滲透脅迫對構(gòu)樹葉型以及葉片分布分形維數(shù)的影響*

龍 碩 張歡欣 錢志良 姚靖泓王洋文 劉禹含 孟 森 胡文濤

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院/廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗室，廣東 廣州 510642；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所/國家林業(yè)和草原局熱帶林業(yè)研究重點(diǎn)實(shí)驗室，廣東 廣州 510520）

構(gòu)樹Broussonetia papyrifera是?？芃oraceae構(gòu)屬Broussonetia落葉喬木，雌雄異株，樹可高達(dá)16 m，全株富含乳汁[1]，廣泛分布于我國。構(gòu)樹是綠化荒坡、荒山、荒灘以及鹽堿地的先鋒樹種，具有較強(qiáng)的速生性、適應(yīng)性及抗逆性等特點(diǎn)，可以富集重金屬元素和修復(fù)污染的環(huán)境[2]。

構(gòu)樹葉片具有異形葉性，可以分為裂缺葉和全緣葉兩種類型[3]。構(gòu)樹的葉型比例與年齡有關(guān)，構(gòu)樹成株以全緣葉為主，在幼株上表現(xiàn)出明顯的異葉形性[4]。慕軍鵬和陳紅利[3]針對構(gòu)樹的異葉形性進(jìn)行生態(tài)調(diào)查研究，表明裂缺葉抵抗病蟲害的能力更強(qiáng)。在其他植物裂缺葉的研究中，Zhang等[5]研究發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜Brassica napus的裂葉能提高群體的光合作用效率，而且可能與耐鹽性呈負(fù)相關(guān)；李雁玲[6]研究發(fā)現(xiàn)胡楊Populus euphratica3 種異形葉的光合特性不同，認(rèn)為可能與其適應(yīng)干旱、高溫等逆境脅迫有關(guān)；曾明[7]研究表明胡楊異形葉性是為提高自身在強(qiáng)光、高溫、干旱等不利環(huán)境中的生存能力和生產(chǎn)效率的適應(yīng)性策略。而在構(gòu)樹幼樹中，構(gòu)樹葉片缺裂是否與響應(yīng)滲透脅迫有關(guān)有待研究。由于環(huán)境脅迫會改變植物葉片分型[3]與分枝格局[8]，許多研究用分形維數(shù)來分析植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)[9-10]，而構(gòu)樹這種抗逆性較強(qiáng)的樹種是否因環(huán)境脅迫而發(fā)生葉型變化進(jìn)而改變?nèi)~片分布的分形維數(shù)鮮有報道。

環(huán)境脅迫能影響植物光合能力[11]，植物可以通過形態(tài)的改變，如葉型分化等提高獲取和利用資源的能力[3]，同時其內(nèi)在也有相關(guān)抗逆生理生化機(jī)制。研究表明，構(gòu)樹中含有多種黃酮物質(zhì)[12]，這類次生代謝產(chǎn)物對植物抵御逆境具有重要的作用[14]，且適度的干旱及鹽脅迫有利于黃酮類成分的合成積累[11]。擬南芥Arabidopsis thaliana、杭菊Chrysanthemum morifolium、葡萄Vitis vinifera等植物積累黃酮抵抗環(huán)境脅迫[15]。然而，不同類型滲透脅迫下構(gòu)樹黃酮積累的程度尚未報道。

干旱脅迫和鹽脅迫均不利于植物的生長，但構(gòu)樹能在一定程度上適應(yīng)這些逆境，表明構(gòu)樹中存在著某種抗逆機(jī)制，能削弱干旱脅迫和鹽脅迫的不利影響[2]。因此，本研究對構(gòu)樹幼苗進(jìn)行干旱脅迫和鹽脅迫處理，通過統(tǒng)計葉型、測定光合氣體參數(shù)和黃酮含量以及分析葉片分布的分形維數(shù)，以期探究滲透脅迫對構(gòu)樹葉型分化以及葉片分布分形維數(shù)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

構(gòu)樹，1 年生實(shí)生苗，苗高23.00±5.00 cm，地徑4.00±0.50 mm。采種于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園。供試基質(zhì)為蛭石和沙子按照1 ∶1 體積比混合。

1.2 試驗設(shè)計

采用盆栽方法，在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)板栗園溫室大棚內(nèi)進(jìn)行。2020 年9 月12 日將1 年生構(gòu)樹實(shí)生苗移栽至口徑21 cm×高16 cm 的塑料盆（底帶托盤），每盆定植1 株，每盆加2.475 kg 供試基質(zhì)。移栽入盆之后，保證每株苗的管理一致，緩苗期每株每2 天澆1 次100 mL Long Ashton 營養(yǎng)液[16]，共澆20 次。緩苗期間保持盆土濕潤。預(yù)實(shí)驗發(fā)現(xiàn)土壤保持75%左右田間持水量為一般正常生長情況，1 年生構(gòu)樹苗能存活的最低田間持水量為20%左右。緩苗48 d 后（10 月30 日），選取生長狀況相同的健康幼苗進(jìn)行干旱脅迫和鹽脅迫處理，盆栽構(gòu)樹苗共60 盆，分為對照組、鹽脅迫處理和干旱脅迫處理3 組，每組重復(fù)20 盆。一組正常水分處理（75%田間持水量）即為對照組，每隔1 天傍晚通過稱重法補(bǔ)足水分至75%田間持水量；二組干旱處理（20%田間持水量），每隔1 天傍晚通過稱重法補(bǔ)足水分至20%田間持水量；3組鹽脅迫處理（75%的田間持水量），每盆每隔1天澆100 mL100 mM NaCl 溶液，同時每隔1 天傍晚通過稱重法補(bǔ)足水分至75%田間持水量，并將花盆托中的水溶液倒回盆中以防止處理鹽分的流失；鹽脅迫共處理10 次。2020 年12 月13 日進(jìn)行摘葉處理。

于2021 年4 月21 日統(tǒng)計葉型（全緣、淺裂、深裂），拍照后統(tǒng)計并計算構(gòu)樹葉片分布分形維數(shù)，測定構(gòu)樹葉片的光合氣體參數(shù)，最后從3 組處理里各取7 盆，每處理分開取成熟葉和老葉，分別殺青烘干粉碎后測總黃酮含量。試驗在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)板栗園溫室大棚內(nèi)完成，試驗地屬海洋性亞熱帶季風(fēng)氣候，實(shí)驗觀測期間，正午有效光強(qiáng)180～360 μmol·m-2·s-1，光照時間12～14 h/d，廣州年平均溫度為22 ℃，相對濕度為50%～90%。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 光合氣體參數(shù)的測定 用Li-6400 便攜式光合儀（LI-COR，USA）測定各處理組的光合作用參數(shù)；每株選取植株頂端下數(shù)第3～5 片功能葉，在天氣晴朗無云的上午9：00—11：00 時進(jìn)行測定，每處理測定7～10 片葉，待其示數(shù)穩(wěn)定后，每葉片連續(xù)手動測定4 個數(shù)值，取平均值；測定時用紅藍(lán)光源葉室（2 cm×3 cm），光強(qiáng)為600 μmol·m-2·s-1；測定：凈光合速率（photosynthetic rate，Pn）、氣孔導(dǎo)度（stomatal conductance，Gs）和胞間CO2濃度（intercellular CO2concentration，Ci）。

1.3.2 構(gòu)樹葉型的測定 建立構(gòu)樹葉片分型的等級指標(biāo)（全緣葉、淺裂葉、深裂葉），統(tǒng)計3 組處理中每株各葉型葉片數(shù)量占比，每組處理統(tǒng)計10盆。其中，未裂到半個葉片1/2 寬度的為淺裂葉、裂到半個葉片1/2 寬度的為深裂葉。1.3.3 分形維數(shù)的測定 3 組處理每組拍攝7 株，相機(jī)固定拍攝高度，沒有傾角，從正面水平拍攝和正上方垂直拍攝，分別記為正視圖和俯視圖，再用Photoshop 軟件對每張圖片進(jìn)行處理，采用網(wǎng)格法對正視圖和俯視圖進(jìn)行覆蓋。即在圖上確定一個正方形邊框，將圖片框在邊框內(nèi)，然后將正方形邊框每邊的邊長2 等分，這時得到4 個小正方格子，記數(shù)此時覆蓋到葉片分布的格子數(shù)，之后一直沿用此法劃分、覆蓋下去（每1 次都將上1 次形成的格子邊長2 等分），能夠分別得到每1 個格子邊長時對應(yīng)的非空格子數(shù)（覆蓋到分枝結(jié)構(gòu)的格子數(shù)）；劃分次數(shù)的確定是依據(jù)本實(shí)驗研究對象劃分為5 級；分枝格局的分形維數(shù)采用計盒維數(shù)（Box-counting dimension）公式進(jìn)行計算；其中D為分形維數(shù)，N(ε)為邊長為ε 時的非空格子數(shù)，ε 為對應(yīng)的格子邊長；在實(shí)際操作中，一般不求算當(dāng)ε →0（格子邊長趨于0 時的極限值，而是在雙對數(shù)坐標(biāo)下，對獲得的一系列成對的非空格子數(shù)N(ε)和格子邊長ε 值進(jìn)行線性回歸，所得擬合方程斜率的絕對值是分形維數(shù)的近似估計）[17]。

1.3.4 總黃酮含量的測定 采用代容春等的總黃酮提取以及分光光度法測定黃酮含量。即3 組處理，每處理隨機(jī)取7 盆；每盆取成熟葉和老葉，從主脈處剪斷；分別殺青烘干研磨后稱重；取0.1 g 研磨后的葉片粉末（不足0.1 g 取最大量）裝入15 mL 離心管中，按1：100 加入35%乙醇，80°C 水浴加超聲波40 KHz 處理45 min，共2 次，期間搖勻1 次；放入制冰機(jī)中，靜置沉淀，放置15 小時左右；取沉淀后的上清液0.1 mL 加入5 mL EP 管，加入0.9 mL35%乙醇，搖勻，加入5%NaNO2溶液60 μL，放置6 min；加入10% Al(NO3)3溶液60 μL，放置6 min；加入1 M NaOH溶液0.8 mL，搖勻，放置15 min 后取200 μL（做3 個平行重復(fù)）在510 nm 波長處測定吸光值。與此同時，建立蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算總黃酮的含量[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 19（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Duncan 檢驗法檢測差異顯著性，用Photoshop 軟件統(tǒng)計非空格子數(shù)，Excel 進(jìn)行曲線回歸和制作葉型堆積圖，使用SigmaPlot 14.0（Systat Software Inc, San Jose, CA, USA）繪 圖。

2 結(jié)果分析

2.1 脅迫對構(gòu)樹葉片的胞間CO2 濃度、氣孔導(dǎo)度、凈光合速率的影響

干旱脅迫與鹽脅迫都顯著降低了構(gòu)樹葉片胞間CO2濃度、凈光合速率與葉片氣孔導(dǎo)度，其中葉片氣孔導(dǎo)度變化量最大（圖1）。相較于對照組，干旱脅迫與鹽脅迫的構(gòu)樹葉片胞間CO2濃度、氣孔導(dǎo)度和凈光合速率分別顯著下降了23.41%與41.16%、62.50% 與69.72%、16.43% 與17.60%，且兩種脅迫處理間的差異并不顯著。但是胞間二氧化碳濃度在3 個處理間均產(chǎn)生了顯著性差異，其中鹽脅迫處理較對照和干旱脅迫分別下降了29.16%和12.57%。

圖1 3 組處理對構(gòu)樹葉片的胞間CO2 濃度、氣孔導(dǎo)度和凈光合速率的影響Fig. 1 Effects of three treatments on intercellular CO2 concentration, stomatal conductance and photosynthetic rate of B.papyrifera leaves

2.2 脅迫對構(gòu)樹3 種葉型數(shù)量的影響

干旱脅迫和鹽脅迫對全緣葉和淺裂葉的數(shù)量占比無顯著影響。兩種脅迫使深裂葉的占比增加，其中鹽脅迫較對照組和干旱脅迫的深裂葉數(shù)量占比顯著增加（P＜0.05），分別增加了58.96%和45.52%。但對照組和干旱脅迫間無顯著差異（圖2，表1）。

表1 3 種處理對構(gòu)樹的3 種葉型葉片數(shù)量占比 %Table 1 Effects of three treatments on B. papyrifera leaves’ quantity ratio of three leaf types

圖2 不同處理下3 種葉型的構(gòu)樹葉片占比Fig. 2 The proportion of B. papyriferal leaves of three leaf types under three groups of treatments

2.3 脅迫對構(gòu)樹的分形維數(shù)的影響

在正視圖中，干旱脅迫和鹽脅迫顯著增加了構(gòu)樹葉片的分形維數(shù)，較對照組分別提高了7.90%和11.58%。在俯視圖中，鹽脅迫處理組較對照組和干旱脅迫的分形維數(shù)增大，但沒有顯著差異。

2.4 脅迫對構(gòu)樹葉片中黃酮總含量的影響

在3 組處理中，干旱脅迫和鹽脅迫均使構(gòu)樹成熟葉和老葉的黃酮總含量下降，各處理下老葉的黃酮含量均高于成熟葉，且在對照組中差異顯著。對于老葉，鹽脅迫的黃酮含量顯著低于對照組和干旱脅迫的黃酮含量，分別降低了17.85%，11.46%。而在成熟葉中，長期干旱脅迫和鹽脅迫處理均使葉片黃酮含量降低，但無顯著差異。

3 討論與結(jié)論

圖3 干旱脅迫和鹽脅迫對構(gòu)樹的分形維數(shù)的影響Fig. 3 Effects of drought stress and salt stress on fractal dimension of B. papyrifera

圖4 干旱脅迫與鹽脅迫對構(gòu)樹葉片內(nèi)黃酮含量的影響Fig. 4 Effects of drought stress and salt stress on flavonoids content in B. papyrifera leaves

干旱脅迫和鹽脅迫能顯著降低植物葉片的凈光合速率，導(dǎo)致植物生長受到抑制[19-20]。本研究表明干旱脅迫和鹽脅迫顯著降低了構(gòu)樹幼苗的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和胞間CO2濃度。這與多數(shù)干旱脅迫下植物光合作用的研究結(jié)果類似[21-22]，其中葉片光合速率降低與氣孔的部分關(guān)閉和葉肉細(xì)胞光合活性下降有關(guān)[23]。本研究中鹽脅迫抑制了植物光合作用，這與聞志剛用0～300 mM 中7 個梯度的鹽濃度處理發(fā)現(xiàn)構(gòu)樹葉片凈光合速率均顯著降低的研究結(jié)果一致[24]，表明鹽脅迫顯著降低了構(gòu)樹幼苗的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和胞間CO2濃度。因此，推斷鹽脅迫可能影響氣孔導(dǎo)度，從而使凈光合速率降低。本研究中鹽脅迫處理的土壤NaCl 含量為2.36 g/kg，所得結(jié)果與丁菲等[25]研究中構(gòu)樹幼苗的凈光合速率在土壤NaCl 含量大于2 g/kg 時顯著降低的結(jié)果一致。因此，本研究中的干旱脅迫和鹽脅迫對構(gòu)樹造成了逆境脅迫，抑制了其光合作用。

在長期的進(jìn)化中，植物為減輕干旱脅迫和鹽脅迫等滲透脅迫的危害而進(jìn)化出了一些保護(hù)機(jī)能[26]。植物為了適應(yīng)環(huán)境脅迫也會做出相應(yīng)的調(diào)節(jié)來減少水分散失，如比葉面積變小、葉片退化為針刺狀等[27-28]。本研究表明，干旱脅迫和鹽脅迫導(dǎo)致構(gòu)樹葉片深裂增多，鹽脅迫更顯著增加構(gòu)樹深裂葉比例。這與茍蓉等[29]的研究中提出構(gòu)樹減小葉面積和使淺裂葉片增多應(yīng)對干旱脅迫略有不同，可能與空氣濕度或光照強(qiáng)度等相關(guān)。同時，本研究也表明構(gòu)樹受到干旱脅迫和鹽脅迫時，通過改變?nèi)~型、減小葉面積即增加淺裂葉和深裂葉的數(shù)量來適應(yīng)環(huán)境的變化。

除了植物單個葉片發(fā)生葉型改變外，植物整體生長與葉片分布狀況也會響應(yīng)外部條件而發(fā)生適應(yīng)性改變[30-31]。植物可以通過使葉片向上伸展或向下彎曲以調(diào)整位置，最大程度獲取光能[32]。本研究結(jié)果表明，干旱脅迫和鹽脅迫均使構(gòu)樹俯視圖的分形維數(shù)較對照組有一定增加，而這兩種脅迫均使構(gòu)樹正視圖的分形維數(shù)顯著增加。這表明干旱脅迫與鹽脅迫均影響了構(gòu)樹莖干上葉片的形態(tài)或分布位置，并最終導(dǎo)致分形維數(shù)出現(xiàn)變化。分形維數(shù)數(shù)值可反映植物占據(jù)生態(tài)空間的能力，分形維數(shù)值高，植物占據(jù)生態(tài)空間的能力強(qiáng)[8]。顏揚(yáng)杰等[33]針對紅楓Acer palmatum‘Atropurpureum’的研究中發(fā)現(xiàn)紅楓在向陽方向的分形維數(shù)普遍略大于背陽方向，其認(rèn)為植物會在向陽方向上占據(jù)更多的空間區(qū)域以獲得更多能量。結(jié)合兩種滲透脅迫導(dǎo)致構(gòu)樹葉片光合速率降低以及葉片深裂變多，本研究結(jié)果推測構(gòu)樹通過提高自身占據(jù)空間的有效程度，即提高葉片分布的分形維數(shù)，來確保得到盡可能多的光能以適應(yīng)滲透脅迫。

植物為響應(yīng)逆境脅迫可以通過形態(tài)的改變，如葉型分化等提高獲取和利用資源的能力[3]，同時其內(nèi)在也有相關(guān)抗逆的生理生化機(jī)制。植物面對環(huán)境脅迫會產(chǎn)生黃酮類物質(zhì)，保護(hù)植物組織免受脅迫損傷[34-35]，適度干旱脅迫與鹽脅迫均能增加植株葉片中的黃酮含量[36-37]。而本研究中干旱脅迫的黃酮含量與對照組無顯著差異，這可能與構(gòu)樹較強(qiáng)的抗逆性及其葉片成熟程度有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)黃酮在老葉中含量均大于在成熟葉中含量，與枇杷Eriobotrya japonica葉中黃酮含量隨葉片生長時間增加而遞增類似[38]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)受到鹽脅迫的構(gòu)樹老葉中的黃酮含量顯著低于對照組的老葉，可見鹽脅迫抑制了黃酮在老葉中的積累。植物在耐受逆境時會保護(hù)幼嫩組織，植物中的可移動資源包括部分水分、礦質(zhì)元素、可溶性糖和可溶性蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)會從老葉移動到嫩葉，以及光合作用的減緩等[39-40]，同時加速老葉衰老死亡。結(jié)合本研究結(jié)果，鹽脅迫減少黃酮在老葉中的積累，可能是為加快老葉衰老，將可循環(huán)代謝物傳遞給新生組織。結(jié)合以上的結(jié)果，構(gòu)樹可能是為減小鹽脅迫對黃酮積累的抑制，通過增加占據(jù)空間的有效程度來適應(yīng)滲透脅迫的土壤環(huán)境。

本研究中干旱脅迫和鹽脅迫均降低了兩年生構(gòu)樹幼苗葉片的氣孔導(dǎo)度和胞間CO2，抑制構(gòu)樹的凈光合作用（圖5），從而阻礙構(gòu)樹生長。兩年生構(gòu)樹幼苗為應(yīng)對干旱脅迫和鹽脅迫對其光合生理造成的損傷，其自身通過調(diào)整葉型和葉片生長分型來彌補(bǔ)光合缺陷，即表現(xiàn)為深裂葉增多，通過減小葉面積適應(yīng)環(huán)境；葉片分布的正視圖和俯視圖的分形維數(shù)變大（圖5），即構(gòu)樹葉片在水平面和垂直面的覆蓋程度變大，以用有限的葉面積更充分地利用光進(jìn)行光合作用。與此同時，鹽脅迫顯著降低了黃酮在構(gòu)樹幼苗老葉中的積累（圖5），說明鹽脅迫極大地?fù)p傷了構(gòu)樹幼苗的抗逆生理，這可能與鹽脅迫顯著增加葉片分布的分形維數(shù)來彌補(bǔ)生理保護(hù)有關(guān)。本研究的結(jié)果為干旱脅迫和鹽脅迫下構(gòu)樹幼苗響應(yīng)逆境的葉片分型和葉片分布的分形維數(shù)的變化提供一定借鑒，其內(nèi)在機(jī)制還需通過更全面的葉片分型生理代謝通路來進(jìn)行探究。

圖5 干旱脅迫和鹽脅迫對構(gòu)樹的光合氣體參數(shù)、分形維數(shù)和黃酮含量的整體影響模擬Fig. 5 Overall impact simulation diagram of drought stress and salt stress on photosynthetic gas exchange parameters, fractal dimension, flavonoids content of B. papyrifera