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    黑柿葉中單寧提取工藝研究

    2022-03-01 02:45程洪斌竇思遠(yuǎn)李泯錕
    現(xiàn)代園藝 2022年3期
    關(guān)鍵詞:單寧葡萄球菌乙醇

    宋 超,程洪斌,竇思遠(yuǎn),李泯錕,王 耘*

    (金陵科技學(xué)院園藝園林學(xué)院,江蘇南京 210038)

    柿子在我國有著悠久的歷史,種植面積和產(chǎn)量位居世界之首。柿果實(shí)營養(yǎng)豐富,含有多種抗氧化功能性成分[1],其中單寧是柿功能性成分中最具關(guān)注的一種,它賦予柿子特有的澀感,多羥基酚類的結(jié)構(gòu)決定了它還有吸收紫外線、清除自由基、防腐和美白保濕等諸多優(yōu)良特性。目前柿單寧提取多以果實(shí)為原料,柿葉利用較少,而研究發(fā)現(xiàn),柿葉中也富含多酚類、黃酮類、萜類、鞣質(zhì)等多種功能性成分[2],以柿葉為原料提取柿單寧,可以減少果實(shí)資源的浪費(fèi)。

    單寧的提取方法多種多樣,例如水提取法、有機(jī)溶劑-水提取法、儀器輔助提取法等,目前常采用超聲波輔助法提取單寧[3-4]。如余先純等[5]采用該方法以70%的丙酮溶液為溶劑提取野柿葉中的單寧,曾鑫海等[6]用此法以及鄰二氮菲分光光度法來提取橄欖中的單寧,王秋亞[7]用50%乙醇提取苦菜中的單寧,從提取溫度、提取時間、料液比等方面考察對單寧提取量的影響。黑柿是黑色柿品種[8],前期的研究發(fā)現(xiàn),黑柿葉中單寧含量相比較紅柿葉中多,因此,黑柿葉可以作為一種較好的提取單寧的新資源。關(guān)于黑柿葉單寧提取方法和抑菌活性相關(guān)的報(bào)道極少[9],本試驗(yàn)在前人研究基礎(chǔ)上,通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn),研究了超聲輔助提取黑柿葉中單寧的最佳工藝,并對黑柿葉中的單寧抑菌性進(jìn)行了研究,該結(jié)果為黑柿葉資源開發(fā)利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 柿葉的制備

    試驗(yàn)當(dāng)天在金陵科技學(xué)院園藝站進(jìn)行黑柿葉片采樣,將樣品在95℃條件下烘干(至恒重),研磨后過40目篩,粉末密封保存置于干燥器中,留待后續(xù)試驗(yàn)使用。

    1.2 黑柿葉中單寧的提取及測定方法

    參照韓衛(wèi)娟等[10]及于曉銳等[11]對單寧的提取方法,用電子天平精密稱取0.2g黑柿葉粉,優(yōu)化提取液乙醇的體積分?jǐn)?shù),優(yōu)化不同料液比,在固定溫度下超聲提取,過濾,收集濾液,定容至25mL。

    通過牛廣財(cái)?shù)萚11]使用的福林-酚比色法測定(略作修改),其中飽和碳酸鈉溶液作為提供穩(wěn)定的堿性環(huán)境的溶液,靜置顯色反應(yīng)時間改為2h。標(biāo)準(zhǔn)品為沒食子酸,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)一步測定樣品。

    公式中:x是利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得到的濃度,mg/mL;V為定容容量,mL;m是樣品質(zhì)量,g;N為稀釋倍數(shù)。

    1.3 超聲提取黑柿葉中單寧的單因素試驗(yàn)

    1.3.1 不同料液比對提取效果的影響。在60%乙醇、溫度60℃、超聲頻率為100W條件下,分別以1︰20、1︰30、1︰40、1︰50和1︰60(g︰mL)5個料液比進(jìn)行試驗(yàn),提取40min,觀察不同料液比對提取單寧的影響。

    1.3.2 乙醇濃度對提取效果的影響。利用弱酸性醇-水體系能夠更好地溶出樣品中的縮合單寧[13]。在料液比1︰40(g︰mL)、溫度60℃、超聲頻率為100W的條件下,選擇40%、50%、60%、70%和80%5個梯度的乙醇濃度進(jìn)行試驗(yàn),提取40min,探索乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取效果的影響。

    1.3.3 不同溫度對提取效果的影響。在料液比1︰40(g︰mL)、60%的乙醇溶液、超聲頻率為100W的條件下,選取提取溫度分別為40、50、60、70和80℃,提取40min,分析單寧提取效果。

    1.3.4 比較不同時間對提取效果的影響。在料液比1︰40(g︰mL)、60%的乙醇溶液、超聲頻率為100W、溫度為50℃條件下,選取成梯度提取時間進(jìn)行試驗(yàn),時間分別為10、20、30、40和50min,分析單寧提取效果。

    1.4 正交試驗(yàn)

    根據(jù)對上述單因素試驗(yàn)的結(jié)果分析后選出了4個因素中較好的水平進(jìn)行正交試驗(yàn),確定最佳提取因素和水平(表1)。

    表1 黑柿葉單寧提取的正交試驗(yàn)因素水平

    1.5 對細(xì)菌生長的影響

    挑取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌,活化2代后,37℃過夜培養(yǎng),作為測試菌菌液。取測試菌液50μL接種于25mL培養(yǎng)液中,以提取單寧用無菌水配制成濃度為2.5%、1.25%和0.625%的溶液,在培養(yǎng)液中各添加2.5mL單寧溶液,無菌水為空白,每隔2h取樣測定600nm下的吸光值,每組做3個平行。

    1.6 統(tǒng)計(jì)與分析

    采用SPSS10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)處理及制圖利用Excel2019進(jìn)行。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線

    以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1),沒食子酸濃度在0~0.10mg/mL范圍內(nèi),呈現(xiàn)出較良好的線性關(guān)系,此范圍內(nèi)的線性回歸方程為y=15.235x+0.0617,R2=0.9983。

    圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

    2.2 單因素結(jié)果分析

    2.2.1 不同料液比的影響。伴隨料液比的逐漸增加,提取量大致呈現(xiàn)出先上升后緩慢下降的趨勢,1︰50時的提取量比1︰40時稍高,但是1︰40時,單寧在溶劑中的溶解基本達(dá)到飽和,考慮到提取效果和成本的影響及后續(xù)濃縮的時間和能耗,可考慮低料液比。

    圖2 料液比對單寧提取的影響

    2.2.2 不同乙醇濃度的影響。單寧的提取量隨乙醇濃度增加先升高再下降,主要原因是低濃度時隨著乙醇濃度升高,單寧與另外一些物質(zhì)的鍵合被打開,從而游離出來,但是高濃度時,水分的減少使得溶液通透性下降,單寧提取率隨之下降[14]。

    圖3 乙醇溶液濃度對單寧提取量的影響

    2.2.3 不同提取溫度的影響。溫度50℃有提取峰值,在此之前升高溫度可增加單寧在水溶液中的溶解度,而高于50℃后,黑柿葉中的單寧提取量明顯下降,當(dāng)溫度達(dá)到80℃時,提取量為123.58mg/mL,僅略高于40℃時(221.15mg/mL)的一半。溫度過高,可能加速單寧的氧化和分解或引起單寧結(jié)構(gòu)的變化,導(dǎo)致結(jié)果測定出提取的單寧量偏低。因此,傳統(tǒng)提取條件下長時間高溫不利于活性高的單寧提取。

    圖4 提取溫度對單寧提取的影響

    2.2.4 不同提取時間的影響。隨著提取時間的延長,單寧提取量有較明顯的增加,40min后不再增加。有研究表明,時間過長,會使得單寧中的酚羥基經(jīng)氧化反應(yīng)變成酮基,從而使得提取量下降[15]。超聲輔助提取既可縮短提取時間又能降低提取溫度,可提高柿葉中單寧的提取率。

    圖5 超聲波提取時間對單寧提取量的影響

    2.3 最佳提取工藝的優(yōu)化

    在單因素試驗(yàn)的結(jié)果上,正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析可知(表2),影響黑柿葉單寧提取率的4個因素的主次關(guān)系為提取溫度(A)>料液比(D)>提取時間(B)>乙醇濃度(C)。最佳提取條件為A1B2C2D3,即提取溫度50℃,提取時間40min,60%乙醇,料液比1︰50(g︰mL)。

    表2 黑柿葉片單寧提取的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.4 柿葉單寧對細(xì)菌生長影響的分析

    試驗(yàn)采用分光光度法,以光度值來表示細(xì)菌效果。由圖6可知,只有2.5%黑柿葉單寧在大腸桿菌生長至對數(shù)期之前稍微有抑制效果,其他濃度都沒有抑制作用。由圖7可知,不同濃度的黑柿葉單寧對金黃色葡萄球菌的抑制效果都較好,4h后對照組中金黃色葡萄球菌開始快速增殖,至6h后懸浮液的吸光值明顯高于試驗(yàn)組,且之后試驗(yàn)組的增殖一直很緩慢,單寧濃度相對較高時抑菌性更好一點(diǎn)。說明黑柿葉中單寧對金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用。

    圖6 黑柿葉單寧對大腸桿菌生長的影響

    圖7 黑柿葉單寧對金黃色葡萄球菌生長的影響

    3 結(jié)論

    (1)根據(jù)上述優(yōu)化工藝,利用60%乙醇、1︰50(g︰mL)料液比、超聲頻率100W的條件下,50℃提取40min時,可以較好地提取出黑柿葉中的單寧成分。

    (2)不同濃度的單寧溶液對2種不同細(xì)菌(大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)的繁殖生長有不同的影響。與噴灑了無菌水的2種細(xì)菌培養(yǎng)基相比,添加了單寧溶液的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液中,菌體增殖較緩,而對大腸桿菌的抑制作用不明顯,由此可明顯看出,單寧溶液具有一定的抑制金黃色葡萄球菌的能力,2.5%單寧溶液的抑菌效果更好一些。

    黑柿葉片是提取單寧的一種很好的原料,可有效利用黑柿葉資源,研發(fā)天然防腐劑,對資源合理應(yīng)用和食品防腐具有較好的研究意義。

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