農(nóng)桿菌介導(dǎo)的香榧幼胚遺傳轉(zhuǎn)化體系

周佳君，胡恒康，龔 麗，干安格，喻衛(wèi)武，吳家勝，黃堅(jiān)欽，張啟香

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 311300；2. 浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300）

香榧Torreya grandis ‘Merrillii’ 隸屬于紅豆杉科Taxaceae榧樹屬Torreya常綠喬木，是中國特有的珍稀堅(jiān)果植物，具有重要的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)價(jià)值[1]。由于香榧生物學(xué)周期長，性狀易受環(huán)境等因子影響，限制了其育種工作的開展。目前，有關(guān)香榧體胚誘導(dǎo)、增殖和離體器官培養(yǎng)再生植株的研究已有一定進(jìn)展，但關(guān)于利用基因工程改良香榧育種的研究尚未見報(bào)道[2]?；蚬こ淌巧锛夹g(shù)的核心，利用基因工程進(jìn)行林木遺傳改良，以提高作物產(chǎn)量、改善品質(zhì)、增強(qiáng)抗性是林木分子育種的最有效途徑之一[3]。1986年，研究人員通過農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens介導(dǎo)法在楊樹Populus trichocarpa×deltoides中成功開展遺傳轉(zhuǎn)化，開創(chuàng)了林木遺傳轉(zhuǎn)化研究的先河[4]。目前，林木基因轉(zhuǎn)化方法已達(dá)10余種，其中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法因具有操作簡(jiǎn)單、拷貝數(shù)低、轉(zhuǎn)化效率高、重復(fù)性好、發(fā)生基因沉默率低等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[5]。隨著木本植物遺傳轉(zhuǎn)化研究的不斷發(fā)展，蘋果Malus pumila等重要果樹農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系也相繼建立，為經(jīng)濟(jì)林果樹種定向育種提供了高效的方法和手段。1989年，率先成功實(shí)現(xiàn)蘋果轉(zhuǎn)基因[6]，包括早花、矮化、抗病等基因的轉(zhuǎn)化，且有多個(gè)品種已成功獲得轉(zhuǎn)基因植株。1996年，梨Pyrus communis的遺傳轉(zhuǎn)化首見報(bào)道[7]。目前，在豆梨P. calleryanana和砂梨P. pyrifolia等均有報(bào)道。此外，櫻桃Prunus cerasus、李P. salicina等其他水果也實(shí)現(xiàn)了遺傳轉(zhuǎn)化。然而，果樹的遺傳轉(zhuǎn)化研究大多數(shù)集中于水果，對(duì)于堅(jiān)果樹種遺傳轉(zhuǎn)化的研究尚處于起步階段[8]。堅(jiān)果為包裹著堅(jiān)硬外殼的植物種子統(tǒng)稱[9]。堅(jiān)果類食品富含不飽和脂肪酸，具有較好的抗氧化和抗衰老活性，對(duì)心腦血管等疾病具有良好的預(yù)防作用[10]。堅(jiān)果分為樹堅(jiān)果和籽堅(jiān)果。樹堅(jiān)果是指具有堅(jiān)硬外殼的木本植物的籽粒，包括核桃Juglans regia、巴旦木Amygdalus communis、榛子Corylus heteropylla、山核桃Carya cathayensis、香榧等。堅(jiān)果樹種多數(shù)為多年生木本植物，組織細(xì)胞中含有大量的酚類化合物和單寧等物質(zhì)，導(dǎo)致采用基因工程技術(shù)進(jìn)行種質(zhì)資源創(chuàng)新難度較大[11]。目前，樹堅(jiān)果中核桃的基因工程技術(shù)研究進(jìn)展最為深入。自從MCGRANAHAN等[12]1988年成功開展了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的核桃遺傳轉(zhuǎn)化以來，科學(xué)家已對(duì)多個(gè)核桃樹種進(jìn)行了基因組測(cè)序[13?14]，構(gòu)建了良好的遺傳轉(zhuǎn)化體系[15]，并對(duì)多個(gè)重要基因開展了功能驗(yàn)證，獲得了多份創(chuàng)新種質(zhì)資源，開創(chuàng)了果樹基因工程的新局面[16]。香榧作為一種重要的樹堅(jiān)果，基因工程研究進(jìn)展緩慢，遺傳轉(zhuǎn)化體系尚不成熟，限制了香榧種質(zhì)創(chuàng)新和產(chǎn)業(yè)發(fā)展。本研究以香榧幼胚為轉(zhuǎn)基因受體材料，從幼胚胚齡的選擇、農(nóng)桿菌侵染濃度和時(shí)間、羧芐青霉素質(zhì)量濃度以及陽性篩選時(shí)潮霉素質(zhì)量濃度對(duì)香榧遺傳轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行探索和優(yōu)化，利用綠色熒光蛋白(GFP)信號(hào)檢測(cè)分析轉(zhuǎn)化效率，并通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)進(jìn)行陽性鑒定，以期初步建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的香榧遺傳轉(zhuǎn)化體系，為香榧重要基因功能驗(yàn)證及種質(zhì)創(chuàng)新提供重要技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 于 2018年 7月 5—26日 (種子突破種鱗后第 8～11周，以下簡(jiǎn)稱第 8～11周)采集生長健壯的香榧種子，經(jīng)消毒后，用無菌修枝剪從種子榧眼端(珠孔端)縱向剪開，剝?nèi)⊥暾着?圖1A～D)待用。具體消毒步驟參照龔麗等[17]的方法。

圖1 香榧種子及幼胚發(fā)育表型動(dòng)態(tài)Figure 1 Characters of seeds and immature embryos of T. grandis ‘Merrillii’

1.1.2 載體及農(nóng)桿菌菌株 采用攜帶 GFP 報(bào)告基因的 pCAMBIA1300-GFP載體，內(nèi)含卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因[18]；農(nóng)桿菌菌株GV3101。

1.2 方法

1.2.1 農(nóng) 桿 菌 介 導(dǎo) 香 榧 幼 胚 遺 傳 轉(zhuǎn) 化 ① 農(nóng) 桿 菌 的 活 化 與 培 養(yǎng) 。 將 ?80 ℃ 冰 箱 中 保 存 的 攜帶pCAMBIA1300-GFP載體的GV3101農(nóng)桿菌菌株接種至含有50 mg·L?1卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱活化培養(yǎng)2 d。挑取若干單菌落分別放置于盛有附加50 mg·L?1卡那霉素和50 mg·L?1利福平的LB液體培養(yǎng)基的無菌離心管中，28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，至菌液混濁。②侵染液的制備。取上述適量菌液稀釋10倍，分光光度計(jì)下測(cè)定吸光度[D(600)]。侵染液制備所需菌液體積按照如下公式計(jì)算：所需菌液量(mL)=[所需侵染量(mL)×所需菌液D(600)]/[實(shí)測(cè)D(600)×10]。計(jì)算得出所需菌液體積后，在超凈工作臺(tái)上用移液槍吸取所需菌液至無菌帶蓋離心管中6 000 r·min?1轉(zhuǎn)速下離心10 min，棄上清液，加入 2 mL 含有 0.1 mg·L?1萘乙酸和 40.0 mg·L?1乙酰丁香酮的 1/2 SH 液體共培養(yǎng)基，吸打混勻成懸浮液后，再加液體共培養(yǎng)基至所需菌液侵染量，將離心管放回至28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h，待用。

1.2.2 香榧幼胚遺傳轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化 ①香榧幼胚最佳胚齡篩選。采用第8～11周的香榧幼胚，用農(nóng)桿菌侵染[D(600)為0.5]，并添加乙酰丁香酮共培養(yǎng)后接種至農(nóng)桿菌脫菌培養(yǎng)基(1/2 SH+0.1 mg·L?1萘乙酸+2.0 g·L?1活性炭+30.0 g·L?1蔗糖+200.0 mg·L?1羧芐青霉素+12.0 g·L?1瓊脂)培養(yǎng) 4周，分別統(tǒng)計(jì)篩選過程中香榧幼胚的污染率、成活率、愈傷組織誘導(dǎo)率以及體細(xì)胞胚(簡(jiǎn)稱體胚)發(fā)生率。每個(gè)處理重復(fù)3次，每次處理30個(gè)幼胚。②最佳農(nóng)桿菌侵染吸光度篩選。將農(nóng)桿菌菌液吸光度設(shè)置為4個(gè)水平[D(600)為0.3、0.5、0.8、1.0]，對(duì)香榧幼胚侵染15 min，乙酰丁香酮共培養(yǎng)3 d后接種至脫菌培養(yǎng)基(同①)培養(yǎng)4周，統(tǒng)計(jì)幼胚污染率、成活率、愈傷組織誘導(dǎo)率和體胚發(fā)生率，確定適宜轉(zhuǎn)化用的菌液濃度。每個(gè)處理重復(fù)3次，每次處理30個(gè)幼胚。③最佳農(nóng)桿菌侵染時(shí)間篩選。采用 D(600)為0.5的農(nóng)桿菌菌液對(duì)幼胚分別侵染5、10、15、20、30 min，共培養(yǎng)3 d后轉(zhuǎn)接至脫菌培養(yǎng)基(同①)培養(yǎng)4周，統(tǒng)計(jì)污染率、成活率、愈傷組織誘導(dǎo)率以及體胚發(fā)生率，以確定適宜轉(zhuǎn)化用的菌液濃度。每個(gè)處理重復(fù)3次，每次處理30個(gè)幼胚。④最佳羧卞青霉素質(zhì)量濃度篩選。將共培養(yǎng)后的香榧幼胚接種在含有 0.1 mg·L?1萘乙酸和不同質(zhì)量濃度羧卞青霉素(100、200、300、400 mg·L?1)的1/2 SH固體培養(yǎng)基中進(jìn)行抗生素質(zhì)量濃度篩選。每個(gè)處理重復(fù)3次，3 d繼代培養(yǎng)1次，4周后統(tǒng)計(jì)污染率、成活率、愈傷組織誘導(dǎo)率以及體胚發(fā)生率，以確定適宜的羧芐青霉素質(zhì)量濃度。

1.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)香榧幼胚遺傳轉(zhuǎn)化和抗性篩選 選取生長良好的香榧幼胚在最佳濃度農(nóng)桿菌侵染液中，懸浮培養(yǎng)最佳侵染時(shí)間后，將幼胚轉(zhuǎn)接至附加萘乙酸(0.1 mg·L?1)和乙酰丁香酮(40 mg·L?1)的1/2 SH固體培養(yǎng)基中共培養(yǎng)3 d后，再轉(zhuǎn)接至脫菌培養(yǎng)基(1.2.2節(jié)④篩選出的最佳培養(yǎng)基)中培養(yǎng)至無菌。具體步驟參照ZHANG等[8]的方法。將脫菌后的香榧幼胚接種至附加0.1 mg·L?1萘乙酸和質(zhì)量濃度分別為 50、80、100、200 mg·L?1潮霉素的 1/2 SH 固體培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選培養(yǎng)，2周后轉(zhuǎn)接至附加 0.1 mg·L?1萘乙酸和100 mg·L?1潮霉素的1/2 SH固體培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選培養(yǎng)，隔2 d轉(zhuǎn)接1次至完全脫菌并獲得潮霉素抗性幼胚。

1.2.4 綠色熒光蛋白基因GFP 熒光信號(hào)陽性檢測(cè)和PCR鑒定 將經(jīng)潮霉素篩選的抗性幼胚置于體式顯微鏡(SteREO Discovery V1)下進(jìn)行450～490 nm藍(lán)光激發(fā)，表面能觀察到明亮綠色熒光的幼胚為GFP熒光信號(hào)陽性幼胚。選取潮霉素基因和GFP綠色熒光鑒定均為陽性的幼胚培養(yǎng)材料，利用TPS法提取DNA。利用 GFP 基因引物 (GFP-F: 5′-GACGCACAATCCCACTATCCTT-3′, GFP-R: 5′-AACCGATGATAC GAACGAAAGC-3′)，以上述提取的DNA為模板進(jìn)行GFP基因的PCR擴(kuò)增[PCR程序?yàn)椋?4 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s；68 ℃ 45 s (32個(gè)循環(huán))；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存 ]，目的片段大小為 750 bp。PCR 程序結(jié)束后，10 g·kg?1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶符合預(yù)期大小的確定為轉(zhuǎn)化成功的香榧幼胚培養(yǎng)物。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與圖像處理

受體材料污染率、成活率及GFP陽性率等數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中包括平均值和方差分析。計(jì)算公式如下：污染率=污染幼胚數(shù)/侵染總體胚數(shù)×100%；成活率=成活幼胚數(shù)/侵染總體胚數(shù)×100%； GFP陽性率=GFP陽性幼胚數(shù)/成活幼胚數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 香榧幼胚遺傳轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

2.1.1 香榧幼胚胚齡對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響 本研究采用處于第8～11周的香榧幼胚為材料進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化(圖1E～H)。第8～11周分別為胚胎選擇初期、胚胎選擇中期、胚胎選擇晚期和優(yōu)勢(shì)胚完全發(fā)育期。結(jié)果表明(表1)：4個(gè)胚齡的幼胚轉(zhuǎn)化過程中污染率和成活率均存在顯著差異(P＜0.05)。隨著香榧幼胚齡的增加，抗逆性增強(qiáng)，污染率降低，成活率提高。第10周和第11周成活率分別為52.1%和52.3%。香榧幼胚胚性感受態(tài)具有較大差異，第10周時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率下降為17.9%，但體胚發(fā)生率最高，達(dá)17.3%；第11周時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率和體胚發(fā)生率均下降，分別為10.7%和5.6%。盡管香榧第8～11周幼胚均可用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，但綜合污染率、成活率、愈傷組織誘導(dǎo)率和體胚發(fā)生率均表明采用第10周香榧幼胚進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化效果最佳。

表1 香榧幼胚胚齡對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響Table 1 Different growth stages of embryos on the transformation efficiency in T. grandis ‘Merrillii’

2.1.2 農(nóng)桿菌菌液吸光度對(duì)香榧幼胚遺傳轉(zhuǎn)化的影響 表2表明：隨著菌液D(600)的升高，污染率逐漸上升，成活率逐漸下降。過高的污染率會(huì)增加大量的前期采樣、滅菌、侵染、共培養(yǎng)及后期脫菌培養(yǎng)的工作量。當(dāng)菌液D(600)=0.3時(shí)，污染率最低，成活率最高，但愈傷組織誘導(dǎo)率和體胚發(fā)生率都比D(600)=0.5時(shí)低。隨著D(600)的升高，愈傷組織誘導(dǎo)率和體胚發(fā)生率先上升后下降。當(dāng)D(600)=0.5時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率和體胚發(fā)生率最高，分別為17.9%和17.3%。因此，綜合考慮，D(600)=0.5時(shí)是最佳侵染濃度(表2)。

表2 農(nóng)桿菌菌液濃度對(duì)香榧幼胚遺傳轉(zhuǎn)化的影響Table 2 Different concentrations of bacteria on the impact of transformation in T. grandis ‘Merrillii’

2.1.3 農(nóng)桿菌菌液侵染時(shí)間對(duì)香榧幼胚轉(zhuǎn)化的影響 表3表明：隨著侵染時(shí)間的延長，污染率逐漸升高，成活率逐漸下降，侵染5 min時(shí)，污染率最低，成活率最高；當(dāng)侵染30 min時(shí)，污染率最高，達(dá)100%。不同侵染時(shí)間下，各處理間愈傷組織誘導(dǎo)率和體胚發(fā)生率均存在顯著差異(P＜0.05)，侵染10 min時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率和體胚發(fā)生率均為最高，分別達(dá)17.5%和17.1%；侵染20～30 min時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率和體胚發(fā)生率均下降至0。綜合以上指標(biāo)，選擇10 min為最佳侵染時(shí)間。

表3 農(nóng)桿菌菌液不同侵染時(shí)間對(duì)香榧幼胚遺傳轉(zhuǎn)化的影響Table 3 Effect of different infection times on transformation in T.grandis ‘Merrillii’

2.1.4 羧芐青霉素質(zhì)量濃度對(duì)香榧幼胚攜帶農(nóng)桿菌抑制的影響 本研究選用的農(nóng)桿菌種類為堿型GV3101菌株，因此，在前期研究的基礎(chǔ)上，選用羧芐青霉素為農(nóng)桿菌脫菌抗生素。表4表明：香榧幼胚成活率隨著羧芐青霉素質(zhì)量濃度的升高先上升后下降，當(dāng)羧芐青霉素質(zhì)量濃度為300 mg·L?1時(shí)成活率最高，為60.5%。隨著羧芐青霉素質(zhì)量濃度的升高，愈傷組織誘導(dǎo)率和體胚發(fā)生率均呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)質(zhì)量濃度為300 mg·L?1時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率和體胚發(fā)生率最高，分別為15.8%和17.5%。因此，最佳羧芐青霉素質(zhì)量濃度為 300 mg·L?1。

表4 羧芐青霉素質(zhì)量濃度對(duì)香榧幼胚農(nóng)桿菌脫除的影響Table 4 Effects of carboxypenicillin concentration on the removal of Agrobacterium tumebii from T. grandis ‘Merrillii’ embryos

2.2 香榧陽性幼胚鑒定

2.2.1 香榧陽性幼胚培養(yǎng)物潮霉素鑒定 表5表明：隨著潮霉素質(zhì)量濃度的升高，幼胚成活率逐漸下降，當(dāng)潮霉素質(zhì)量濃度為50 mg·L?1時(shí)，成活率最高，為62.1%；當(dāng)潮霉素質(zhì)量濃度升高至100 mg·L?1時(shí)，成活率下降至30.5%，但當(dāng)潮霉素質(zhì)量濃度繼續(xù)升高至 200 mg·L?1，香榧幼胚培養(yǎng)物的成活率基本不變。當(dāng)潮霉素質(zhì)量濃度為 50～100 mg·L?1時(shí)，各處理間愈傷組織誘導(dǎo)率和體胚發(fā)生率無顯著性差異；當(dāng)潮霉素質(zhì)量濃度升高至200 mg·L-1時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率和體胚發(fā)生率均顯著下降(P＜0.05)。因此， 100 mg·L?1為篩選抗性幼胚培養(yǎng)物的潮霉素最佳質(zhì)量濃度。

表5 潮霉素質(zhì)量濃度對(duì)香榧幼胚培養(yǎng)物潮霉素陽性篩選的影響Table 5 Effect of hygromycin concentration on positive screening of T.grandis ‘Merrillii’ embryo culture

2.2.2 香榧遺傳轉(zhuǎn)化幼胚GFP熒光表達(dá) 將通過篩選的潮霉素抗性幼胚置于體式顯微鏡下進(jìn)行藍(lán)光激發(fā)(490 nm)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：潮霉素抗性幼胚培養(yǎng)物中，白光視野下，胚胎選擇期(第8～10周)幼胚培養(yǎng)物呈現(xiàn)乳白色至淡黃色，藍(lán)光視野下呈現(xiàn)明亮的綠色熒光，各胚齡間GFP熒光陽性率無顯著性差異，為75.5%～78.3%；優(yōu)勢(shì)胚完全發(fā)育期(第11周)GFP熒光陽性率較低，為53.0%，且幼胚不同部位的熒光表達(dá)量不一致，其中相對(duì)成熟的部位熒光表達(dá)量較低，生長旺盛單位熒光表達(dá)量較高，呈現(xiàn)明亮的綠色；對(duì)照幼胚培養(yǎng)物在白光下呈現(xiàn)乳白色至淡黃色，藍(lán)光視野中無熒光激發(fā)，呈現(xiàn)黑色(圖2)。

圖2 綠色熒光蛋白在香榧潮霉素抗性幼胚培養(yǎng)物中表達(dá)Figure 2 Green fluorescent protein GFP gene expressed stably in T. grandis ‘Merrillii’

2.2.3 香榧陽性幼胚 GFP 基 因鑒定 為進(jìn)一步排除GFP綠色熒光假陽性，本研究選取具有潮霉素抗性且GFP強(qiáng)熒光信號(hào)表達(dá)的香榧幼胚培養(yǎng)物提取DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以同時(shí)接種未轉(zhuǎn)化的幼胚為對(duì)照。香榧GFP熒光陽性幼胚培養(yǎng)物提取DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)結(jié)果表明(圖3)：75%的攜帶潮霉素抗性且GFP熒光陽性香榧幼胚培養(yǎng)物可擴(kuò)增出目的條帶，長度約750 bp，符合預(yù)期大小(泳道3～8)，而對(duì)照幼胚培養(yǎng)物相應(yīng)無條帶(泳道1～2)，表明GFP基因已成功轉(zhuǎn)入香榧幼胚。

圖3 香榧培養(yǎng)物 DNA 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Figure 3 PCR amplification products of transgenic somatic and control somatic embryos DNA in T. grandis ‘Merrillii’

3 討論

3.1 受體材料對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的影響

在木本植物遺傳轉(zhuǎn)化中，常用的受體材料一般有花序、葉片、體細(xì)胞胚、胚性愈傷組織、合子胚、下胚軸、原生質(zhì)體、莖尖及花粉等[19]。目前，林木遺傳轉(zhuǎn)化研究多以胚性愈傷組織、合子胚和體細(xì)胞胚為受體材料[20]。

有研究表明：同一外植體的不同部位對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率也不同[21]，胡楊Populus euphratica在遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)使用葉片的轉(zhuǎn)化率高達(dá)80%，而莖段轉(zhuǎn)化率只有20%[22]。受體材料的生長發(fā)育階段對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化效率具有重要影響[23]。處于旺盛分裂期的林木細(xì)胞或組織是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化成功的基礎(chǔ)。一般來說，發(fā)育早期的組織細(xì)胞分裂能力較強(qiáng)[24]。方宏筠等[25]在研究黑核桃Juglans nigra體胚遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)發(fā)現(xiàn)：球形胚、魚雷胚等有較高的轉(zhuǎn)化效率，而發(fā)育晚期的子葉胚很難誘導(dǎo)出抗性體細(xì)胞胚狀體，這可能與其分裂能力低有關(guān)。DAI等[26]選用葡萄Vitis vinifera胚胎發(fā)育過程中的3個(gè)階段(胚性愈傷組織、原胚團(tuán)、體胚)為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料，結(jié)果顯示：僅原胚團(tuán)樣品得到了32個(gè)轉(zhuǎn)基因株系。選擇幼胚作為外植體，易產(chǎn)生胚性愈傷組織，且分化和再生能力較強(qiáng)，縮短了再生所需時(shí)間，提高了遺傳轉(zhuǎn)化效率[27]。香榧胚性愈傷組織結(jié)構(gòu)特殊，胚性細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)疏松脆弱，在農(nóng)桿菌侵染過程中極易受到不可逆的損害，大大影響了后續(xù)發(fā)育的活力。因此，本研究以種子突破種鱗后第8～11周的香榧幼胚為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化受體材料，發(fā)現(xiàn)處于胚胎選擇期的香榧幼胚遺傳轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)，GFP熒光陽性率高于優(yōu)勢(shì)胚完全發(fā)育期，與該時(shí)期幼胚具有較強(qiáng)的胚性感受態(tài)有關(guān)[17]。

3.2 轉(zhuǎn)化條件對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的影響

菌液侵染是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的第1步，涉及諸多影響因子，包括農(nóng)桿菌菌液濃度、侵染時(shí)間等。一般來講，菌液濃度過高，脫菌時(shí)抗生素不能抑制農(nóng)桿菌生長，而且易使外植體產(chǎn)生過敏反應(yīng)；當(dāng)菌液濃度較低時(shí)，外植體表面的菌液不足以侵染植物組織細(xì)胞[28]。劉曉晨[15]在研究核桃體胚轉(zhuǎn)化條件時(shí)發(fā)現(xiàn)：在侵染時(shí)間相同情況下，陽性率隨著侵染液濃度提高呈上升趨勢(shì)，但污染率也隨之提高；仝鑄等[29]在建立檸檬Citrus limon遺傳轉(zhuǎn)化體系時(shí)發(fā)現(xiàn)：菌液D(600)為0.6時(shí)胚軸再生率達(dá)到最高，D(600)高于0.6胚軸再生率隨之下降。因此，選擇合適的菌液吸光度是高效轉(zhuǎn)化體系的關(guān)鍵。本研究中，農(nóng)桿菌D(600)為0.5時(shí)香榧幼胚轉(zhuǎn)化效率最高。

農(nóng)桿菌侵染時(shí)間的長短也因植物材料不同而異，適宜的時(shí)間可以確保農(nóng)桿菌對(duì)植物細(xì)胞充分穩(wěn)定的吸附，時(shí)間過短不能完成農(nóng)桿菌有效侵染，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率過低甚至轉(zhuǎn)化失敗，而過長的侵染時(shí)間容易導(dǎo)致材料過度污染甚至死亡。杜麗等[30]研究樟樹Cinnamomum camphora胚性愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)化效率在侵染時(shí)間超過40 min后呈下降趨勢(shì)。糜瑤琦[31]在研究美國山核桃Carya illinoinensis遺傳轉(zhuǎn)化條件時(shí)發(fā)現(xiàn)：侵染15 min時(shí)β-葡萄糖苷酸酶(GUS)表達(dá)率最高，達(dá)61.52%，超過15 min后呈下降趨勢(shì)。在本研究的香榧幼胚轉(zhuǎn)化中，最佳侵染時(shí)間為10 min，且不同農(nóng)桿菌菌液吸光度和侵染時(shí)間處理下，污染率、成活率、愈傷組織誘導(dǎo)率以及體胚發(fā)生率均具顯著性差異。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的另一個(gè)重要環(huán)節(jié)為脫菌培養(yǎng)。篩選出適合的抑菌抗生素對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化至關(guān)重要[32]。林木遺傳轉(zhuǎn)化中常用的抑菌劑有頭孢霉素和羧芐青霉素等[33]。黃建[34]研究棗Ziziphus jujuba遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)發(fā)現(xiàn)，低濃度的羧芐青霉素促進(jìn)葉片外植體形成愈傷組織，而濃度過高有抑制作用。MONDAL等[35]在研究茶Camellia sinensis遺傳轉(zhuǎn)化中發(fā)現(xiàn)：頭孢霉素和羧芐青霉素協(xié)同使用，可有效抑制農(nóng)桿菌的活性。堅(jiān)果樹種對(duì)農(nóng)桿菌脫菌抗生素非常敏感，在加有抗生素壓力的抑菌培養(yǎng)基上生長能力較差。優(yōu)化核桃體胚遺傳轉(zhuǎn)化條件時(shí)，使用250 mg·L?1羧芐青霉素時(shí)體胚轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)28.0%，隨后體胚轉(zhuǎn)化率逐漸下降[36]。在本次香榧幼胚的轉(zhuǎn)化中，300 mg·L?1羧芐青霉素為最佳脫菌質(zhì)量濃度。

目前，堅(jiān)果類樹種的遺傳轉(zhuǎn)化仍存在較多問題需要進(jìn)一步探究和解決。堅(jiān)果樹種轉(zhuǎn)化方法單一是限制其遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的一個(gè)重要因素[19]。此外，堅(jiān)果類樹種體胚再生頻率低、重復(fù)性差的自身特性是影響轉(zhuǎn)化效率的主要原因，甚至有些堅(jiān)果樹種難以建立再生體系，致使轉(zhuǎn)化無法進(jìn)行。這一特性是導(dǎo)致堅(jiān)果類樹種遺傳轉(zhuǎn)化研究和應(yīng)用滯后的主要原因[37]。本研究在受體材料選擇、農(nóng)桿菌侵染時(shí)間、侵染濃度、抗生素質(zhì)量濃度等方面進(jìn)行了初步研究，成功獲得了香榧轉(zhuǎn)化幼胚培養(yǎng)物。研究結(jié)果可為香榧重要基因遺傳轉(zhuǎn)化和功能驗(yàn)證打下良好基礎(chǔ)，同時(shí)也為香榧種質(zhì)創(chuàng)新提供重要技術(shù)平臺(tái)。