假單胞菌生物被膜核心胞外多糖生物合成系統(tǒng)研究進(jìn)展*

劉佳文 吳倩 張昭寰 童金蓉 黃振華 劉靜 潘迎捷 趙勇***

（1）上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2）上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3）農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實(shí)驗(yàn)室（上海），上海 201306；4）上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

假單胞菌是常見的需氧型革蘭氏陰性細(xì)菌，廣泛地分布在空氣、土壤、水，以及人體皮膚、消化道和呼吸道中，可造成嚴(yán)重的水體污染，引起人體呼吸道、泌尿系統(tǒng)及血液等多部位的慢性或急性疾病。生物被膜是細(xì)菌細(xì)胞及其分泌物（如胞外多糖、胞外蛋白質(zhì)和胞外DNA等）黏附在生物或非生物材料表面而形成的多細(xì)胞聚集體［1］，生物被膜的形成加劇了假單胞菌的危害，可增強(qiáng)假單胞菌的致病性和耐藥性，嚴(yán)重威脅人類健康。

胞外多糖是假單胞菌生物被膜的主要成分，在其生物被膜黏附、發(fā)育、成熟過程中發(fā)揮重要作用，并能增強(qiáng)細(xì)菌對宿主細(xì)胞的侵襲力以及對抗生素類藥物的耐受性［2］。研究表明，與假單胞菌生物被膜形成直接相關(guān)的3種核心胞外多糖為：褐藻膠、Psl和Pel，它們分別通過褐藻膠生物合成系統(tǒng)（alginate biosynthetic system）、Psl生物合成系統(tǒng)（Psl biosynthetic system）和Pel生物合成系統(tǒng)（Pel biosynthetic system）進(jìn)行合成和轉(zhuǎn)運(yùn)［3］。這3個生物合成系統(tǒng)主要包含4類蛋白質(zhì)：胞內(nèi)蛋白、內(nèi)膜蛋白、周質(zhì)蛋白和外膜蛋白。胞內(nèi)蛋白位于細(xì)胞內(nèi)膜內(nèi)側(cè)，參與胞外多糖的合成，并負(fù)責(zé)將多糖從胞內(nèi)向內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)。內(nèi)膜蛋白位于細(xì)胞內(nèi)膜，參與多糖的進(jìn)一步修飾，并負(fù)責(zé)將多糖傳遞給周質(zhì)蛋白。周質(zhì)蛋白位于細(xì)胞的周質(zhì)空間中，負(fù)責(zé)將多糖從周質(zhì)空間到外膜。外膜蛋白位于細(xì)胞外膜，負(fù)責(zé)將胞外多糖轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜外，最終參與假單胞菌生物被膜的形成，使細(xì)菌能夠抵抗外界不良環(huán)境的入侵，導(dǎo)致嚴(yán)重的醫(yī)療、環(huán)境及食品安全問題［4］。

關(guān)于假單胞菌褐藻膠、Psl和Pel胞外多糖生物合成系統(tǒng)的研究已經(jīng)陸續(xù)開展（表1），明晰其具體的結(jié)構(gòu)和功能，有助于人們更好地理解假單胞菌生物被膜的形成機(jī)理，并為抗被膜制劑的研發(fā)提供精準(zhǔn)的三維靶標(biāo)和理論基礎(chǔ)。因此，本文系統(tǒng)地介紹了假單胞菌生物被膜3種核心胞外多糖的生物合成系統(tǒng)，并詳細(xì)地闡述了各蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能以及相互作用關(guān)系，最后對假單胞菌生物被膜胞外多糖生物合成系統(tǒng)的進(jìn)一步研究提出展望。

Table 1 Function of known structure proteins in the core exopolysaccharide biosynthetic systems of Pseudomonas表1假單胞菌核心胞外多糖生物合成系統(tǒng)中已知結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的功能

1 褐藻膠胞外多糖生物合成系統(tǒng)

褐藻膠是一種由β-D-甘露糖醛酸及其C5異構(gòu)體α-L-古羅糖醛酸組成的陰離子多糖［18］，是假單胞菌生物被膜的主要成分，也是假單胞菌產(chǎn)生黏附性的主要原因。褐藻膠的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)需要13個蛋白質(zhì)：胞內(nèi)蛋白AlgA、AlgC和AlgD；內(nèi)膜蛋白Alg8、Alg44；周 質(zhì) 蛋 白AlgI、AlgJ、AlgF、AlgX、AlgG和AlgL；外膜蛋白AlgK和AlgE。它們的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)過程如圖1所示。首先，單糖在AlgA、AlgC和AlgD的作用下轉(zhuǎn)化為GDP-甘露糖酸，然后GDP-甘露糖酸經(jīng)聚合酶（Alg8和Alg44）的催化后生成甘露聚糖。在AlgI、AlgJ、AlgF和AlgX的協(xié)同作用下，通過乙酰化作用對該聚合物進(jìn)行改性，并通過AlgG及AlgL將其異構(gòu)化，形成成熟的褐藻膠。最后，成熟的褐藻膠在AlgK參與的周質(zhì)多蛋白復(fù)合物介導(dǎo)下穿過外膜的AlgE蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外。

1.1 胞內(nèi)褐藻膠前體合成酶AlgA、AlgC和AlgD

褐藻膠的前體物質(zhì)D-甘露糖酸在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)合成，其合成主要分為以下4步：a.果糖-6-磷酸在AlgA的磷酸甘露糖異構(gòu)酶（PMI）活性作用下生成甘露糖-6-磷酸；b.甘露糖-6-磷酸經(jīng)AlgC催化生成甘露糖-1-磷酸；c.甘露糖-1-磷酸進(jìn)一步在AlgA的GDP-甘露糖焦磷酸化酶（GMP）活性作用下生成GDP-甘露糖；d.GDP-甘露糖在AlgD的催化下生成GDP-甘露糖酸［19］。這些參與核苷酸結(jié)合的酶至少存在1個羅斯曼（Rossmann）折疊結(jié)構(gòu)域，由交替的β鏈和α螺旋組成的二級結(jié)構(gòu)，中心的6股平行β折疊連接到周圍的5個α螺旋，這種結(jié)構(gòu)能夠產(chǎn)生或結(jié)合糖核苷酸前體［4］。

AlgA是一種雙功能酶，表現(xiàn)出磷酸甘露糖異構(gòu)酶（PMI）和GDP-甘露糖焦磷酸化酶（GMP）活性［20］，但其結(jié)構(gòu)尚未確定。Regni等［5］在2002年解析了AlgC的晶體結(jié)構(gòu)，是一種磷酸甘露糖變位酶，包含4個大小相近的結(jié)構(gòu)域，這4個結(jié)構(gòu)域排列成“心形”，并在其中心形成1個大的活性位點(diǎn)裂縫。研究表明，前3個結(jié)構(gòu)域具有相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，由夾在兩個α螺旋之間的4股β折疊混合組成，而第4個結(jié)構(gòu)域具有類似于TBP超家族蛋白（TATA-box binding protein superfamily）的結(jié)構(gòu)，由2個α螺旋和4股反向β折疊組成。此外，AlgC結(jié)構(gòu)中還包含4個活性位點(diǎn)：位于108位的絲氨酸涉及磷?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移；位于242～246的殘基具有Mg2+螯合性；位于324～328殘基的糖結(jié)合環(huán)能區(qū)分相關(guān)的糖底物；位于421位的精氨酸能與雙磷酸化反應(yīng)中間體相互作用。若基于這些活性位點(diǎn)設(shè)計抑制劑，將有可能抑制褐藻膠的生物合成，促進(jìn)宿主免疫系統(tǒng)對細(xì)菌生物被膜的清除作用，增加抗生素的療效。

Fig.1 Alginate extracellular polysaccharide biosynthetic system圖1褐藻膠胞外多糖生物合成系統(tǒng)

AlgD是一種GDP-甘露糖脫氫酶（GMD），2003年Snook等［6］得到了該蛋白質(zhì)與GDP-甘露酸復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。研究表明，AlgD是一個結(jié)構(gòu)域交換的二聚體，每個亞基包含2個大小相似的結(jié)構(gòu)域，分別位于N端和C端，由33個殘基的α螺旋連接，其活性位點(diǎn)位于兩個結(jié)構(gòu)域的裂縫中。N端結(jié)構(gòu)域包含完整的二核苷酸結(jié)合基序，由一個6股平行的β折疊和5個α螺旋組成。C端結(jié)構(gòu)域以3個α螺旋開始，隨后是一個二核苷酸結(jié)合基序。AlgD單體的N端結(jié)構(gòu)域與另一個AlgD單體的C端結(jié)構(gòu)域能夠緊密結(jié)合，高度交織形成二聚體，在細(xì)胞質(zhì)中，兩個AlgD二聚體相互作用形成四聚體結(jié)構(gòu)，從而將GDP-甘露糖催化成為GDP-甘露糖酸。

1.2 跨內(nèi)膜復(fù)合物Alg8和Alg44

Alg8和Alg44均位于假單胞菌細(xì)胞內(nèi)膜上，共同組成了跨內(nèi)膜的復(fù)合物［21］。Alg8是一種糖基轉(zhuǎn)移酶，其三維結(jié)構(gòu)未知，Oglesby等［22］預(yù)測其含有4個跨膜螺旋以及1個可溶性胞質(zhì)環(huán)。在胞質(zhì)環(huán)中存在2個結(jié)構(gòu)域，其中結(jié)構(gòu)域A與II類β糖基轉(zhuǎn)移酶的序列同源性較高，含有保守的天冬氨酸殘基和DXD氨基酸基序，可能分別是NDP-葡萄糖和受體分子的結(jié)合位點(diǎn)；結(jié)構(gòu)域B含有一個保守的天冬氨酸殘基和LXXRW氨基酸基序，可能負(fù)責(zé)將多個NDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移到受體分子。Remminghorst等［23］經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，Alg8是褐藻膠生物合成的關(guān)鍵，alg8的過表達(dá)會導(dǎo)致褐藻膠產(chǎn)量增加、乙?；约安钕虍悩?gòu)化。

Alg44在體內(nèi)以同源二聚體的形式存在，其N端有1個錨定于膜上的信號肽，以及1個位于細(xì)胞質(zhì)的PilZ結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合環(huán)二鳥苷酸（c-di-GMP）并調(diào)節(jié)褐藻膠的聚合［24-26］。Whitney等［7］解析出了Alg44胞質(zhì)域與c-di-GMP復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出1個分裂的桶狀結(jié)構(gòu)，包含6個反向平行的β鏈和1個α螺旋。Alg44蛋白C端含1個TM結(jié)構(gòu)和周質(zhì)域，其周質(zhì)域中包含膜融合蛋白（MFP）結(jié)構(gòu)，在褐藻膠前體GDP-甘露糖酸的聚合和修飾中發(fā)揮作用。Ogelsby等［22］認(rèn)為Alg44蛋白的MFP結(jié)構(gòu)域能夠通過蛋白質(zhì)間相互作用，向Alg44的N端發(fā)送構(gòu)象信號，影響Alg8聚合D-甘露酸的能力，從而控制Alg44蛋白的PilZ結(jié)構(gòu)域與c-di-GMP結(jié)合。

1.3 周質(zhì)中乙?；揎椀鞍譇lgI、AlgJ、AlgF和AlgX

GDP-甘露糖酸形成多聚物后將進(jìn)一步在周質(zhì)空間內(nèi)進(jìn)行乙?；揎棧?7］，該乙?；^程發(fā)生在甘露糖殘基的C2和C3羥基，由AlgI、AlgJ、AlgF和AlgX構(gòu)成的乙?；瘡?fù)合物進(jìn)行修飾。在細(xì)胞質(zhì)中，AlgI與未知的乙酰供體分子相互作用，并穿過內(nèi)膜將乙酰供體轉(zhuǎn)移到AlgJ或AlgF。AlgX從AlgJ或AlgF中接收乙酰供體分子，然后催化褐藻膠的直接O-乙酰化［28］。目前關(guān)于AlgI的具體結(jié)構(gòu)尚未研究，AlgJ、AlgF和AlgX的結(jié)構(gòu)于近些年陸續(xù)得到解析。

Baker等［9］解析了惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）AlgJ周質(zhì)域的結(jié)構(gòu)，該蛋白質(zhì)含有4個平行的核心β鏈（β3、β6～8），在9個α螺旋（α1、α3～10）的包圍下共同形成了α/β/α折疊，兩個反向平行的β鏈（β4和β5）位于α/β/α折疊的側(cè)邊，且其頂部有一個α2、β2和β3鏈組成的帽子結(jié)構(gòu)。Ser-His-Asp保守催化三殘基是該蛋白質(zhì)表現(xiàn)出O-乙?；钚缘脑?，其中D190和H192殘基位于帽子結(jié)構(gòu)中，而S288位于α/β/α折疊中。AlgF的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析，發(fā)布于PDB數(shù)據(jù)庫中（PDB ID：6CZT），具有2個串聯(lián)的β三明治結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)AlgJ蛋白與AlgX蛋白相互作用，負(fù)責(zé)乙酰基的轉(zhuǎn)移［3］。

Riley等［10］解析了銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）AlgX的晶體結(jié)構(gòu)，它是一種雙結(jié)構(gòu)域蛋白，其N端含有α/β/α拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，包括7個核心α螺旋，與SGNH水解酶超家族具有結(jié)構(gòu)同源性，不同之處在于AlgX只包含5股平行β股的前4股，第5股為單殘基β橋（W153），且這4個核心β鏈的順序也不同。D174、H176和S269殘基組成了水解酶結(jié)構(gòu)域的催化三聯(lián)體，負(fù)責(zé)乙?；蚝衷迥z轉(zhuǎn)移。AlgX的C端為碳水化合物結(jié)合模塊（carbohydrate-binding module，CBM），呈現(xiàn)最常見的β三明治折疊，每個β折疊包含4個反向平行的β鏈。CBM中的芳香氨基酸和極性保守殘基存在于蛋白質(zhì)表面的凹槽中，形成一個獨(dú)特的底物識別“夾點(diǎn)”，該“夾點(diǎn)”的存在有助于增加多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物的穩(wěn)定性。因此，GDP-甘露聚糖可在C端與AlgX結(jié)合，通過夾點(diǎn)并沿保守路徑運(yùn)動，然后通過AlgX的N端向GDP-甘露聚糖中添加乙?；瑥亩鴮?shí)現(xiàn)多聚物的改性。

1.4 周質(zhì)中異構(gòu)化蛋白AlgG和AlgL

AlgG是一種C5差向異構(gòu)酶，Wolfram等［8］解析了丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）AlgG蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，AlgG的主干是一個右手平行β螺旋，包括11個完整線圈和1個不完整線圈，每個線圈由3個β折疊組成，依次由3個轉(zhuǎn)彎環(huán)連接。線圈4～10形成一個碳水化合物結(jié)合/糖水解結(jié)構(gòu)域（carbohydrate-binding/sugar hydrolysis domains），N端的1個帽狀螺旋與2個反平行的β折疊共同形成該結(jié)構(gòu)域的蓋子。AlgG能在聚合物水平上將甘露酸殘基轉(zhuǎn)化為古魯酸，從而生成甘露酸、古魯酸交替排列的成熟褐藻膠。Jain等［29］認(rèn)為AlgG除了具有異構(gòu)酶活性，還能保護(hù)新生褐藻膠在穿過周質(zhì)時不被AlgL降解。AlgL是一種褐藻膠水解酶，呈現(xiàn)（α/α）6桶狀折疊，能夠裂解沒有從周質(zhì)空間中轉(zhuǎn)出的褐藻膠，從而防止其在周質(zhì)空間的積累［30-31］。

1.5 外膜蛋白AlgK和AlgE

Keiski等［11］的結(jié)構(gòu)解析表明，AlgK是一種外膜脂蛋白，由22個α螺旋組成的緊湊超螺旋結(jié)構(gòu)，其中1個N端螺旋與超螺旋結(jié)構(gòu)的凹面相結(jié)合，其余21個反向平行的α螺旋聚集形成右手超螺旋。AlgK有3個蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)，其中2個作用位點(diǎn)靠近N端的脂質(zhì)錨，從而直接與AlgE的周質(zhì)環(huán)相互作用，位于C端的作用位點(diǎn)可能與周質(zhì)蛋白或內(nèi)膜蛋白結(jié)合。研究認(rèn)為，該蛋白質(zhì)具有至少9.5個TPR基序（tetratricopeptide-like repeat），在大型蛋白質(zhì)復(fù)合物的組裝中發(fā)揮支架作用，可與AlgE、Alg8和Alg44相連接，并與AlgX和AlgG一起形成跨周質(zhì)通道［32-33］。Tan等［34］研究認(rèn)為，AlgK可能是以“末端對末端”的形式與AlgE的周質(zhì)孔相連接，有效延長了褐藻膠的輸出長度，以便于其通過AlgE的β桶。

Whitney等［12］在2011年對外膜蛋白AlgE的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，證明該蛋白質(zhì)是由18個β股（S1～S18）組成的反向平行β桶狀結(jié)構(gòu)，含9個胞外環(huán)（L1～L9）和8個周質(zhì)環(huán)（T1～T8），能自發(fā)地結(jié)合到細(xì)胞外膜上，其內(nèi)部帶正電性，可與帶電負(fù)性的褐藻膠結(jié)合。Tan等［34］認(rèn)為L2和T8分別為該蛋白質(zhì)的胞外門和周質(zhì)門，通過兩個門控的開放與關(guān)閉來調(diào)節(jié)褐藻膠的轉(zhuǎn)運(yùn)。L2可能通過二價陽離子穩(wěn)定電負(fù)性的脂多糖（LPS），以防止LPS干擾褐藻膠的有效分泌。周質(zhì)環(huán)T8的構(gòu)象很靈活，可以向下和向外運(yùn)動，負(fù)責(zé)將AlgE蛋白由“關(guān)閉”構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)椤伴_放”構(gòu)象，使AlgE與AlgK直接相互作用，從而促進(jìn)褐藻膠向膜外轉(zhuǎn)運(yùn)。胞外環(huán)L3和L7折疊到桶腔中，占據(jù)了通道的大部分體積從而限制孔隙的大小，有助于該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定［35］。研究還發(fā)現(xiàn)，AlgE的周質(zhì)T4是維持AlgE、AlgK、AlgX和Alg44形成穩(wěn)定多蛋白質(zhì)復(fù)合物的重要區(qū)域［36］。

2 Psl胞外多糖生物合成系統(tǒng)

Psl是一種由D-甘露糖、D-葡萄糖和L-鼠李糖組成的中性五糖［37］。其合成和轉(zhuǎn)運(yùn)由Psl胞外多糖生物合成系統(tǒng)負(fù)責(zé)［38］。Psl操縱子包含12個基因（PslA、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L），當(dāng)前只有PslG的周質(zhì)域結(jié)構(gòu)得到解析，其余蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)仍是未知。Psl胞外多糖的生物合成系統(tǒng)如圖2所示，糖-核苷酸前體經(jīng)PslB合成后，通過PslF、PslH、PslI和PslC轉(zhuǎn)移糖基形成Psl重復(fù)單元，然后由內(nèi)膜蛋白PslA提供一個位點(diǎn)，將Psl重復(fù)單元組裝到細(xì)胞質(zhì)的類異戊二烯脂質(zhì)上，同時在PslJ、PslK和PslL等內(nèi)膜蛋白的作用下，Psl多糖聚合并穿過細(xì)胞內(nèi)膜，隨后PslE作為周質(zhì)支架幫助Psl多糖穿過周質(zhì)，最終Psl多糖經(jīng)PslD到達(dá)細(xì)胞膜外［39］。

2.1 胞內(nèi)蛋白PslB、PslF、PslH、PslI和PslC

PslB、PslF、PslH、PslI和PslC位于細(xì)胞質(zhì)中，具體三維結(jié)構(gòu)均屬研究空白。PslB是一種與AlgA相似的雙功能酶，預(yù)測具有N端GMP結(jié)構(gòu)域和C端PMI結(jié)構(gòu)域，參與糖-核苷酸前體的生產(chǎn)［37］。PslF、PslH和PslI與分枝桿菌的磷脂酰肌醇甘露醇轉(zhuǎn)移酶PimA結(jié)構(gòu)具有相似性，具有糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyltransferase，GT）結(jié)構(gòu)域，屬于CAZyGT-4家族的酶，采用GT-B折疊，通過保留機(jī)制轉(zhuǎn)移糖基殘基，可能負(fù)責(zé)將活化的糖亞基加入到Psl多糖的重復(fù)結(jié)構(gòu)中。PslC與小鼠多肽α-N乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶T1結(jié)構(gòu)相似，屬于CAZyGT-2家族，采用GT-A折疊，可以負(fù)責(zé)葡萄糖、鼠李糖和甘露糖等多種核苷酸激活糖的轉(zhuǎn)移。根據(jù)PslF、PslH、PslI和PslC的預(yù)測結(jié)構(gòu)，這些酶可能負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)移糖-核苷酸前體的糖基，從而形成Psl多糖重復(fù)單元［4］。

2.2 內(nèi)膜蛋白PslA、PslE、PslJ、PslK、PslL和PslG

PslA、PslE、PslJ、PslK、PslL和PslG這6種內(nèi)膜蛋白都具有跨膜結(jié)構(gòu)域，可能在細(xì)胞內(nèi)膜上組成復(fù)合物。目前，除了PslG的可溶域結(jié)構(gòu)之外，其余5種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)尚不明確。PslA與細(xì)菌的WbaP蛋白結(jié)構(gòu)相似，具有聚異戊二烯糖基磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，可能為Psl低聚糖重復(fù)單元提供1個位點(diǎn)，將其組裝到內(nèi)膜細(xì)胞質(zhì)側(cè)的類異戊二烯脂質(zhì)上［4］。PslE的周質(zhì)域與大腸桿菌內(nèi)膜蛋白Wzz存在結(jié)構(gòu)相似性，是一種卷曲的線圈結(jié)構(gòu)，單體可組裝成具有中心孔的六聚體或八聚體［40］。Wu等［41］研究表明，PslE可能作為支架，與PslA、PslD相互作用形成內(nèi)膜復(fù)合物，促進(jìn)Psl多糖向周質(zhì)空間轉(zhuǎn)運(yùn)。PslJ沒有明顯的結(jié)構(gòu)同系物，PslK蛋白與霍亂弧菌NorM蛋白結(jié)構(gòu)相似，能夠通過擠壓的方式將多糖分子轉(zhuǎn)運(yùn)至周質(zhì)空間［42］。PslL具有酰基轉(zhuǎn)移酶3結(jié)構(gòu)域，但Psl多糖不被小官能團(tuán)修飾，因此很難推測PslL的具體作用［4］。

Fig.2 Psl extracellular polysaccharide biosynthetic system圖2 Psl胞外多糖生物合成系統(tǒng)

Baker等［13］解析了PslG蛋白第31～442位氨基酸的周質(zhì)域結(jié)構(gòu)，PslG（31～442）具有糖苷水解酶活性，包含2個結(jié)構(gòu)域：N端的（β/α）8桶狀結(jié)構(gòu)中有6個大環(huán)（L1～L6），這些大環(huán)包含小的二級結(jié)構(gòu)元件，能夠連接（β/α）8折疊中的α螺旋和β折疊，形成1個長約32?的鐮刀形深槽。C端的β三明治結(jié)構(gòu)由1個小β折疊和在（β/α）8催化結(jié)構(gòu)域之后的6個β折疊組成。Wu等［41］研究表明，在PslG蛋白中，與內(nèi)膜結(jié)合部分有助于Psl的合成，周質(zhì)部分表現(xiàn)出水解活性，與Psl胞外多糖的產(chǎn)生和初始黏附有關(guān)。

2.3 外膜蛋白PslD

PslD位于細(xì)胞外膜上，與大腸桿菌莢膜轉(zhuǎn)位酶Wza結(jié)構(gòu)相似，具有八聚體結(jié)構(gòu)，存在1個大的中心腔，推測其與Wza具有相同的多糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能，可幫助Psl多糖從周質(zhì)空間轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外［43］。不同之處在于，PslD具有2個周質(zhì)離散環(huán)，而Wza比它多1個，并且PslD似乎缺乏外膜的α螺旋桶狀結(jié)構(gòu)，因此在PslD具體的三維結(jié)構(gòu)被解析出來之前，對于其轉(zhuǎn)運(yùn)Psl多糖通過外膜的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究尚屬空白。此外，Wu等［41］研究表明，PslD與PslE具有很強(qiáng)的相互作用，這種相互作用有助于PslD在外膜上的定位。

3 Pel胞外多糖生物合成系統(tǒng)

Pel是一種由部分乙?；腘-乙酰半乳糖胺和N-乙酰葡糖胺組成的陽離子胞外多糖［44］，能夠使假單胞菌在氣-水界面形成一層薄膜，可以幫助細(xì)菌抵抗氨基糖苷類抗生素，在生物被膜基質(zhì)中發(fā)揮結(jié)構(gòu)和保護(hù)作用。參與Pel胞外多糖生物合成系統(tǒng)的7個蛋白質(zhì)由7個基因操縱子pelA、B、C、D、E、F、G編碼，其合成轉(zhuǎn)運(yùn)過程如圖3所示：PelF蛋白以UDP-葡萄糖為底物將糖基轉(zhuǎn)移到Pel多糖上，PelD蛋白與c-di-GMP結(jié)合調(diào)控Pel多糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，位于內(nèi)膜的PelE和PelG幫助Pel多糖穿過內(nèi)膜，周質(zhì)中的伴侶蛋白PelA將Pel多糖修飾為成熟的陽離子多糖后，成熟的Pel多糖被PelC吸引穿過外膜的PelB桶孔最終到達(dá)細(xì)胞外。

Fig.3 Pel extracellular polysaccharide biosynthetic system圖3 Pel胞外多糖生物合成系統(tǒng)

3.1 胞內(nèi)蛋白PelF

PelF是一種糖基轉(zhuǎn)移酶，位于細(xì)胞質(zhì)中，不含跨膜螺旋，以UDP-葡萄糖為底物合成Pel多糖［45］。在CAZy數(shù)據(jù)庫中，該蛋白質(zhì)屬于GT-4家族，呈現(xiàn)GT-B折疊，并且C端含有EX7E基序［46］。E405和E413是EX7E基序中的2個保守殘基，但E413對PelF蛋白的酶活性并沒有影響。PelF還包含2個保守DXD基序，但與其他糖基轉(zhuǎn)移酶不同，這4個天冬氨酸對PelF蛋白的酶活性沒有影響。此外，K330和R325氨基酸殘基對PelF的酶活性有重要作用，可與UDP-葡萄糖磷酸根的氧原子作用形成氫鍵。

3.2 內(nèi)膜聚合物PelDEG

內(nèi)膜上的PelD、PelE和PelG蛋白組成一個三聯(lián)體復(fù)合物，參與Pel胞外多糖的跨內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)。Whitfield等［47］研究證明PelDEG復(fù)合物與PelF相互作用并幫助PelF定位于內(nèi)膜，但PelDEG復(fù)合物的結(jié)構(gòu)仍未知，僅有PelD胞質(zhì)域的結(jié)構(gòu)被解析。

Whitney等［14］對PelD蛋白第156～455位氨基酸的胞質(zhì)域結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，PelD（156～455）含4個跨膜螺旋，第4個跨膜螺旋延伸到細(xì)胞質(zhì)中，連接跨膜結(jié)構(gòu)域與可溶性細(xì)胞質(zhì)區(qū)域。N端含有1個GAF結(jié)構(gòu)域，其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為ααββαββα，C端為GGDEF結(jié)構(gòu)域，其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為αβαββαβα，二者經(jīng)一段無序的短鏈連接，形成了1個653?2的界面。在GGDEF結(jié)構(gòu)域中存在保守的RXXD基序，可作為與c-di-GMP結(jié)合的I位點(diǎn)。當(dāng)c-di-GMP與該位點(diǎn)結(jié)合時，N端的GAF結(jié)構(gòu)域會發(fā)生14°旋轉(zhuǎn)，使得界面的面積從653?2減小為609?2，以調(diào)控Pel多糖的生物合成。PelE包含1個I型輸出信號單元和2個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域，這種排列使得PelE的大部分C端位于周質(zhì)空間中［48］。預(yù)測C端區(qū)域都是α螺旋，含有至少有4～5個TPR基序，可作為支架蛋白，通過與PelA和PelB相互作用，促進(jìn)Pel多糖的轉(zhuǎn)運(yùn)。PelG與霍亂弧菌的NorM結(jié)構(gòu)相似，預(yù)測含有12個TM結(jié)構(gòu)域，可能與MATE蛋白家族成員具有相似的功能，在Pel多糖通過內(nèi)膜的過程中發(fā)揮作用［42］。

3.3 周質(zhì)伴侶蛋白PelA

PelA是Pel多糖的伴侶蛋白，主要位于周質(zhì)空間中［49］。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，PelA含兩個主要的結(jié)構(gòu)域，N端為糖苷水解酶域（glycoside hydrolase，GH），屬于GH114家族，該區(qū)域的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析（PDB ID：5TCB），呈現(xiàn)β8/α7TIM桶狀結(jié)構(gòu)，其中有1個高度電負(fù)性的裂縫，內(nèi)表面為保守的酸性殘基，在陽離子多糖的結(jié)合中起到關(guān)鍵作用［3］。C端結(jié)構(gòu)域?yàn)樘妓衔秕ッ赣颍憩F(xiàn)出金屬依賴的脫乙酰酶活性，被證明與Pel多糖的合成直接相關(guān)。Pel多糖在周質(zhì)空間中能夠通過PelA進(jìn)行脫乙?；揎?，形成成熟的Pel多糖。

3.4 外膜上的復(fù)合物PelBC

PelB的N端含19個連續(xù)的TPR結(jié)構(gòu)基序，可作為該系統(tǒng)中其余蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)支架［4］。Marmont等［16］研究表明，該TPR結(jié)構(gòu)域的離散區(qū)域能夠與PelA相互作用，但每個TPR基序的作用又有所不同，其中R9～R14能夠促進(jìn)PelA在周質(zhì)空間中的定位，R15～R19可以作為重復(fù)的“間隔區(qū)”，引起PelA和PelC之間的空間碰撞。PelB能夠?qū)elA“招募”到外膜，并與PelA直接相互作用，誘導(dǎo)PelA發(fā)生構(gòu)象改變，使其脫乙酰酶活性增加，水解酶活性降低，使得Pel多糖更有效的脫乙?；?。Marmont等［17］經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，PelB的C端為跨膜β桶狀結(jié)構(gòu)，預(yù)測由16個β鏈組成，負(fù)責(zé)將Pel多糖轉(zhuǎn)運(yùn)到膜外。C端β桶結(jié)構(gòu)域和N端TPR結(jié)構(gòu)域之間是一段約120個殘基的連接區(qū)域，其具體的結(jié)構(gòu)還無法預(yù)測，推測這段結(jié)構(gòu)穿過PelC的中間孔，并與其相互作用。

PelC為外膜脂蛋白，位于外膜的內(nèi)側(cè)。Marmont等［17］解析了PelC的結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明PelC單體為混合的α/β折疊，在體內(nèi)形成中心約30?孔隙的十二環(huán)狀聚合物。該聚合物類似于1個沒有柄的“漏斗”，凸面靠近細(xì)胞外膜，與磷脂的電負(fù)性基團(tuán)相互作用。N端的149位色氨酸保守殘基在孔內(nèi)聚合形成1個芳香帶，負(fù)責(zé)將PelC聚合物錨定在外膜上。而PelC的凹面呈高度電負(fù)性，負(fù)責(zé)將帶正電荷的Pel多糖吸附到“漏斗”內(nèi)部，將其引導(dǎo)進(jìn)入PelB的β桶中，并將其轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜外，參與假單胞菌生物被膜的構(gòu)筑。

4 總結(jié)與展望

假單胞菌被視為研究生物被膜的模式菌株，褐藻膠、Psl和Pel胞外多糖是假單胞菌生物被膜的重要組成部分，能夠幫助細(xì)菌細(xì)胞抵抗外界的不利條件，其合成和轉(zhuǎn)運(yùn)依賴于對應(yīng)的褐藻膠、Psl和Pel胞外多糖生物合成系統(tǒng)。本文系統(tǒng)地總結(jié)了這3種系統(tǒng)相關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究進(jìn)展，在微觀層面闡述了這些系統(tǒng)的相關(guān)功能，可為假單胞菌胞外多糖合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌的進(jìn)一步研究奠定扎實(shí)的理論基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步揭示細(xì)菌生物被膜的形成機(jī)制提供新的視野及思路?；谝陨霞賳伟舛嗵巧锖铣上到y(tǒng)的研究現(xiàn)狀，本文對其未來的研究方向提出以下兩點(diǎn)展望。

4.1 解析相關(guān)膜蛋白及復(fù)合物的未知結(jié)構(gòu)和功能

在目前已經(jīng)解析的假單胞菌胞外多糖生物合成系統(tǒng)的三維結(jié)構(gòu)中，除了AlgE之外，大多數(shù)研究均集中于可溶性蛋白、或者膜蛋白的可溶部分，對于這3種系統(tǒng)相關(guān)膜蛋白的研究還相對較少，尤其缺乏膜蛋白復(fù)合物的研究，極大限制了人們對于這些生物合成系統(tǒng)作用機(jī)制的理解。因此，未來研究應(yīng)著重針對膜蛋白及膜蛋白復(fù)合物的未知結(jié)構(gòu)和功能展開，以明晰此類系統(tǒng)的分子機(jī)理及生命調(diào)控過程，揭示胞外多糖的生物合成與假單胞菌生物被膜形成之間復(fù)雜的相互作用關(guān)系，為假單胞菌生物被膜形成機(jī)制的研究奠定理論基礎(chǔ)。

4.2 研發(fā)靶向于胞外多糖生物合成系統(tǒng)的新型抗生物被膜制劑

生物被膜是假單胞菌抵抗外界不利條件的保護(hù)屏障，胞外多糖在該保護(hù)屏障中起著結(jié)構(gòu)支撐作用，其合成轉(zhuǎn)運(yùn)依賴胞外多糖生物合成系統(tǒng)。若針對性地破壞這些蛋白質(zhì)的活性，能夠有效阻斷胞外多糖合成轉(zhuǎn)運(yùn)過程，從根本上控制細(xì)菌生物被膜的形成。雖然目前已有多種抗生物被膜制劑被陸續(xù)研發(fā)，但僅停留于破壞胞外多糖、胞外蛋白和胞外DNA的層面［50］。胞外多糖生物合成系統(tǒng)的存在，將不斷地為細(xì)菌輸送新合成的胞外多糖，導(dǎo)致細(xì)菌生物被膜的再次形成。因此，未來新型抗生物被膜制劑的研究，可基于胞外多糖生物合成系統(tǒng)設(shè)計靶向控制策略，從源頭上徹底清除細(xì)菌生物被膜。