結(jié)合微針及AFM的單細(xì)胞精準(zhǔn)激勵(lì)與力學(xué)特性同步測(cè)量*

馮雅琦 于鵬 施佳林 李密**

（1）中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)自動(dòng)化研究所，機(jī)器人學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110016；2）中國(guó)科學(xué)院機(jī)器人與智能制造創(chuàng)新研究院，沈陽(yáng) 110169；3）中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

細(xì)胞力學(xué)特性及其動(dòng)態(tài)變化在細(xì)胞生理病理活動(dòng)過(guò)程中起著重要的調(diào)控和指示作用。近年來(lái)人們?cè)絹?lái)越深刻地認(rèn)識(shí)到細(xì)胞不僅是生化系統(tǒng)（如基因變化、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等），同時(shí)也是機(jī)械系統(tǒng)（如生成并傳遞機(jī)械力以驅(qū)動(dòng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和變形等）［1］。機(jī)械力幾乎在所有尺度（如分子、細(xì)胞、組織、器官）的生命活動(dòng)過(guò)程中均起著重要作用［2］，如SNARE蛋白產(chǎn)生的熵力驅(qū)動(dòng)囊泡融合［3］，細(xì)胞在進(jìn)行有絲分裂時(shí)會(huì)產(chǎn)生向外的推力以便在三維微環(huán)境中進(jìn)行增殖［4］，而在組織生長(zhǎng)過(guò)程中張力驅(qū)動(dòng)成纖維細(xì)胞與肌成纖維細(xì)胞之間的可逆轉(zhuǎn)變［5］。對(duì)于細(xì)胞來(lái)說(shuō)，生物體內(nèi)的細(xì)胞存在于由細(xì)胞外基質(zhì)、鄰近細(xì)胞等構(gòu)成的三維微環(huán)境中［6］。一方面，微環(huán)境的力學(xué)特性（如納米形貌［7］、剛度［8］、黏彈特性［9］等）對(duì)于細(xì)胞生理活動(dòng)及行為具有重要影響，如研究表明在不同剛度基底上生長(zhǎng)的干細(xì)胞分化為不同類型的細(xì)胞［10］等。此外，微環(huán)境力學(xué)特性還可對(duì)細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移、細(xì)胞鋪展、細(xì)胞增殖等進(jìn)行調(diào)控［11］。另一方面，細(xì)胞在其生理病理活動(dòng)過(guò)程中也會(huì)改變微環(huán)境的力學(xué)特性進(jìn)而調(diào)控自身生理活動(dòng)［12］，如在癌癥、纖維化、心血管等疾病過(guò)程中通常伴隨著細(xì)胞外基質(zhì)的硬化［13］。細(xì)胞-微環(huán)境之間的相互作用不僅影響細(xì)胞生化特性，還通常伴隨著細(xì)胞力學(xué)特性的相應(yīng)變化。在癌癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，癌細(xì)胞的剛度明顯小于正常細(xì)胞的剛度［14］，且癌細(xì)胞比正常細(xì)胞更容易變形［15］，而在瘧原蟲感染紅細(xì)胞后紅細(xì)胞的變形能力顯著減弱［16］，顯示細(xì)胞力學(xué)特性已成為指示疾病發(fā)生發(fā)展的重要指標(biāo)［17-18］。因此，開展細(xì)胞力學(xué)特性研究對(duì)于揭示生命活動(dòng)奧秘及相關(guān)疾病的診療具有重要的科學(xué)意義。

原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）［19］的發(fā)明為單細(xì)胞力學(xué)特性研究提供了新的技術(shù)手段。AFM利用壓電陶瓷驅(qū)動(dòng)一根末端集成有極細(xì)針尖的微懸臂梁對(duì)樣本表面進(jìn)行光柵掃描，同時(shí)通過(guò)一束照射到懸臂梁背面的激光檢測(cè)懸臂梁信號(hào)（如偏轉(zhuǎn)量、振幅、頻率等）變化來(lái)感知掃描過(guò)程中針尖表面原子與樣本表面原子之間的相互作用以獲取反映樣本表面形貌起伏的三維圖像。AFM的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)是可以直接在溶液環(huán)境下對(duì)活體狀態(tài)的無(wú)需預(yù)先處理（如固定、染色、標(biāo)記等）的生物樣本進(jìn)行高精度（納米級(jí)空間分辨率、毫秒級(jí)時(shí)間分辨率和皮牛級(jí)力靈敏度［20］）觀測(cè)。AFM不僅可對(duì)樣本表面形貌結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像，還能在力譜模式下通過(guò)在垂直方向?qū)颖颈砻孢M(jìn)行壓痕測(cè)試來(lái)分析樣本力學(xué)特性［21-25］。過(guò)去的數(shù)十年中，研究人員利用AFM對(duì)細(xì)胞力學(xué)特性開展了廣泛的研究，如細(xì)胞彈性特性測(cè)量［26］、基底效應(yīng)消除［27］、細(xì)胞黏彈特性測(cè)量［28］、細(xì)胞流變特性測(cè)量［29］、癌細(xì)胞力學(xué)特性探測(cè)［30］、臨床病例樣本探測(cè)［31］、軟基底表面細(xì)胞力學(xué)特性探測(cè)［32］、外泌體對(duì)細(xì)胞力學(xué)特性的影響［33］、細(xì)胞膜張力［34］等，極大地促進(jìn)了力學(xué)生物學(xué)［35］的發(fā)展。然而需要指出的是，由于常規(guī)AFM探針自身難以進(jìn)行藥物遞送，目前利用AFM對(duì)化學(xué)刺激（如化療藥物［36］、蛋白抑制劑［37］、細(xì)胞松弛素［38］等）下的細(xì)胞力學(xué)特性進(jìn)行測(cè)量時(shí)通常需要預(yù)先將化學(xué)分子添加到細(xì)胞培養(yǎng)皿中以對(duì)培養(yǎng)皿中的全體細(xì)胞進(jìn)行刺激，這種測(cè)量方式的不足之處是難以實(shí)現(xiàn)超微量藥物精準(zhǔn)刺激單個(gè)細(xì)胞情況下的細(xì)胞力學(xué)特性動(dòng)態(tài)變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。雖然研究人員通過(guò)在AFM探針中構(gòu)建中空管道，實(shí)現(xiàn)了基于AFM探針的藥物遞送［39］，但這種方法需要特殊制備的中空AFM探針，且會(huì)不可避免地影響AFM探針測(cè)量精度。

針對(duì)上述問(wèn)題，本文通過(guò)將微針顯微注射技術(shù)與AFM相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞精準(zhǔn)激勵(lì)及力學(xué)特性同步測(cè)量。通過(guò)搭建微針注射系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)細(xì)胞的熒光染液遞送，并建立了超微量藥物精準(zhǔn)激勵(lì)下的單細(xì)胞力學(xué)特性同步檢測(cè)方法。在此基礎(chǔ)上，揭示了化療藥物刺激前后單個(gè)細(xì)胞力學(xué)特性的實(shí)時(shí)變化。研究結(jié)果為細(xì)胞-藥物之間相互作用的精準(zhǔn)定量動(dòng)態(tài)分析提供了新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與樣本制作

本文選用NIH 3T3（小鼠胚胎成纖維細(xì)胞）、HEK 293（人胚胎腎細(xì)胞）和MCF-7（人乳腺癌細(xì)胞）開展實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)（上海）。細(xì)胞在含有10%胎牛血清（以色列Biological Industries公司）和1%青霉素-鏈霉素（美國(guó)Hyclone公司）的DMEM（高糖）培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclon公司）中培養(yǎng)（37℃，5% CO2）。NIH 3T3、HEK293和MCF-7為貼壁生長(zhǎng)型細(xì)胞，可以直接貼附在基底表面并在基底表面延展生長(zhǎng)，因此將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿80%培養(yǎng)皿基底時(shí)將細(xì)胞傳代到新的培養(yǎng)皿，隨后將培養(yǎng)皿置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2～3 d后直接將培養(yǎng)皿置于結(jié)合微針和AFM的單細(xì)胞分析實(shí)驗(yàn)平臺(tái)（圖1a）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（微針注射、AFM探測(cè)、熒光觀察等）。

1.2 原子力顯微鏡（AFM）

本文采用的AFM型號(hào)為Bioscope Catalyst AFM（美國(guó)Bruker公司）（圖1b）。AFM樣品臺(tái)安裝在熒光倒置顯微鏡（Ti，日本Nikon公司）上，使得可以在光學(xué)/熒光顯微鏡導(dǎo)引下移動(dòng)AFM探針到目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行探測(cè)（圖1g）。將含有細(xì)胞的培養(yǎng)皿置于AFM樣品臺(tái)后，即可控制AFM探頭浸入培養(yǎng)皿液面并對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的力學(xué)特性進(jìn)行探測(cè)。本文細(xì)胞力學(xué)特性測(cè)量實(shí)驗(yàn)使用的AFM探針型號(hào)為MLCT（美國(guó)Bruker公司），探針具體參數(shù)如下：探針的材料為氮化硅，懸臂梁彈性系數(shù)為0.01 N/m，懸臂梁長(zhǎng)度為310 μm，懸臂梁寬度為20 μm，針尖曲率半徑為20 nm，針尖高度為2.5～8 μm。

1.3 細(xì)胞顯微注射系統(tǒng)與微針制作

細(xì)胞顯微注射系統(tǒng)由三維操縱儀（MP-225，美國(guó)Sutter儀器公司）、微量注射泵（2000，美國(guó)Harvard儀器公司）、醫(yī)用注射器（1 ml容量）、聚四氟管（PTFE tube）、玻璃微針等組成（圖1c）。利用P-2000型拉針儀（美國(guó)Sutter儀器公司）對(duì)毛細(xì)玻璃針管進(jìn)行拉制得到微針（圖1e，f）。具體來(lái)說(shuō)，設(shè)置拉針儀的拉制參數(shù)（溫度、速度、拉力等），拉針儀將自動(dòng)按照設(shè)置的參數(shù)得到所需尺寸的微針。需要指出的是，剛拉制出的微針尖端為封閉狀態(tài)（圖2a），因此需要將針尖折斷以得到用于細(xì)胞注射的微針。在光學(xué)顯微鏡的導(dǎo)引下，控制微針針尖與堅(jiān)硬基底接觸摩擦，即可實(shí)現(xiàn)針尖部位的折斷。本文制作的微針（折斷后）管口直徑（外徑）范圍為0.7～1.2 μm。需要指出的是，本文采用針尖摩擦折斷方法制作的針尖參數(shù)（形狀、尺寸）難以控制。為了得到針尖形狀和尺寸可控的微針，可以采用商用的鍛針儀（microforge）對(duì)微針進(jìn)行熔融折斷［40］。將制作的微針固定在三維操縱儀上，并通過(guò)聚四氟管將微針與安裝在微量注射泵的醫(yī)用注射器相連。利用與AFM集成的熒光倒置顯微鏡（圖1b）對(duì)微針注射操作進(jìn)行視覺(jué)導(dǎo)引。將用于實(shí)驗(yàn)注射的試劑溶液裝載于玻璃針內(nèi)后，在光學(xué)顯微鏡成像導(dǎo)引下利用三維操縱儀可控制玻璃針沿水平和/或垂直方向移動(dòng)，從而將針尖移動(dòng)至目標(biāo)細(xì)胞上（圖1d，h），隨后通過(guò)微量注射泵推動(dòng)注射器施加正壓以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞注射。

Fig.1 Single-cell analysis experimental platform based on micropipette and AFM

1.4 微針細(xì)胞注射

本文首先選用藍(lán)色墨水（上海晨光文具公司）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）（上海翊圣生物科技有限公司）熒光染液作為試劑進(jìn)行細(xì)胞注射實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證微針內(nèi)溶液是否成功注入細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)微針將臨床使用的化療藥物阿糖胞苷溶液（中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心提供）注射至單個(gè)細(xì)胞開展精準(zhǔn)激勵(lì)下的細(xì)胞力學(xué)特性同步檢測(cè)研究。具體來(lái)說(shuō)，在將微針安裝在三維操縱儀前，首先用注射器將待注射溶液裝載于微針內(nèi)部。需要指出的是，由于微針針尖尺寸較小，氣泡的存在將嚴(yán)重影響針管內(nèi)試劑的流出，因此裝載溶液后的微針需針尖朝下懸空放置，并輕彈管壁，幫助針尖處的氣泡上浮至微針尾部的液面。將排凈氣泡后的微針通過(guò)聚四氟管與注射器連接，并將微針固定在三維操縱儀上。注射器和聚四氟管內(nèi)預(yù)先裝載有PBS溶液，因此整個(gè)注射系統(tǒng)形成密封的純液體環(huán)境。利用注射泵推動(dòng)注射器推桿形成一定的正壓，以控制微針內(nèi)溶液的流出。控制三維操縱儀移動(dòng)微針，同時(shí)調(diào)節(jié)顯微鏡聚焦平面，使微針針尖與顯微鏡聚焦平面重合，從而在光學(xué)顯微鏡成像視野中觀察到微針?？刂莆⑨樑c顯微鏡聚焦平面向基底移動(dòng)，直至在視野中同時(shí)觀察到微針與細(xì)胞。隨后控制針尖移動(dòng)至目標(biāo)細(xì)胞附近，并以45°方向刺入細(xì)胞。當(dāng)針尖進(jìn)入細(xì)胞后，針管內(nèi)溶液將在正壓作用下從針尖流向細(xì)胞內(nèi)部，從而將整個(gè)細(xì)胞染色或進(jìn)行藥物刺激。

1.5 AFM細(xì)胞力學(xué)特性測(cè)量

利用AFM對(duì)微針注射前后同一細(xì)胞進(jìn)行力學(xué)特性測(cè)量的過(guò)程如下。在進(jìn)行微針注射前，將細(xì)胞培養(yǎng)皿置于AFM樣品臺(tái)，在光學(xué)顯微鏡的導(dǎo)引下，控制AFM探針在基底空白區(qū)域獲取力曲線以校正懸臂梁的偏轉(zhuǎn)靈敏度，并利用AFM熱噪聲模塊對(duì)懸臂梁的彈性系數(shù)進(jìn)行校正。隨后控制AFM探針在力譜模式下在細(xì)胞表面中央?yún)^(qū)域不同位置點(diǎn)進(jìn)行垂直方向的逼近-回退運(yùn)動(dòng)，以得到力曲線［41］。在測(cè)量化療藥物注射前后單細(xì)胞力學(xué)特性動(dòng)態(tài)變化的實(shí)驗(yàn)中，在每個(gè)細(xì)胞的中央?yún)^(qū)域不同點(diǎn)獲取15條力曲線。為了使測(cè)量結(jié)果具有可比性，力曲線獲取的所有參數(shù)均保持一致（探針逼近速度為10 μm/s，力曲線范圍為5 μm）。AFM細(xì)胞力學(xué)特性測(cè)量完畢后，在光學(xué)顯微鏡導(dǎo)引下控制微針對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行藥物注射。注射完成后，再次控制AFM探針在目標(biāo)細(xì)胞（被注射藥物）表面獲取力曲線以測(cè)量藥物刺激后的細(xì)胞力學(xué)特性。

1.6 細(xì)胞楊氏模量計(jì)算

利用Hertz-Sneddon模型（錐形針尖）對(duì)獲取的力曲線進(jìn)行分析以得到細(xì)胞楊氏模量［41］：

（1）式中υ為細(xì)胞的泊松比（細(xì)胞通常被考慮為不可壓縮材料，因此υ=0.5［42-43］），F(xiàn)為探針加載力，δ為壓痕深度，E為細(xì)胞楊氏模量，θ為錐形針尖半開角。探針加載力F可以根據(jù)胡克定律從懸臂梁偏轉(zhuǎn)量x得到：

（2）式中k為懸臂梁彈性系數(shù)。從獲取的力曲線上可以得到懸臂梁偏轉(zhuǎn)量x和壓電陶瓷驅(qū)動(dòng)器在垂直方向的距離變化d。根據(jù)逼近曲線上的接觸點(diǎn)，將逼近曲線轉(zhuǎn)為壓痕曲線（壓痕深度等于壓電陶瓷驅(qū)動(dòng)器垂直方向的變化量d與懸臂梁偏轉(zhuǎn)量x的差值），隨后利用Hertz-Sneddon模型對(duì)壓痕曲線進(jìn)行擬合即得到細(xì)胞楊氏模量。擬合過(guò)程利用Matlab（美國(guó)Mathworks公司）編寫的程序完成。

1.7 掃描電鏡（SEM）成像

利用SEM（德國(guó)Zeiss公司）更精確地觀察微針針尖形貌并確定針尖孔徑尺寸。具體來(lái)說(shuō)，用導(dǎo)電膠分別將折斷后與未折斷的微針固定在樣品臺(tái)上，并用離子濺射儀對(duì)樣品進(jìn)行鍍金處理。隨后將制備好的微針樣品置于SEM樣品室中進(jìn)行SEM掃描成像。

2 結(jié)果與討論

首先建立了基于玻璃微針的單細(xì)胞注射方法并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。利用拉針儀對(duì)玻璃毛細(xì)管進(jìn)行拉制后，微針針尖為封閉狀態(tài)（圖2a）。將微針置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行折斷以使針尖由封閉狀態(tài)變?yōu)殚_口狀態(tài)（圖2b，c），以確保針管內(nèi)試劑溶液的順利流出（圖2d）。此外，微針針尖的尺寸直接影響注射效果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，如果針尖外徑大于1 μm，則注射過(guò)程會(huì)直接對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械損傷，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變（圖2e，f），而在利用針尖尺寸較小的微針對(duì)細(xì)胞進(jìn)行注射時(shí)，細(xì)胞形態(tài)保持完整（圖2g，h）。為了驗(yàn)證微針內(nèi)部溶液是否被注射至細(xì)胞，首先選取藍(lán)色墨水作為被注射試劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰地顯示了細(xì)胞在被注射藍(lán)色墨水后呈現(xiàn)藍(lán)色（圖3），表明了玻璃針管內(nèi)部的藍(lán)色墨水溶液成功被注射至細(xì)胞。進(jìn)一步采用PI染液作為試劑，利用微針將PI染液注射至細(xì)胞，并在注射過(guò)程中動(dòng)態(tài)記錄PI熒光圖像（圖4）。圖中清晰地顯示目標(biāo)細(xì)胞（圖4a黃色箭頭指示）的細(xì)胞核熒光顯著增強(qiáng)的動(dòng)態(tài)過(guò)程（圖4b～h），證明了PI染液成功被注射至細(xì)胞。

隨后結(jié)合微針注射和AFM建立了單細(xì)胞精準(zhǔn)化學(xué)激勵(lì)下的細(xì)胞力學(xué)特性同步測(cè)量流程（圖5）。首先在光學(xué)顯微鏡的導(dǎo)引下，控制微針對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行PI染液注射（圖5a）?？梢钥吹阶⑸浜蟮哪繕?biāo)細(xì)胞呈現(xiàn)明亮的熒光（圖5c），表明PI溶液被遞送至細(xì)胞內(nèi)部。隨后即可在PI熒光的導(dǎo)引下，控制AFM移動(dòng)到目標(biāo)（發(fā)光）細(xì)胞（圖5d）并在細(xì)胞表面進(jìn)行壓痕實(shí)驗(yàn)以獲取力曲線（圖5e）。通過(guò)對(duì)力曲線進(jìn)行分析即可得到細(xì)胞楊氏模量（圖5f），可以看到理論擬合曲線與實(shí)驗(yàn)壓痕曲線一致。近年來(lái)，研究人員廣泛研究了基于微針的單細(xì)胞操作及測(cè)量技術(shù)，包括發(fā)展用于胚胎注射的自動(dòng)化微注射系統(tǒng)［44］，對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行機(jī)器人化注射以研究細(xì)胞間相互作用［45］，抽取細(xì)胞內(nèi)部物質(zhì)（如細(xì)胞器［46］、DNA［47］等），以及基于微針吸吮的細(xì)胞力學(xué)特性測(cè)量等［48］。2019年，Daza等［49］進(jìn)一步比較了基于AFM的細(xì)胞局部力學(xué)特性測(cè)量和基于微針的細(xì)胞整體細(xì)胞力學(xué)特性之間的差異。需要指出的是，在結(jié)合微針單細(xì)胞化學(xué)刺激精準(zhǔn)遞送及AFM細(xì)胞力學(xué)特性同步測(cè)量方面的研究還不多見(jiàn)。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不僅顯示了基于微針的單細(xì)胞精準(zhǔn)化學(xué)刺激的可行性（圖2～4），同時(shí)表明了結(jié)合微針和AFM可對(duì)培養(yǎng)皿中單個(gè)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行有效化學(xué)刺激并對(duì)刺激后的細(xì)胞力學(xué)特性進(jìn)行同步測(cè)量（圖5），為細(xì)胞力學(xué)特性研究提供了新的可能。

Fig.2 Effects of the size of micropipette tip on intracellular injection

Fig.3 Injecting blue ink into single cells by micropipette

Fig.4 The dynamic processes of injecting PI staining solution into single cells by micropipette

Fig.5 Single-cell PI staining solution delivery and simultaneous cell mechanics measurement based on the combination of micropipette and AFM

Fig.6 Single-cell chemotherapeutic drug（cytarabine）delivery and simultaneous cell mechanics measurement by combining micropipette and AFM

基于所建立的方法，本文研究了化療藥物刺激單個(gè)細(xì)胞過(guò)程中的細(xì)胞力學(xué)特性動(dòng)態(tài)變化。選取臨床腫瘤治療中廣泛使用的阿糖胞苷［50］作為化學(xué)藥物試劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激，并探測(cè)細(xì)胞在刺激前后力學(xué)特性變化。阿糖胞苷經(jīng)由核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白內(nèi)化至細(xì)胞內(nèi)部后轉(zhuǎn)化為三磷酸阿糖胞苷，隨后三磷酸阿糖胞苷在細(xì)胞核內(nèi)與DNA嵌合從而抑制DNA的復(fù)制和翻譯［51］。首先利用AFM在目標(biāo)MCF-7細(xì)胞（此時(shí)未被注射阿糖胞苷）表面獲取力曲線以測(cè)量細(xì)胞楊氏模量（圖6a），隨后控制裝載有阿糖胞苷溶液的微針對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行注射操作以將阿糖胞苷遞送到細(xì)胞內(nèi)部（圖6b）。最后再次控制AFM探針在目標(biāo)細(xì)胞表面獲取力曲線以監(jiān)測(cè)阿糖胞苷刺激后細(xì)胞力學(xué)特性變化（圖6c）。圖6d，e為阿糖胞苷刺激前在細(xì)胞表面獲取的典型力曲線及應(yīng)用Hertz-Sneddon理論模型對(duì)力曲線進(jìn)行擬合以得到細(xì)胞楊氏模量的結(jié)果。圖6f，g為阿糖胞苷刺激后在同一細(xì)胞表面獲取的典型力曲線及擬合結(jié)果?？梢钥吹綌M合曲線與壓痕曲線吻合，表明了Hertz-Sneddon理論模型的有效性。分別對(duì)10個(gè)MCF-7細(xì)胞進(jìn)行阿糖胞苷注射并對(duì)阿糖胞苷刺激前后細(xì)胞力學(xué)特性進(jìn)行測(cè)量（圖7）。圖中各個(gè)細(xì)胞的藥物注射前后楊氏模量值及測(cè)量時(shí)間間隔（從藥物注射到注射后楊氏模量測(cè)量之間的時(shí)間間隔）如表1所示?？梢钥吹娇傮w上阿糖胞苷被微針遞送至細(xì)胞內(nèi)部后，細(xì)胞楊氏模量減小，顯示了阿糖胞苷作用過(guò)程中細(xì)胞力學(xué)特性的動(dòng)態(tài)變化。微針注射已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)染［52］，單細(xì)胞人工細(xì)胞器遞送［53］，以及構(gòu)建基因編輯的小鼠胚胎模型［54］等。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了結(jié)合微針注射和AFM可以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞精準(zhǔn)化學(xué)激勵(lì)及細(xì)胞力學(xué)特性同步測(cè)量，對(duì)于單細(xì)胞生理活動(dòng)行為探測(cè)具有積極意義。需要指出的是微針注射本身有可能造成機(jī)械損傷，為了消除微針注射對(duì)細(xì)胞造成的損傷，可以采取微針與細(xì)胞接觸后依靠藥物分子的擴(kuò)散作用來(lái)進(jìn)行單細(xì)胞刺激［55］，但該方法的不足之處是藥物自由擴(kuò)散耗時(shí)，從而影響遞送效率。

Fig.7 Statistical histograms showing the Young’s modulus changes of individual MCF-7 cells after the injection of cytarabine

Table 1 Young’s modulus changes of MCF-7 cells after the injection of cytarabine

結(jié)合微針注射和AFM的單細(xì)胞精準(zhǔn)激勵(lì)以及力學(xué)特性同步測(cè)量將有助于研究細(xì)胞-藥物之間相互作用的內(nèi)在機(jī)理?，F(xiàn)有細(xì)胞-藥物之間相互作用的研究主要采用集群平均實(shí)驗(yàn)［56-58］，即將藥物分子加入到整個(gè)培養(yǎng)皿中，對(duì)培養(yǎng)皿中的所有細(xì)胞進(jìn)行刺激，并在培養(yǎng)一定時(shí)間后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析（如統(tǒng)計(jì)細(xì)胞存活率等），以評(píng)價(jià)藥物對(duì)細(xì)胞的作用效果。這種研究方式的不足之處是，研究結(jié)果僅僅反映了所有細(xì)胞對(duì)藥物響應(yīng)的平均行為，掩蓋了單個(gè)細(xì)胞或少數(shù)細(xì)胞的獨(dú)特響應(yīng)行為［59］。研究表明，細(xì)胞之間的異質(zhì)性在腫瘤治療及耐藥性等方面起著關(guān)鍵性的作用［60］。因此研究單個(gè)細(xì)胞的行為特性對(duì)于深入理解細(xì)胞生理行為及藥物作用機(jī)制等具有廣泛的基礎(chǔ)意義。特別是細(xì)胞力學(xué)特性在細(xì)胞生理病理變化過(guò)程中起著重要的指示作用［61］。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用微針直接對(duì)培養(yǎng)皿中單個(gè)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行超微量精準(zhǔn)化學(xué)刺激（圖2～4），并利用AFM對(duì)化學(xué)刺激下的細(xì)胞力學(xué)特性進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)（圖5～7），可以直觀地研究單個(gè)細(xì)胞在可控藥物作用下的響應(yīng)行為（如細(xì)胞力學(xué)特性動(dòng)態(tài)變化），在單細(xì)胞尺度為藥物作用機(jī)制提供新的認(rèn)識(shí)。需要指出的是，在利用微針將藥物溶液遞送至單個(gè)細(xì)胞時(shí)，通常情況下，藥物溶液的無(wú)色透明特征導(dǎo)致難以對(duì)注射進(jìn)細(xì)胞的藥物含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，可以在藥物溶液中加入熒光試劑［62］，根據(jù)熒光范圍對(duì)注射的藥物含量進(jìn)行標(biāo)定。

3 結(jié) 論

總結(jié)起來(lái)，本文基于微針和AFM實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)細(xì)胞的超微量精準(zhǔn)激勵(lì)及細(xì)胞力學(xué)特性同步測(cè)量，為單細(xì)胞力學(xué)特性研究提供了新的方法和技術(shù)，對(duì)于實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)高精度觀測(cè)細(xì)胞-藥物之間相互作用具有積極的意義。