免疫檢查點抑制劑治療結(jié)直腸癌的療效及腸道菌群對其療效影響的研究進展

王藝潔，張港瑋，徐超，姚慶華,4

0 引言

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球第三大常見的癌癥，全球每年約有70萬人死于CRC[1]。多數(shù)患者被發(fā)現(xiàn)時已處于晚期轉(zhuǎn)移階段。晚期CRC患者5年生存率僅為13.5%[2]。如果不進行治療，生存期通常為6～12個月[3]。目前，晚期轉(zhuǎn)移性CRC標準治療方法包括全身化療、分子靶向治療和手術(shù)治療。其中，全身化療仍是治療晚期轉(zhuǎn)移性CRC的最主要方法，但化療的不良反應(yīng)大且有耐藥現(xiàn)象的發(fā)生。近年來，免疫治療領(lǐng)域取得了快速發(fā)展，免疫檢查點抑制劑（immune checkpoints inhibitors,ICIs），包括程序性死亡受體1（programmed cell death-1,PD-1）/程序性死亡-配體1（programmed death-ligand 1,PD-L1）抑制劑及抗細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4）等具有代表意義的免疫治療藥物越來越多被應(yīng)用于臨床。免疫治療是現(xiàn)階段抗腫瘤治療的熱點，ICIs治療CRC正處于探索階段，尚缺乏有效的療效預(yù)測生物標志物。在腫瘤免疫治療的應(yīng)答中，腸道菌群（gut microbiome）被證實有一定的調(diào)節(jié)作用，部分細菌可通過免疫系統(tǒng)或機體代謝功能來影響ICIs的療效。本文將圍繞免疫檢查點抑制劑、腸道菌群與CRC之間的關(guān)聯(lián)，腸道菌群如何影響免疫檢查點抑制劑治療CRC的療效，及通過干預(yù)影響腸道菌群進而提升ICIs療效等方面進行綜述。

1 免疫檢查點抑制劑

1.1 免疫檢查點抑制劑

PD-1又稱CD729，是一種共抑制T細胞受體（TCR），在腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment,TME）中通過與其同源配體結(jié)合發(fā)揮作用[4]。它在T細胞、B細胞、巨噬細胞、樹突細胞（dendritic cells,DCs）和自然殺傷細胞（natural killer cell,NK）等細胞中表達[5]。PD-1含有288個氨基酸跨膜蛋白，由細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白超家族結(jié)構(gòu)域組成。其中，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包含兩個基于酪氨酸免疫受體，一個活化基序和一個抑制基序，負責信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。PD-L1是PD-1的主要配體，又稱B7-H1、CD274，是B7配體家族的1型跨膜糖蛋白，可表達于T細胞、B細胞、單核細胞和某些非造血干細胞[6]。PD-1在正常組織中表達可以保護正常組織免受細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte）的攻擊，進而預(yù)防自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[7]。然而，當腫瘤細胞識別到T細胞上的PD-1時，腫瘤細胞會上調(diào)PD-1的配體PD-L1的表達。PD-L1與PD-1隨之相互結(jié)合，促使細胞內(nèi)酪氨酸的抑制和轉(zhuǎn)換基序發(fā)生磷酸化，磷酸化后的酪氨酸基序與SHP-1和SHP-2結(jié)合，降低了T細胞分化的作用，分化變差的T細胞在TME內(nèi)發(fā)出免疫抑制信號[8-9]。PD-1受體被信號激活后，通過負反饋途徑使TCR/BCR受到抑制，減少了免疫細胞因子的產(chǎn)生。此外，它還會損害B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）和B細胞淋巴瘤-xL（Bcl-xL）等抗凋亡蛋白產(chǎn)生。PD-1的過度表達最終導(dǎo)致T細胞衰竭，減少干擾素γ（IFN-γ）的產(chǎn)生，導(dǎo)致細胞毒性增加[10-11]。因此，PD-1與PD-L1之間的相互作用是被各種惡性腫瘤利用的免疫逃逸機制，是大多數(shù)惡性腫瘤預(yù)后不良的標志物。

免疫治療意義在于逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫抑制并激活抗腫瘤反應(yīng)[12]。抑制PD-1/PD-L1的功能有助于恢復(fù)T細胞功能，其關(guān)鍵是阻斷PD-1/PD-L1通路的抗體[13]。免疫檢查點抑制劑主要以PD-1和CTLA-4途徑，通過阻斷PD-1和CTLA-4與其配體的結(jié)合，T細胞被活化和增殖，導(dǎo)致T細胞介導(dǎo)的腫瘤T細胞浸潤，最終抑制腫瘤[14]。

1.2 免疫檢查點抑制劑的臨床應(yīng)用

研究證實，晚期CRC中表現(xiàn)為錯配修復(fù)缺陷/高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（dMMR/MSI-H）狀態(tài)的患者對ICIs更敏感，具有較為客觀及持續(xù)的臨床反應(yīng)，但此類狀態(tài)患者僅占所有結(jié)直腸癌患者的3%～6%[15]。目前，僅Pembrolizumab、Nivolumab以及Nivolumab聯(lián)合Ipilimumab三種免疫檢查點抑制劑被美國食品和藥物管理局（FDA）批準用于進展的dMMR/MSI-H轉(zhuǎn)移性CRC病例。

Overman等[16]的一項多中心、非隨機的Ⅱ期臨床試驗NCT02060188，入組74例患者中，大多數(shù)（54%）曾接受過3線以上的治療方案。患者每2周接受3 mg/kg的Nivolumab治療，客觀緩解率為31%，69%的患者疾病期控制超過12周，12個月總生存率為73%。此外，他們發(fā)起的另一項臨床試驗NCT02060188[17]，入組119例患者，其中76%的患者經(jīng)2線標準治療失敗后，接受Nivolumab 3 mg/kg聯(lián)合Ipilimumab 1 mg/kg方案治療，每3周一次，連續(xù)4次，此后行Nivolumab 3 mg/kg治療，每2周一次，結(jié)果顯示，客觀緩解率為55%，12周疾病控制率達80%，12個月無進展生存率為71%，32%的患者發(fā)生3～4級不良反應(yīng)，均可控。研究證實Nivolumab和Nivolumab聯(lián)合Ipilimumab治療方案均顯示出較好的有效性，且安全性可控。Le等[18]的一項PembrolizumabⅡ期開放性臨床試驗NCT02460198，入組124例接受氟嘧啶類、奧沙利鉑和伊利替康治療失敗的進展期轉(zhuǎn)移性dMMR/MSI-H狀態(tài)CRC患者，其中61例為2線標準治療失敗者（A組），63例為1線標準治療失敗者（B組），予Pembrolizumab 200 mg治療，每3周一次，最長維持2年，至疾病進展或無法耐受而停藥。結(jié)果顯示，A組隨訪31個月，B組隨訪24個月，客觀緩解率均為33%，此時，兩組中位反應(yīng)時間均未達到。該研究證實了Pembrolizumab的有效性。目前，研究者仍在繼續(xù)觀察ICIs治療轉(zhuǎn)移性CRC的有效性及安全性，Andre等發(fā)起了一項有關(guān)Pembrolizumab的開放性Ⅲ期臨床試驗NCT02563002[19]，將307例從未接受過治療的轉(zhuǎn)移性dMMR/MSI-H狀態(tài)CRC患者隨機平均分為兩組，一組為每3周接受劑量為200 mg Pembrolizumab的治療方案，另一組方案為每2周接受基于5-Fu（聯(lián)合或不聯(lián)合貝伐單抗或西妥昔單抗）的化療。結(jié)果顯示，Pembrolizumab方案的PFS優(yōu)于5-Fu化療方案（16.5月vs.8.2月）。隨訪24個月后，Pembrolizumab方案組仍有83%的患者存在持續(xù)性反應(yīng)，而5-Fu化療組僅有35%的患者存在持續(xù)性反應(yīng)。此外，Pembrolizumab方案3級以上不良反應(yīng)發(fā)生率為22%，明顯低于5-Fu化療組（66%）。Andre等[20]另一項臨床試驗NCT02563002，主要是針對Pembrolizumab單藥治療未接受過其他治療的轉(zhuǎn)移性dMMR/MSI-H CRC患者，與化療組相比Pembrolizumab治療組患者的健康相關(guān)生命質(zhì)量有所改善。

到目前為止，只有PD-1抑制劑和CTLA-4抗體被批準應(yīng)用于臨床，因此，仍需要更多的臨床試驗進一步探索CRC患者能否在ICIs中獲益，及ICIs使用時的安全性是否可控。

2 腸道菌群對免疫檢查點抑制劑治療結(jié)腸癌療效的影響

2.1 腸道菌群與結(jié)直腸癌的關(guān)系

腸道菌群是存在于人體內(nèi)的正常微生物群體。腸道菌群失調(diào)將導(dǎo)致腸道微生物群組成紊亂，進一步改變機體的生理功能，導(dǎo)致各種疾病[21]。腸道菌群被認為與CRC發(fā)生、進展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。已有研究證實了牛鏈球菌、脆弱擬桿菌、糞腸球菌、大腸桿菌、具核梭桿菌等在CRC的發(fā)生中起促進作用[22-23]。Yang等[24]發(fā)現(xiàn)具核梭桿菌通過激活Toll樣受體（toll-like receptor,TLR）將髓樣分化因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至核因子κB（NFκB），過度活躍的NFκB與miR21的啟動子結(jié)合并增加其轉(zhuǎn)錄水平，上調(diào)miR21的表達，促進了小鼠CRC細胞增殖和腫瘤進展。而脆弱擬桿菌則是通過產(chǎn)生腸毒素進而刺激促炎因子IL-18的產(chǎn)生，誘發(fā)炎性反應(yīng)。此外，其還可清除鈣黏蛋白E（E-cadherin）干擾上皮穩(wěn)態(tài)，促進結(jié)腸上皮的增生，最終導(dǎo)致CRC的發(fā)生[25]。不同的菌群促發(fā)結(jié)直腸癌的機制存在差別，但都說明了機體的腸道微生態(tài)穩(wěn)態(tài)被破壞是CRC發(fā)生發(fā)展的原因之一，腸道菌群也可能在CRC治療中參與某些反應(yīng)，影響治療的結(jié)局。

2.2 腸道菌群對免疫檢查點抑制劑治療結(jié)直腸癌療效的影響

CRC患者腸道菌群明顯紊亂，其主要特點是菌群豐度和多樣性改變[26]。腸道菌群與CRC預(yù)后相關(guān)聯(lián)，腸道菌群能否作為有效的預(yù)測性生物標志物及提升ICIs治療的有效性成為研究者攻克的方向。Zhang等[27]對PD-1抑制劑治療CRC的效果是否受腸道菌群的影響進行了證實，該研究使用廣譜抗生素耗竭小鼠腸道內(nèi)源性菌群，結(jié)果導(dǎo)致PD-1抑制劑對腫瘤的抑制效果降低，表明PD-1抑制劑控制小鼠腫瘤生長的效果很大程度上依賴于腸道菌群的多樣性。在此之后，該研究者又鑒定出在腫瘤免疫治療反應(yīng)良好的小鼠中乳桿菌顯著增加。于是，他們將通過篩選分離出的副乳桿菌株作用到腸道菌群缺乏的小鼠中，發(fā)現(xiàn)小鼠的抗PD-1治療仍保持了控制腫瘤生長的效果，且主要器官中沒有發(fā)現(xiàn)形態(tài)或病理性損害。其機制可能是副乳桿菌通過誘導(dǎo)腫瘤細胞表達趨化因子CXCL10，進而促進CD8+T細胞向瘤床的募集[28]。一項招募了74例接受PD-1/PD-L1抑制劑治療的晚期消化道腫瘤患者的研究，對免疫治療期間入組患者的糞便進行了測序，發(fā)現(xiàn)不同消化道腫瘤類型中真細菌、乳桿菌和鏈球菌與PD-1/PD-L1抑制劑的治療反應(yīng)呈正相關(guān)。除上述三種菌群外，與CRC免疫治療獲益相關(guān)的菌群還包括藍綠藻菌、毛螺菌、瘤胃菌和小桿菌，而擬桿菌、糞球菌等在治療反應(yīng)差的患者腸道中富集[29]。另有研究表明，PD-1抑制劑的較好療效與高豐度的普雷沃菌屬、狄氏副擬桿菌、嗜黏蛋白阿克曼菌等有關(guān)，而高豐度的擬桿菌屬可能是PD-1抑制劑治療CRC無效的原因之一[30]。Xu等[31]認為腸道菌群通過改變代謝水平使PD-1抑制劑治療效果不同，如嗜黏蛋白阿克曼菌通過影響甘油磷脂合成代謝來維持PD-1抗體的功效，進而增強抗腫瘤反應(yīng)。而擬桿菌則會增加慢性炎性反應(yīng)，從而導(dǎo)致免疫功能受損。Yoon等[32]觀察到，與單獨接受PD-1抑制劑相比，PD-1抑制劑聯(lián)合短雙歧桿菌顯著提高了小鼠CD8+T細胞水平和CD8+/Treg比值，且干擾素-γ和白介素IL-2（IL-2）的表達升高更多，由此證明，短雙歧桿菌不僅可通過增強淋巴細胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫來體現(xiàn)抗腫瘤作用，還可依賴腸道-全身-腫瘤途徑調(diào)節(jié)細胞因子以抵抗腫瘤。Mager等[33]發(fā)現(xiàn)假長雙歧桿菌、約氏乳桿菌、歐陸森氏菌3種細菌可提高ICIs對小鼠CRC模型的療效，其中，假長雙歧桿菌通過產(chǎn)生代謝產(chǎn)物肌苷增強免疫治療反應(yīng)，這種作用依賴于T細胞中特異性的腺苷A2A受體（A2AR）信號通路促進輔助性T細胞1（Th1）活化與免疫治療共同產(chǎn)生效力。ICIs治療結(jié)直腸癌患者無效通常是由于T細胞對腫瘤的不良滲透所致[34]。Montalban-Arques等[35]對T細胞相關(guān)腫瘤免疫進行了研究，觀察發(fā)現(xiàn)增加了經(jīng)四種梭狀芽胞桿菌混合物（clostridiales strains,CC4）灌胃的CRC模型小鼠腫瘤組織中CD8+T細胞向腫瘤組織的滲透，CC4單獨或其與抗PD-1聯(lián)合治療清除了幾乎所有腫瘤細胞，研究者推測，PD-1抑制劑與CC4相結(jié)合的治療方法可能會對CRC的治療產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，因此，梭狀芽胞桿菌可能與CRC免疫治療取得較好療效存在相關(guān)性。

2.3 干預(yù)腸道菌群對免疫檢查點抑制劑治療結(jié)直腸癌療效的影響

有研究者從健康人體中分離出11株能在腸道中誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素γ、CD8+T細胞的細菌菌株，發(fā)現(xiàn)它們能增強對單核細胞增生性李斯特菌的抵抗力，聯(lián)合ICIs能有效地抑制腫瘤生長[36]。Song等[37]使用多粘菌素B（PMB）清除了腸道中的革蘭氏陰性菌，改善了免疫抑制微環(huán)境，增加了腫瘤內(nèi)T細胞的浸潤，進而提升了CRC免疫治療水平。基于腸道中革蘭氏陰性菌產(chǎn)物內(nèi)毒素與PD-1抑制劑治療低反應(yīng)相關(guān)，該團隊還進行了另一項研究，他們將設(shè)計的脂多糖（LPS）（內(nèi)毒素的主要成分）靶向融合蛋白裝入納米捕獲系統(tǒng)中，阻斷了腫瘤內(nèi)部的LPS，成功抵抗了CRC的免疫抑制微環(huán)境，增強了PD-L1抑制劑的治療作用，甚至還減少了CRC肝轉(zhuǎn)移。Zhang等[27]研究發(fā)現(xiàn)，果膠可改善腸道菌群失衡，逆轉(zhuǎn)CRC患者腸道菌群多樣性的降低。在果膠聯(lián)合PD-1抑制劑治療中，除了可直接促進T細胞向TME的滲透，誘導(dǎo)CD8+T細胞依賴的抗腫瘤反應(yīng)外，瘤胃菌、霍爾德曼氏菌、棲糞桿菌等能產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)單鏈脂肪酸的細菌也增多，進一步促進了T細胞向腫瘤內(nèi)的滲透。此外，中醫(yī)藥聯(lián)合PD-1抑制劑也能通過腸道菌群對CRC患者療效產(chǎn)生一定影響，Lv等[38]報道了使用中藥葛根芩連湯聯(lián)合PD-1抑制劑治療MSS型CRC的療效，研究發(fā)現(xiàn)，葛根芩連湯聯(lián)合PD-1抑制劑使用后，進行腸道菌群分析顯示酸化擬桿菌含量增加。酸化擬桿菌是腸道一種有益的細菌，它通過調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物，增強機體的免疫能力。該研究也進一步證實，葛根芩連湯聯(lián)合PD-1抑制劑通過下調(diào)PD-1表達，提高白介素-2（IL-2）水平，恢復(fù)T細胞功能，對免疫治療獲得較好療效有一定作用。

欲改善對ICIs不敏感患者的療效，研究者們正利用不同的方式對微生物群進行干預(yù)，包括糞菌移植（fecal microbiota transplantation,FMT）及攝入益生元、益生菌、噬菌體活菌等。經(jīng)FMT將健康人體的整個腸道菌群移植到患者的腸道內(nèi)，以完全重建和正?；c道菌群的結(jié)構(gòu)和功能，改變了難治性癌癥患者腸道菌群的多樣性，進而有可能提高ICIs的療效[39]。補充特定的益生菌或益生元，或通過窄譜抗生素對不利的菌群進行預(yù)防，也可能成為CRC免疫治療為患者帶來獲益結(jié)局的有效方式。

3 腸道菌群對免疫檢查點抑制劑治療其他惡性腫瘤療效的影響

免疫治療已被證實在腎細胞癌、非小細胞肺癌、黑色素瘤及尿路上皮細胞癌中取得了較好的療效。Routy等[40]將對ICIs敏感的上皮細胞癌患者的糞便通過FMT到無菌或使用抗生素的小鼠中，結(jié)果顯示，經(jīng)FMT的小鼠改善了PD-1抑制劑的抗腫瘤療效，且該治療反應(yīng)與嗜黏蛋白阿克曼菌的相對豐度相關(guān)。嗜黏蛋白阿克曼菌主要通過增加CCR9+CXCR3+CD4+T淋巴細胞向小鼠瘤床募集，以白介素-12（IL-12）依賴的方式恢復(fù)抗PD-1治療的療效。Matson等[41]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中假長雙歧桿菌、產(chǎn)氣柯林斯菌和糞腸球菌豐度較高的患者抗PD-1免疫治療效果好。Vétizou等[42]認為CTLA-4阻斷的抗腫瘤作用依賴于不同種類的擬桿菌屬，并證實針對多形擬桿菌和脆弱擬桿菌與CTLA-4阻斷治療黑色素瘤的較好療效有關(guān)。Oster等[43]發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌陽性與PD-1抑制劑治療非小細胞肺癌（NSCLC）患者生存率降低相關(guān)，其中幽門螺桿菌陽性患者中位生存期僅6.7個月，而陰性患者為15.4個月（P=0.001）。此外，該項研究中另一隊列結(jié)果顯示幽門螺桿菌陽性與接受抗PD-1治療NSCLC患者無進展生存率顯著降低有關(guān)。Mao等[44]一項關(guān)于肝膽管癌患者腸道菌群與PD-1抑制劑療效的研究證實，隨著治療的進行，對PD-1抑制劑反應(yīng)差的患者菌群多樣性有所降低，這一結(jié)果支持了腸道菌群可能成為預(yù)測免疫治療反應(yīng)的有效生物標志物，此外，該研究還發(fā)現(xiàn)，PD-1抑制劑反應(yīng)良好組中類桿菌的相對豐度較高，而PD-1抑制劑不敏感組變形桿菌的相對豐度較高。

4 展望

微生物成分的多樣性可能會影響PD-1抑制劑免疫治療的效果，研究者正在尋找適合免疫治療的腸道菌群狀態(tài)。關(guān)于腸道菌群對免疫治療的影響，不同研究之間也仍有不一樣的發(fā)現(xiàn)。因此，需進一步進行包括大隊列研究和臨床試驗等，以評估腸道菌群對ICIs有效性的影響。目前，CRC所獲批的ICIs僅針對dMMR/MSI-H狀態(tài)的CRC患者，且免疫治療對其他狀態(tài)下CRC療效等尚未明確，未來還有待進一步研究?，F(xiàn)階段針對CRC免疫治療預(yù)測性生物標志物的研究仍較少，腫瘤突變負荷、新抗原負荷、腫瘤浸潤性淋巴細胞、免疫球蛋白等是目前研究發(fā)現(xiàn)可能具有較好前景的生物標志物，腸道菌群也正在成為影響腫瘤免疫治療結(jié)果的關(guān)鍵調(diào)控因素，不僅是因為腸道菌群與CRC聯(lián)系緊密，且菌群測序技術(shù)已相對成熟，因此，腸道菌群也有望成為CRC免疫治療的療效預(yù)測性生物標志物。