭是各種心血管疾病的最終階段，其主要病理表現(xiàn)即心肌組織的纖維化改變。正常生理狀態(tài)下，心肌成纖維細胞處于靜止狀態(tài)，當心肌發(fā)生損傷時心肌成纖維細胞即發(fā)揮其修復效應(yīng)，細胞開始增殖、分化、細胞外基質(zhì)分泌，激活的成纖維細胞遷移至受損心肌組織區(qū)域，最終導致心肌纖維化的發(fā)生[1-2]。心肌纖維化主要表現(xiàn)為心肌間質(zhì)中膠原纖維過度蓄積、不同類型的膠原比例失調(diào)、序列混亂等一系列結(jié)構(gòu)性改變，會導致心肌收縮、舒張功能失調(diào)。心肌成纖維細胞是心室重構(gòu)、心肌纖維化的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子，因此限制其增殖、分化對減緩心室重構(gòu)、病理性心肌纖維化具有重要意義[3]。青蒿是抗瘧藥物，隨著研究的開展，目前對于青蒿素的研究已經(jīng)不僅僅局限于治療瘧疾，而是拓展至抗炎、抗腫瘤、抗血管生成、抗真菌、抗纖維化等領(lǐng)域[4]。青蒿素的衍生物包括青蒿琥酯、蒿甲醚、蒿乙醚、雙氫青蒿素，其中雙氫青蒿素是青蒿素在體內(nèi)的主要活性成分，是水溶性半合成產(chǎn)物，具有易吸收、低毒性等特點。近年來，雙氫青蒿素的抗纖維化作用成為研究熱點，且集中在肺纖維化、肝纖維化、腎纖維化等領(lǐng)域，本研究擬對其在心肌纖維化方面的作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取1-3天的SD乳鼠8只，其中雌性6只、雄性2只，共同飼養(yǎng)于恒定濕度、溫度的清潔級實驗動物房內(nèi)。雙氫青蒿素(上海純優(yōu)生生物科技有限公司)、血管緊張素Ⅱ、二甲基亞砜(美國Sigma公司)、Ⅰ型膠原抗體、Ⅲ型膠原抗體(英國Abcam公司)、Smad-3抗體、P-Smad-3抗體(美國CST公司)、胎牛血清(美國Gibco公司)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factor β1,TGF-β1)購自美國Santa Cruz生物科技公司。TGF-β1試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

無菌條件下對乳鼠開胸，快速取出心臟，并立即置于D-Hanks液漂洗3次，使用眼科剪剪成1 mm3的碎塊。D-Hanks液棄去后加濃度為0.1%的胰蛋白酶消化液、混勻，置于37℃培養(yǎng)箱中消化30 min，加入10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，使用吸管輕吹均勻后吸出至離心管中，1 000 r/min離心2 min，棄去下層組織碎片，再1 000 r/min離心10 min、棄上清，加10%胎牛血清的培養(yǎng)基，使用吸管反復輕吹成單細胞懸液，接種至6孔板內(nèi)，置于5%的CO2培養(yǎng)箱37℃環(huán)境下孵育60 min，吸棄貼壁不牢或未貼壁細胞，加入新鮮培養(yǎng)基，置于5%的CO2培養(yǎng)箱37℃環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)，48 h換第一次液，隨后每72 h換液1次，成纖維細胞貼壁速度較快，會先附于瓶底，待成纖維細胞融合度達80%-90%時以0.1%胰蛋白酶消化傳代，將第2-4代生長狀態(tài)良好的細胞留于實驗所用。

1.3 細胞分組

將成纖維細胞分為3組：對照組、雙氫青蒿素組、TGF-β1組，各20份。對照組的細胞加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，雙氫青蒿素組細胞加入雙氫青蒿素5 μmol/L，TGF-β1組細胞加入20 ng/ml的TGF-β1溶液。

1.4 細胞增殖率測算

采用MTT比色法對各組細胞增殖情況進行計算。各組給予對應(yīng)的藥物干預(yù)24 h、48 h、72 h，加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加二甲基亞砜150 μl，振蕩10 min，應(yīng)用酶標儀測定各孔波長在490 nm處的光密度值(OD值)，計算其細胞增殖率。細胞增殖率=OD值/對照組OD值；各組增殖率均計算3次，取均值。

1.5 細胞中mRNA表達及蛋白表達

1.5.1mRNA表達的檢測 總RNA：取對數(shù)生長期心肌成纖維細胞5×104個/ml，接種于6孔板中，在37℃、5%的CO2的飽和濕度下培養(yǎng)24 h，換無血清培養(yǎng)基，并使用1%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)24-48 h，按分組情況給藥，并給予AngⅡ處理24 h，棄去培養(yǎng)液，使用焦碳酸二乙酯生理鹽水洗滌細胞2次，加入裂解液，待細胞完全裂解后加入氯仿0.2 ml，混勻、離心、取上層水相，加異丙醇0.5 ml，混勻、離心，沉淀RNA，再加75%乙醇除鹽，離心、沉淀。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：在總RNA管中加緩沖液、RNA酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶、去離子水，并置于恒溫水浴(42℃)中1 h。PCR反應(yīng)：在0.2 ml薄壁PCR管中加PCR合成緩沖液、上游引物、下游引物、cDNA模板、Taq酶、去離子水，混勻，并在熱循環(huán)儀上進行反應(yīng)；按照95℃孵育5 min-94℃孵育1 min-50℃孵育1 min-72℃孵育1.5 min，共進行30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。取PCR擴增產(chǎn)物、溴乙叮染色，紫外投射反射儀觀察擴增產(chǎn)物，使用凝膠分析系統(tǒng)對擴增條帶進行分析，以平均灰度值作為基因表達量，再除以β-actin的灰度值，即為各擴增產(chǎn)物mRNA的相對表達量。

1.5.2檢測蛋白表達 加入抗體后4℃孵育過夜，PBS洗滌2次，離心、棄上清液，除去非特性結(jié)合的一抗，加入染色液稀釋的二抗，37℃避光孵育45-60 min，使用300目尼龍網(wǎng)過濾，上機檢測，根據(jù)FITC被激發(fā)出的熒光確定蛋白相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS16.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，計數(shù)資料以“例(%)”表示，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用卡方檢驗，以α=0.05為檢測水準。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測細胞增殖活力

從表1可以看出，不同時間點下與對照組相比TGF-β1能夠明顯提高代謝率，TGF-β1組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.96、1.66、12.65，P<0.05)。與TGF-β1組比較，雙氫青蒿素組各時間點的增殖活力均低，組間差異有統(tǒng)計學意義(t=6.32、11.07、6.00，P<0.05)。

表1 MTT法檢測心肌成纖維細胞的增殖活力

2.2 各組TGF-β1的mRNA與蛋白表達

與對照組比較，雙氫青蒿素組與TGF-β1組的TGF-β1 mRNA表達及蛋白水平均升高，組間差異有統(tǒng)計學意義(t=1.79、25.46、40.93、38.46，P<0.05)。雙氫青蒿素組與TGF-β1組比較，TGF-β1 mRNA表達及蛋白水平均低，組間差異有統(tǒng)計學意義(t=23.61、10.00，P<0.05)，見表2。雙氫青蒿素組TGF-β1 mRNA與蛋白表達呈正相關(guān)性(r=0.374，P=0.041)，見圖1。

表2 各組TGF-β1 mRNA及蛋白表達

圖1 雙氫青蒿素組TGF-β1 mRNA與蛋白表達相關(guān)性

2.3 各組Smad2、Smad3蛋白表達

與對照組比較，雙氫青蒿素組與TGF-β1組的Smad2、Smad3蛋白表達均高，組間差異有統(tǒng)計學意義(t=2.17、4.78、1.23、3.14，P<0.05)。雙氫青蒿素組與TGF-β1組比較，Smad2、Smad3蛋白表達均低，組間差異有統(tǒng)計學意義(t=3.69、2.91，P<0.05)，見表3。

表3 各組Smad2、Smad3蛋白表達

3 討論

心肌纖維化是多種心血管疾病病理改變的結(jié)果，心肌病、高血壓、心力衰竭、冠心病與心肌纖維化關(guān)系緊密，心肌纖維化能引起心臟功能、結(jié)構(gòu)改變，是中重度冠狀動脈粥樣硬化性狹窄引起的心肌纖維持續(xù)性和(或)反復加重的心肌缺血缺氧所致，最終可發(fā)展為心力衰竭的慢性缺血性心臟病[5-7]。對心肌纖維化發(fā)展的抑制是防治各種心血管疾病的重要措施。TGF-β由一類功能、結(jié)構(gòu)相關(guān)的多肽生長因子組成，具有多個亞型，在調(diào)節(jié)纖維結(jié)締組織增生、膠原沉積與合成方面都具有重要作用，具有抑制細胞生長、調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的生成和降解作用，是多因素心肌纖維化的共同通路[8-9]。本次研究結(jié)果顯示，雙氫青蒿素能夠降低心肌成纖維細胞活性，且隨著作用時間的延長而抑制作用增強。TGF-β1是一種多功能細胞因子，具有調(diào)節(jié)細胞分化、增殖以及細胞外基質(zhì)產(chǎn)生等作用，與纖維化疾病密切相關(guān)[10]。從本次研究結(jié)果來看，TGF-β1 mRNA與蛋白表達呈正相關(guān)性，與TGF-β1組比較，雙氫青蒿素組對TGF-β1具有明顯的降低作用。

Smads是TGF-β1的重要下游信號分子，TGF-β1與其受體結(jié)合后能夠激活Smads蛋白，調(diào)節(jié)相關(guān)細胞因子表達，在纖維化發(fā)展中具有重要作用。Smads蛋白是心肌纖維化最重要的影響因子，其中Smad2、Smad3在TGF-β刺激下發(fā)生的磷酸化，能夠增強成纖維細胞活力，增加膠原蛋白合成、沉積，在組織重塑和纖維化中發(fā)揮著重要作用[11-13]。TGF-β/Smads通路是促進組織纖維化的重要信號通路，在肝臟、心臟等多種組織中被證實具有調(diào)節(jié)成纖維細胞活力、膠原代謝的作用[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后大鼠的TGF-β/Smads信號通路被抑制，心肌纖維化、心功能等均有改善[16]。還有學者指出，調(diào)節(jié)TGF-β信號通路能夠減弱心肌梗死后心肌纖維化的進程[17]。阿伐他丁、辛伐他丁等藥物通過下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子激活激酶1，減少TGF-β/Smads通路蛋白表達，從而抑制間質(zhì)纖維化及心肌纖維化。多項研究表明，miR-113a、miR-24、miR-1908等均是通過調(diào)整TGF-β/Smads信號通路來改善心肌梗死后的心肌纖維化狀態(tài)[18-19]。從本實驗結(jié)果來看，雙氫青蒿素組的Smad2、Smad3蛋白表達水平均低。

青蒿是復合花序植物黃花蒿莖葉中的提取物，其中的雙氫青蒿素是青蒿素的重要衍生物，具有多種良好的生物學功效。多項研究發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素能夠減少纖維組織增生；應(yīng)用雙氫青蒿素原藥對肝纖維化小鼠進行灌胃后，發(fā)現(xiàn)小鼠肝細胞發(fā)生變形，成纖維細胞增殖降低；在一項肺纖維化實驗中，雙氫青蒿素在抑制肌成纖維細胞增長、膠原纖維合成方面具有積極作用；以上實驗均說明雙氫青蒿素通過抑制成纖維細胞的增殖來干預(yù)臟器的纖維化發(fā)展[20]。綜合本次研究的觀察項來看，雙氫青蒿素對心肌成纖維細胞的TGF-β/Smads信號通路具有明顯的抑制作用。

綜上所述，雙氫青蒿素對心肌成纖維細胞的TGF-β、Smads2、Smad3具有明顯的抑制作用，能夠明顯抑制TGF-β/Smads信號通路的傳導。鑒于TGF-β/Smads信號通路與其他信號通路存在交叉，在下一步研究中將進一步探討雙氫青蒿素對心肌成纖維細胞多通路的作用機制，為臨床合理應(yīng)用提供參考。