6種中草藥抗菌作用實(shí)驗(yàn)研究

阿依德古力?哈德依汗 葉爾那爾?塔那布汗

中藥為中國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)特有藥物，具有無(wú)殘留、無(wú)污染等特點(diǎn)。幾千年以來(lái)，清熱解毒類(lèi)中藥在治療感染性疾病中發(fā)揮著重要的作用。據(jù)報(bào)道，中藥主要是通過(guò)干擾細(xì)菌的細(xì)胞壁合成、損傷細(xì)胞胞漿膜等來(lái)達(dá)到抑菌效果[62]。因而中藥的開(kāi)發(fā)研究是解決抑菌藥物發(fā)展的主要方向，也是對(duì)新型抗菌藥的研究及機(jī)理研究的熱點(diǎn)。本文以紙片法與試管法實(shí)驗(yàn)研究金銀花、白頭翁湯、黃連解毒湯等中草藥的抗菌作用，并比較兩種方法下的抑菌效果。

1.1 材料與方法

3.1.1 菌株來(lái)源

1、E. Coli O157：H7 標(biāo)準(zhǔn)菌株 菌號(hào)：CICC 21530中國(guó)工業(yè)微生物菌株保藏中心提供

2、金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 菌號(hào)：CICC 23656中國(guó)工業(yè)微生物菌株保藏中心提供

3、馬鏈球菌Ⅰ（620，來(lái)源于馬腺疫駒的膿汁，新源縣）新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室

4、馬鏈球菌Ⅱ（N15，來(lái)源于馬腺疫駒的膿汁，新源縣）新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室

3.1.2主要儀器

試管;培養(yǎng)皿;接種環(huán);酒精燈;打孔器;測(cè)量尺;德國(guó)Hettich高速離心機(jī);Eppendorf移液槍;Motic顯微鏡;上海梅特勒-托利多PL 303電子天平;北京光明XMTD-4000電熱恒溫水浴箱;北京廣營(yíng)GD 65-1型干烤箱;北京桑翌ST-T-160 AC空氣浴震蕩培養(yǎng)箱等?？諝庠≌袷幣囵B(yǎng)箱（型號(hào)MODEL：ST-F160AC）;SW-CJ-2F雙人雙面垂直潔凈工作臺(tái)（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)）。

3.1.3 實(shí)驗(yàn)藥物

金銀花、野菊花、蒲公英、紫花地丁、紫背天葵、黃連、黃柏、黃芩、梔子、連翹、秦皮、白頭翁均購(gòu)自新疆烏魯木齊東方康泰藥房。

3.1.4 藥物制備

稱(chēng)取藥材飲片黃連90g，加10倍水于煎藥鍋內(nèi)浸泡30min，用武火煮沸后文火煎煮30min，趁熱用紗布過(guò)濾，藥渣再加8倍水重復(fù)煎煮1次，合并2次濾液，布氏漏斗抽濾，濃縮濾液至0.25g/mL。其他藥物及方劑煎制方法相同，濃縮濾液至0.25g/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.1.5 菌液制備

挑取4 ℃ 斜面保存的E. coli O157：H7 標(biāo)準(zhǔn)菌株、黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、馬鏈球菌Ⅰ、馬鏈球菌Ⅱ分別在SMAC培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、5%綿羊血THB培養(yǎng)基上劃線(xiàn)培養(yǎng)12小時(shí)后，再挑取單個(gè)菌落于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃、180 r/min震蕩過(guò)夜培養(yǎng)。待細(xì)菌OD600 nm值達(dá)到0.6時(shí)，37 ℃存放備用。

3.1.6試驗(yàn)方法

3.1.6.1 紙片法

（l）將濾紙用打孔機(jī)打成直徑6mm的圓紙片，每100片放入一小瓶中，置于電熱恒溫干燥箱內(nèi)160℃干熱滅菌1-2小時(shí)。

（2）中藥的濃度：金銀花、連翹、黃連、黃連解毒湯、白頭翁湯、五味消毒飲等濃度均為0.25g/mL

（3）在無(wú)菌條件下，將50片藥物紙片放入要檢測(cè)的0.5mL抗菌藥物溶液里，置于4-8℃冰箱內(nèi)浸泡1-2小時(shí)。將浸有抗菌藥液的紙片攤平在培養(yǎng)皿中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)2-3小時(shí)干燥，或放在無(wú)菌室內(nèi)過(guò)夜干燥。

（4）用接種環(huán)取已制備好的菌液，均勻涂抹于培養(yǎng)基瓊脂平板上，等稍干燥后，用鑷子夾取各類(lèi)中藥紙片，將其平均分布于培養(yǎng)基瓊脂表面，各紙片中心相距24mm，紙片距平皿邊緣約15mm，蓋好平皿，放在37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18小時(shí)后觀(guān)察結(jié)果。

3.1.6.2試管法

（1）取無(wú)菌試管10支，排列于試管架上，各管中均加入營(yíng)養(yǎng)肉湯1mL。

（2）吸取配制好的抗菌藥物原液2.5mL加入第一管中，充分搖勻混合后吸出2.5mL移入第二管中，充分混合后，再由第二管移出2.5mL移入第三管中，充分混合，依次類(lèi)推，一直移到第九管，從第九管吸出2.5mL棄去。第十管不加抗菌液作為空白對(duì)照。

（3）然后向各管中加入制備好的菌液0.05mL，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時(shí)后觀(guān)察結(jié)果。觀(guān)察不同含量的藥物對(duì)細(xì)菌的抑制能力，以判定細(xì)菌對(duì)藥物的敏感度。

3.2結(jié)果

3.2.1 藥物紙片法結(jié)果判定

根據(jù)抗菌藥物紙片周?chē)鸁o(wú)菌區(qū)（抑菌區(qū)）的大小，測(cè)定其抗藥程度。因此，必須測(cè)量抑菌圈的直徑（包括紙片），按其大小，報(bào)告該株對(duì)某種藥物是否敏感：黃連，黃連解毒湯，五味消毒飲中藥用紙片法的馬鏈球菌抑菌圈的直徑都是18mm以上，對(duì)馬鏈球菌具有強(qiáng)抑制作用。金銀花，連翹中藥用紙片法的金黃色葡萄球抑菌圈的直徑都是18mm以上，對(duì)金黃色葡萄球有強(qiáng)的抑制作用白頭翁湯用紙片法的大腸桿菌抑菌圈的直徑都是18mm以上，對(duì)大腸桿菌有強(qiáng)的抑制作用。

3.2.2 試管法的結(jié)果判定

培養(yǎng)18小時(shí)后，凡無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物最高稀釋管中的稀釋度即為該菌對(duì)藥物的敏感度（表3，4，5）。若由于加入藥物（如中草藥）而使培養(yǎng)基變混濁，肉眼觀(guān)察不易判斷時(shí)，可進(jìn)行接種培養(yǎng)或涂片染色鏡檢判定結(jié)查。

3.3 討論

選取黃連解毒湯，五味消毒飲，黃連，金銀花，連翹，白頭翁等6種有顯著抑菌作用的中草藥及方劑對(duì)大腸桿菌，馬鏈球菌等4種臨床常見(jiàn)的致病菌進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)采用的紙片法和試管法，經(jīng)臨床實(shí)踐證明其常規(guī)應(yīng)用簡(jiǎn)便，具有良好的方法學(xué)特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黃連解毒湯，五味消毒飲，黃連等中藥對(duì)馬鏈球菌的抑菌效果為高敏，白頭翁湯對(duì)大腸桿菌的抑菌效果為高敏，金銀花和連翹對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果為高敏，本文以藥物抗菌實(shí)驗(yàn)試管法和試紙法研究其抑菌作并測(cè)得其最小抑菌濃度（MIC），為藥物在臨床上的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

姓名：阿依德古力·哈德依汗（1986-06），女，哈薩克族，新疆，獸醫(yī)師，碩士，研究方向：中獸醫(yī)、預(yù)防獸醫(yī)、臨床獸醫(yī)。