十字花科蔬菜中萊菔素與萊菔硫烷含量測定方法研究

蔡達(dá) 王玉濤 王文博

摘要：為快速、準(zhǔn)確定性定量十字花科蔬菜中的活性成分萊菔素與萊菔硫烷，本試驗(yàn)建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）同時(shí)測定蘿卜、西蘭花、白菜中萊菔素與萊菔硫烷含量的方法。采用水解-乙酸乙酯提取萊菔素和萊菔硫烷，WatersACQUITYUPLCBEHC18色譜柱（100mm ×2.1mm，1.7μm）分離，流動(dòng)相A為0.1%甲酸-水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫，質(zhì)譜采用電噴霧正離子（ESI+）電離，多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式（MRM）。萊菔素與萊菔硫烷在5～500μg/L濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，添加回收率分別在82.09% ～107.42%、89.79% ～105.55%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別在2.16% ～4.80%、1.52% ～4.96%，檢出限分別為0.5、0.4μg/L。該方法準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度均滿足定性定量分析的要求，可以準(zhǔn)確測定十字花科蔬菜中萊菔素和萊菔硫烷的含量。

關(guān)鍵詞：十字花科蔬菜;萊菔素;萊菔硫烷;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

中圖分類號：TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2022）01-0144-08

十字花科植物因花冠呈十字型而得名，屬于雙子葉植物綱，五椏果亞綱，白花菜目中的一科，約有388個(gè)屬，3700余種，現(xiàn)已被引種到世界各地。常見的十字花科蔬菜主要有蕓薹屬的白菜、西蘭花、甘藍(lán)，以及蘿卜屬的蘿卜等。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，十字花科蔬菜具有防癌抗癌的作用，隨著十字花科蔬菜攝入量的增加，可以明顯降低多種惡性腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，包括肺癌、肝癌、結(jié)腸癌等[1-4]，此外，十字花科蔬菜還有抗氧化、抗衰老、預(yù)防心腦血管疾病的功效[5-9]，具有重要的營養(yǎng)保健價(jià)值，備受廣大消費(fèi)者青睞。

與其它蔬菜相比，十字花科蔬菜突出的防癌抗癌功效主要?dú)w功于其含有大量的異硫氰酸酯類物質(zhì)，如萊菔素和萊菔硫烷等[10]。萊菔素[（4-異硫氰酸基-1-（甲基亞磺?；?1-丁烯，分子式C6H9NOS2）]和萊菔硫烷（1-異硫氰酸-4-甲磺?；⊥椋肿邮紺6H11NOS2）在化學(xué)結(jié)構(gòu)上僅相差一個(gè)雙鍵。目前發(fā)現(xiàn)，萊菔素主要來源于蘿卜，其在蘿卜種子中的含量高達(dá)7mg/g[11]，因此蘿卜又名萊菔。而萊菔硫烷主要來源于西蘭花及其種子[12]，在西蘭花花球、莖、葉片中的含量分別為1.782、0.436、0.204μmol/g[13]。已有研究表明，萊菔素和萊菔硫烷對結(jié)腸癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、前列腺癌和胃癌等均有明顯的抑制作用[14-20]，兩者還具有抗炎抑菌、提高機(jī)體抗氧化能力和免疫力等功能活性[21-23]。因此，萊菔素和萊菔硫烷含量被視為評價(jià)十字花科蔬菜品質(zhì)和營養(yǎng)保健價(jià)值的重要指標(biāo)。

萊菔素和萊菔硫烷檢測方法主要有化學(xué)滴定法、分光光度法、氣相色譜法、高效液相色譜法等[24-32]。其中，化學(xué)滴定法、分光光度法步驟繁瑣，檢測靈敏度較低;氣相色譜法在檢測過程中高溫會破壞萊菔素和萊菔硫烷的結(jié)構(gòu)，定量準(zhǔn)確度不高;高效液相色譜法僅以出峰時(shí)間定性，對這兩種分子結(jié)構(gòu)相近的物質(zhì)難以實(shí)現(xiàn)基線分離，無法同時(shí)定性定量檢測，且洗脫時(shí)間較長，檢測較為耗時(shí)。而超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLCMS/MS）準(zhǔn)確度和靈敏度較高，分析時(shí)間短，能同時(shí)測定十字花科蔬菜中的萊菔素和萊菔硫烷。目前國內(nèi)外相關(guān)研究主要集中在單獨(dú)測定萊菔素或萊菔硫烷方面[24-32]，尚未發(fā)現(xiàn)基于UPLC-MS/MS同時(shí)測定萊菔素和萊菔硫烷的研究報(bào)道。因此，本研究選擇具有代表性的樣品蘿卜、西蘭花、白菜作為研究對象，建立基于UPLC-MS/MS技術(shù)的十字花科蔬菜中萊菔素和萊菔硫烷含量分析方法，對于萊菔素和萊菔硫烷的快速、準(zhǔn)確檢測具有重要價(jià)值，同時(shí)可為十字花科蔬菜優(yōu)異種質(zhì)挖掘和異硫氰酸酯類活性成分產(chǎn)品開發(fā)及蔬菜產(chǎn)品營養(yǎng)品質(zhì)和保健功能提升提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

WatersACQUITYUPLC超高效液相色譜系統(tǒng)，美國Waters公司;ABSCIEXQTRAP5500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國ABSCIEX公司;高速冷凍離心機(jī)，北京京立離心機(jī)公司;RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，MS3渦旋混合器，勻漿機(jī)，德國IKA公司;FA2204分析天平，上海上平儀器有限公司;Milli-Q超純水機(jī)，美國Millipore公司。

1.2 試驗(yàn)材料與試劑

萊菔素標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%，美國Sigma公司;萊菔硫烷標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥95%，美國Sigma公司;乙腈、甲醇、乙酸乙酯，色譜純，美國Fisher公司;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取萊菔素和萊菔硫烷標(biāo)準(zhǔn)品各5.00mg，用甲醇溶解，分別轉(zhuǎn)移至5mL容量瓶中，定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為1000mg/L萊菔素和萊菔硫烷單標(biāo)儲備液，于-20℃避光保存。將標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇逐級稀釋成500、100、50、10、5μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 樣品制備

采用四分法分取樣品，取約200g新鮮樣品于勻漿機(jī)中勻漿均勻，編號，置于-20℃保存，備用。

1.5 萊菔素和萊菔硫烷的提取

稱取蔬菜勻漿樣品0.200g于50mL離心管中，分別加入3mLpH5.0的磷酸緩沖液、pH5.6的磷酸緩沖液、pH6.2的磷酸緩沖液、pH6.8的磷酸緩沖液，混勻，置于25℃水解1h，然后加入乙酸乙酯40mL，萃取30min，以4500r/min離心5min，取上層有機(jī)相，置于旋蒸瓶中，再重復(fù)萃取2次，合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用20mL甲醇水溶液（甲醇∶水=7∶3，V/V）定容，過0.22μm濾膜，待UPLC-MS/MS分析測定。

1.6 儀器測定條件

1.6.1 色譜條件 為優(yōu)化色譜條件，分別選用WatersACQUITYUPLCBEHC8色譜柱（100mm×2.1mm，1.7μm）、WatersACQUITYUPLCBEHC18色譜柱（100mm×2.1mm，1.7μm）和Symmetry300C18色譜柱（75mm×4.6mm，3.5μm）3種不同色譜柱。柱溫：40℃;流動(dòng)相A：0.1%甲酸-水溶液;流動(dòng)相B：乙腈;流速：0.3mL/min;進(jìn)樣體積：2.0μL;梯度洗脫程序如表1所示。

1.6.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）;正離子模式;離子源溫度（TEM）450℃;霧化氣壓力（GS1）89.6kPa;氣簾氣壓力（CUR）137.9kPa;電噴霧電壓（IS）5500V;駐留時(shí)間100ms。采用多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式（MRM），以獲取萊菔素與萊菔硫烷的最佳檢測條件。

1.7 定量分析

分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液上機(jī)測定，通過標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度與相應(yīng)的色譜峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以樣品溶液中萊菔素或萊菔硫烷的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而得到相應(yīng)的萊菔素或萊菔硫烷的濃度。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)平行測定3次，結(jié)果用均值表示。采用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

通過蠕動(dòng)泵恒流注射進(jìn)樣1mg/L的萊菔素和萊菔硫烷單標(biāo)溶液，分別進(jìn)行全掃描，得到準(zhǔn)分子離子。結(jié)果顯示，萊菔素和萊菔硫烷的母離子分別是m/z176.0、m/z178.1。之后分別對確定的母離子進(jìn)行子離子掃描，通過優(yōu)化碰撞能量，獲得二級特征碎片離子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，萊菔素的主要特征碎片離子為m/z112.0、m/z78.1，如圖1（a）所示。萊菔硫烷的主要特征碎片離子為m/z114.1、m/z72.0，如圖1（b）所示。在MRM模式下，優(yōu)化去簇電壓和碰撞能量，最終得到萊菔素和萊菔硫烷的監(jiān)測離子對和最佳參數(shù)，如表2所示。

2.2 色譜柱的選擇

試驗(yàn)結(jié)果顯示，WatersACQUITYUPLCBEHC18色譜柱（100mm ×2.1mm，1.7μm）分離效果明顯優(yōu)于另外兩種柱子，峰對稱性較好，具有良好的峰形和穩(wěn)定的柱效。因此，選擇C18（100mm ×2.1mm，1.7μm）作為分離色譜柱。

2.3 流動(dòng)相條件的選擇

由于甲醇和水比例接近1∶1時(shí)，混合溶液粘度大，色譜柱柱壓高，為降低柱壓，延長色譜柱使用壽命，故選擇乙腈和水作為流動(dòng)相，同時(shí)加入0.1%甲酸以改善峰形。梯度洗脫程序如表1時(shí)，萊菔素和萊菔硫烷的響應(yīng)值較高，峰形較好，基線穩(wěn)定，無雜質(zhì)干擾，且分析時(shí)間較短。萊菔素和萊菔硫烷標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液選擇離子色譜圖分別如圖2、圖3所示。

2.4 提取條件的選擇

萊菔素和萊菔硫烷的前體物質(zhì)硫代葡萄糖苷在不同pH條件下生成的水解產(chǎn)物不同，在中性偏酸性條件下，水解產(chǎn)物以異硫氰酸酯類為主，而萊菔素和萊菔硫烷均屬于該類物質(zhì)。有研究顯示，當(dāng)水解pH 為5左右時(shí)，萊菔素提取率最高[33]，而萊菔硫烷的最適pH一般在6～7之間[34]。本研究考察了不同水解pH值對提取效果的影響，如表3所示。結(jié)果表明，pH5.6條件下，萊菔素和萊菔硫烷的提取效果較好，且添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均可滿足定量分析的要求。

2.5 方法的線性范圍

以濃度為500、100、50、10、5μg/L的萊菔素和萊菔硫烷混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，繪制色譜峰面積對濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4）。在5～500μg/L濃度范圍內(nèi)，萊菔素和萊菔硫烷的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系均良好。

2.6 方法的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度

方法的準(zhǔn)確度和精密度通過添加回收試驗(yàn)進(jìn)行考察。在蘿卜、西蘭花、白菜中分別添加低、中、高3個(gè)濃度水平的萊菔素和萊菔硫烷標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度均做5個(gè)平行，進(jìn)行3水平5平行加標(biāo)回收試驗(yàn)。由表4可知，在1～60μg/g添加水平下，萊菔素添加平均回收率在82.09% ～107.42%之間，RSD為2.16% ～4.80%。由表5可知，在5～80μg/g添加水平下，萊菔硫烷添加平均回收率在89.79% ～105.55%之間，RSD為1.52% ～4.96%。

逐步稀釋樣品上機(jī)測定，以信噪比S/N≥3計(jì)算檢出限，萊菔素的檢出限為0.5μg/L，萊菔硫烷的檢出限為0.4μg/L。上述結(jié)果表明，回收率、精密度和靈敏度均滿足定性定量分析的要求。

2.7 實(shí)際樣品中萊菔素和萊菔硫烷的分析檢測

選取3種有代表性的十字花科蔬菜樣品蘿卜、西蘭花、白菜，按照上述已建立的方法進(jìn)行分析測定，結(jié)果如表6所示。蘿卜中的萊菔素含量較高，為38.59μg/g。西蘭花中的萊菔硫烷含量較高，為22.06μg/g，而萊菔素含量低于檢出限。白菜中的萊菔素和萊菔硫烷含量均相對較低。

3 討論

利用本試驗(yàn)建立的方法對實(shí)際樣品進(jìn)行分析檢測，發(fā)現(xiàn)蘿卜中的萊菔素含量較高，為38.59μg/g。萊菔素在蘿卜中的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它蔬菜，是蘿卜中主要的異硫氰酸酯類化合物[33]。華貝貝等[30]研究表明，不同產(chǎn)地、不同品種蘿卜中萊菔素含量存在顯著差異，萊菔素含量分布范圍為34～1447mg/kg。姚玉慶[31]對43個(gè)不同品種蘿卜中萊菔素含量進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其含量變化范圍為43.26～468.27μg/g。本研究中蘿卜樣品的萊菔素含量相對略低，可能與蘿卜品種、產(chǎn)地環(huán)境包括溫度、土壤條件、日照長短及強(qiáng)度等不同有關(guān)[35]。萊菔硫烷是西蘭花中最主要的異硫氰酸酯類物質(zhì)，本試驗(yàn)對西蘭花樣品的分析檢測表明，西蘭花中萊菔硫烷含量較高，為22.06μg/g，而萊菔素含量低于檢出限。楊杜等[36]對西蘭花中異硫氰酸酯進(jìn)行分析鑒定，也未檢出萊菔素。Liang等[37]分析發(fā)現(xiàn)西蘭花中萊菔硫烷的含量在1.4～32.9mg/kg之間;孔凡華等[32]研究顯示西蘭花中萊菔硫烷含量為每100g中3.86mg，與本研究測定結(jié)果大致相當(dāng)。對白菜樣品進(jìn)行分析檢測發(fā)現(xiàn)，白菜中的萊菔素和萊菔硫烷含量均較低，與廖永翠等[38]的研究結(jié)果一致。

國內(nèi)外關(guān)于萊菔素和萊菔硫烷檢測方法的研究報(bào)道主要集中在單獨(dú)測定萊菔素或萊菔硫烷方面[24-32]，目前僅發(fā)現(xiàn)1篇研究報(bào)道建立了HPLC法同時(shí)測定萊菔素和萊菔硫烷[39]。在該報(bào)道中，通過在流動(dòng)相中加入四氫呋喃，提高了萊菔素和萊菔硫烷的分離度，但是四氫呋喃會對色譜柱和儀器產(chǎn)生較為嚴(yán)重的損傷;此外，該方法洗脫時(shí)間較長，需要30min，檢測效率較低。尚未發(fā)現(xiàn)利用UPLC-MS/MS同時(shí)測定萊菔素和萊菔硫烷的研究報(bào)道。由于UPLC-MS/MS具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確度，且分析時(shí)間較短，因此在同時(shí)測定萊菔素和萊菔硫烷方面具有明顯的優(yōu)勢。對此，為了解決萊菔素和萊菔硫烷分析檢測中存在的問題，本研究首次建立了基于UPLC-MS/MS同時(shí)檢測十字花科蔬菜中萊菔素與萊菔硫烷含量的方法，可為十字花科蔬菜營養(yǎng)評價(jià)及育種研究提供技術(shù)支持。

4 結(jié)論

本研究建立了UPLC-MS/MS同時(shí)檢測十字花科蔬菜中萊菔素與萊菔硫烷含量的方法。確定色譜條件為WatersACQUTTYUPLCBEHC18色譜柱（100mm × 2.1mm，1.7μm），乙腈-（0.1%甲酸）水溶液作為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速0.3mL/min。質(zhì)譜采用ESI+模式，MRM掃描模式。萊菔素和萊菔硫烷在5～500μg/L濃度范圍內(nèi)均與峰面積具有良好的線性關(guān)系。萊菔素、萊菔硫烷的添加回收率分別為82.09% ～107.42%、89.79% ～105.55%，RSD分別為2.16% ～4.80%、1.52% ～4.96%。萊菔素、萊菔硫烷的檢出限分別為0.5、0.4μg/L。該方法前處理簡單、分析時(shí)間較短，準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度均滿足定性定量分析的要求，適用于十字花科蔬菜中萊菔素和萊菔硫烷含量的測定。