液體活檢在轉(zhuǎn)移性乳腺癌診療中的應用進展

朱凌霄， 肖 春， 張建華

在全世界范圍內(nèi)，乳腺癌作為女性腫瘤中發(fā)病人數(shù)以及惡性程度較高的疾病之一，其近年來的死亡率逐步下降，但轉(zhuǎn)移性乳腺癌(metastatic breast cancer，MBC)仍是一種無法治愈的疾病。根據(jù)2021年的最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計，全球范圍內(nèi)的女性惡性腫瘤中乳腺癌發(fā)病率高居首位，很大程度上影響女性的身心健康及生命安全[1]。隨著醫(yī)療的發(fā)展進步以及社會層面對于乳腺相關疾病的宣教科普，人們對于乳腺癌的認識逐漸深入，早期診斷乳腺癌的患者比例逐年增加，但是仍有相當一部分患者確診時已經(jīng)出現(xiàn)局部轉(zhuǎn)移甚至遠處轉(zhuǎn)移。有數(shù)據(jù)顯示，MBC患者的5年生存率只有38%[2]。液體活檢技術(shù)有別于傳統(tǒng)的穿刺活檢技術(shù)，具有創(chuàng)傷小、操作性強以及靈敏度高等優(yōu)點，且可重復操作，在乳腺癌診療的整個過程中都可發(fā)揮指導作用。本文就液體活檢技術(shù)在MBC診療中的應用進展進行綜述。

1 液體活檢技術(shù)概論

液體活檢技術(shù)是一種侵入性較小的、針對惡性腫瘤的無創(chuàng)診斷檢查技術(shù)，因為其可以減輕患者在手術(shù)或者穿刺活檢等侵入性檢查中的痛苦而受到了廣泛關注[3]。液體活檢主要是通過聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)、高通量測序、酶聯(lián)免疫吸附檢測以及生物傳感器等技術(shù)，對于原發(fā)性腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中分泌到人體外周體液中的各種組分進行測定和分析，從而完成對于惡性腫瘤的早期篩查、用藥指導、病情進展評估和治療效果觀察等，可貫穿應用于疾病的診療全程[4]。液體活檢大致可分為兩大類：血液來源的生物標志物和其他來源的有臨床診斷價值的生物標志物(例如：唾液、腦脊液、尿液、胸腹腔引流液等)。血液來源的標志物主要是游離DNA(circulating free DNA,cfDNA)，其中包括循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)、循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs)、微小RNA(microRNA,miRNA)、外泌體、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)以及腫瘤誘導血小板(tumor-educated platelets,TEPs)等。液體活檢具有動態(tài)實時監(jiān)測微小殘留病灶，對腫瘤進行基因分型以指導靶向治療，以及跟蹤腫瘤演變的潛力[5]。此外，與單次組織活檢相比，液體活檢可以通過檢測原發(fā)性和繼發(fā)性腫瘤釋放的腫瘤細胞或物質(zhì)來反映病灶間和病灶內(nèi)的異質(zhì)性，并提供更全面的癌癥分子譜。

2 液體活檢主要標志物研究進展

2.1CTCs 外周血CTCs于1869年首先由T.R.Ashworth觀察到并正式提出[6]，但它們的重要性在近20年才逐漸被理解并進行應用。CTCs從原發(fā)性腫瘤中分離，進入人體的循環(huán)系統(tǒng)，最后滲入淋巴結(jié)或遠處器官。Mohme等[7]研究證實，CTCs在形成轉(zhuǎn)移性病灶之前首先進入循環(huán)系統(tǒng)，可能比臨床影像學表現(xiàn)及臨床體征更敏感，更有助于臨床盡早采取干預措施。在脫離原發(fā)灶之前，CTCs改變了自身形態(tài)及表面蛋白，具有不同尋常的特性，主要是指經(jīng)歷上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)后獲得間充質(zhì)樣表型，失去細胞間相互作用和細胞極性后分泌多種酶以消化細胞外基質(zhì)并獲得遷移能力[8]。這些遷移的CTCs滲透至全身并最終定植到合適的位置后進行間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal-epithelial transition，MET)，重新獲得上皮特性并完成遠處轉(zhuǎn)移[9]。但是，由于外周血中CTCs的含量很少，所以如何針對其進行篩選、富集成為當前技術(shù)的核心問題。關于CTCs的分離、篩選以及富集方法目前依據(jù)三個方面，其一是根據(jù)CTCs區(qū)別于正常細胞的一些物理學特性，如大小、表面電荷、密度以及抗壓能力等進行篩選，包括ISET系統(tǒng)、Screen Cell系統(tǒng)、Oncoquick系統(tǒng)、雙向電泳系統(tǒng)以及流體輔助分離技術(shù)等；其二是基于CTCs的表面免疫相關的生物標志物來進行篩選，如Cellsearch系統(tǒng)[首個且唯一經(jīng)過美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準進入市場的技術(shù)]、Adnatest系統(tǒng)以及MACS系統(tǒng)等；其三是聯(lián)合前兩者的新型微流控芯片技術(shù)，能夠特異性篩選并捕獲CTCs后完成高效有序的富集過程[10]。雖然目前檢測方法越來越多，但是能夠大范圍應用于市場的主流技術(shù)仍較少。

2.2ctDNA和cfDNA 除了CTCs外，ctDNA本身亦攜帶與惡性腫瘤有關的基因信息，近年來在臨床上應用越來越廣泛。既往研究顯示，cfDNA在惡性腫瘤的臨床診治中發(fā)揮了重要作用，ctDNA只是cfDNA中的一小部分，二者的比例稱為循環(huán)腫瘤分數(shù)(circulating tumor fraction,cTF)。cTF在腫瘤體積較小且局限時通常很低，但隨著腫瘤生長和轉(zhuǎn)移而增高[11]。不同癌癥患者之間的ctDNA水平可能有很大差異。這種差異是由于腫瘤類型的差異造成的，有一些癌癥(如結(jié)直腸癌)與高水平的ctDNA相關，也有一些癌癥(如神經(jīng)膠質(zhì)瘤)與較低水平的ctDNA相關[12]。盡管如此，即使在癌癥類型相同的患者中，ctDNA水平也可能有很大差異。在個體患者中，隨著時間的推移，ctDNA水平與總體腫瘤負荷的波動仍密切相關?？紤]到循環(huán)中cfDNA的半衰期很短(大約1 h)，ctDNA已被提議作為整體腫瘤負荷的潛在替代物，可用于通過連續(xù)抽血監(jiān)測治療期間的反應[13]。一般來說，使用ctDNA監(jiān)測治療反應和腫瘤負荷變化的最敏感和最有效的方法是識別特定個體腫瘤的基因組改變，并在患者的血液中進行追蹤。ctDNA在外周血中濃度極低，且半衰期很短，因此檢測難度較大。目前主要的檢測手段包括數(shù)字化PCR(如微滴式數(shù)字PCR、BEAMing技術(shù)等)以及二代測序技術(shù)(next-generation sequencing，NGS)，旨在評估單個DNA分子，可以檢測cfDNA中突變頻率為0.01%甚至更低的等位基因。值得一提的是，為了避免NGS反應中聚合酶發(fā)生錯誤，目前已經(jīng)開發(fā)了“分子條形碼”技術(shù)，即每個原始模板中的DNA分子都帶有個性化的條形碼，以幫助區(qū)分原始模板分子中存在的真正突變和聚合酶過程中引入的錯誤反應[14]。使用這種方法，再加上深度測序覆蓋和錯誤抑制算法，可以進一步優(yōu)化檢測和分析ctDNA的方法，并有助于擴大潛在的臨床應用。

2.3外泌體 外泌體是源自細胞的納米級膜包裹囊泡，通過質(zhì)膜的連續(xù)內(nèi)陷最終形成多囊泡體，并在各種機制的協(xié)同作用下與細胞質(zhì)膜融合，最終被分泌出去[15]。由于多囊泡體可以與其他細胞內(nèi)囊泡和細胞器相互作用，導致外泌體成分的多樣性，它們性質(zhì)非常穩(wěn)定并能穿梭于體液中[16]。外泌體中轉(zhuǎn)運的成分包括蛋白質(zhì)、各種類型的RNA(miRNA、lncRNA、mRNA)和各種DNA。這些生物標志物通過遞送信息至受體細胞來影響基質(zhì)修飾和血管生成的進程[17]。此外，外泌體通過改變免疫細胞的表型來重新激活機體抑制腫瘤細胞的活性，從而促進腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制[18]。與前文所述的CTCs、ctDNA不同的是，外泌體還具有自我調(diào)節(jié)功能，可以通過自分泌或旁分泌機制調(diào)節(jié)鄰近細胞和遠處靶細胞，介導機體的生理和病理活動?？偠灾?，外泌體參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的血管生成、EMT、侵襲轉(zhuǎn)移、免疫逃逸、耐藥等方面，具有良好的臨床應用前景[19]。外泌體的分離方法主要取決于其組成成分以及物理性質(zhì)[20]。目前用于外泌體分離的常用技術(shù)包括超速離心、過濾、聚合物共沉淀、尺寸排除色譜法、磁性相關細胞無接觸分選以及微流體過濾等。其中超速離心法廣泛用于外泌體的分離，但由于純度低，難以在臨床上應用[21]。雖然循環(huán)外泌體的分析很方便，但外泌體的最終臨床應用仍處于初步階段，需要更多研究來驗證。

3 液體活檢在MBC診療中的臨床應用及研究進展

3.1CTCs在MBC診療中的應用及研究進展 在早期乳腺癌中，CTCs可以在大部分患者中被檢測到，并且被認為是微小殘留癌灶的標志物以及遠期MBC的潛在發(fā)生前兆[22]。近幾十年來，基于CTCs能夠?qū)崟r反映腫瘤負荷和轉(zhuǎn)移部位的特性，CTCs已被確定為MBC的一個強有力的預后因素，多項研究表明其具有指導治療決策的潛力[23]。除了基于腫瘤細胞的分析之外，還可以在外周血中常規(guī)檢測循環(huán)核酸，例如DNA和RNA片段[24]。基于CTCs診斷的主要優(yōu)勢之一是能夠以非侵入性方式進行連續(xù)測量，提供對疾病生物學的實時觀察，并可能因此改變治療方案。由于預測標志物[例如激素和人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)]狀態(tài)以及新的治療相關靶點可能會在疾病過程中發(fā)生變化，因此液體活檢有可能成為乳腺癌轉(zhuǎn)移情況下侵入性組織檢查的替代方法[25]。在Cellsearch系統(tǒng)中，每7.5 ml血液中檢測出5個CTCs作為臨界水平以區(qū)分MBC預后良好和不良的患者，CTCs>5個的患者臨床無進展生存期(progression-free survival,PFS)以及總生存期(overall survival,OS)均顯著降低，而且通過進一步治療后復查CTCs數(shù)值仍較高者的生存期更短，說明液體活檢在某種程度上靈敏度是高于常規(guī)影像學檢查的，而且可以更連續(xù)地對疾病的發(fā)展及預后進行評估[26]。最近發(fā)表了2項關于CTCs在MBC中預后價值的大型分析。一項是Cristofanilli等[27]進行的匯總分析，對來自18個中心的近2 500例MBC患者的血液樣本進行了評估，其中533例女性患有新發(fā)轉(zhuǎn)移性癌癥，Cellsearch系統(tǒng)用于CTCs檢測結(jié)果顯示，CTCs升高的患者往往顯示更差的預后(OS：CTChighvs CTClow為16個月 vs 36.3個月)，而且轉(zhuǎn)移部位與乳腺癌分型無明顯關聯(lián)。在患有新發(fā)轉(zhuǎn)移性疾病的MBC患者中，升高的CTCs計數(shù)也與較短的OS相關(18.7個月 vs 41.4個月)。而且CTCs是MBC多變量分析中最強的OS預測因子(HR=2.71，95%CI：2.35～3.12)。另一項是由Müller等[28]建立的DETECT研究小組對1 933例MBC患者的血液樣本進行了分析，這項試驗是全球最大的基于CTCs的治療干預的研究項目，旨在指導CTCs在MBC靶向治療中的臨床應用。在DETECT Ⅲ期試驗中，HER2陰性和HER2陽性的患者被隨機分配接受標準治療加用或不加用拉帕替尼抗HER2治療；HER2陰性患者參加DETECT Ⅳa期和Ⅳb期研究，證實了CTCs計數(shù)在MBC中的高度預后相關性。結(jié)果顯示1個CTC和5個CTCs作為臨界值時均與患者中位OS顯著相關(≥1個CTCs患者的中位OS 15.5個月 vs CTCs陰性患者的中位OS 37.2個月；≥5個CTCs患者的中位OS 12.0個月 vs <5個CTCs患者的中位OS 28.6個月)。還有試驗表明CTCs可以作為指導雌激素受體(estrogen receptor，ER)陽性乳腺癌患者一線治療的生物標志物[29]。在激素受體陽性MBC患者中也觀察到不同的臨床癥狀，這取決于存在的CTCs數(shù)量[30]。此外，即使在乳房手術(shù)后5年內(nèi)，在沒有活動性疾病證據(jù)的患者中CTCs水平較高者5年內(nèi)復發(fā)及轉(zhuǎn)移風險也較高[31]。由于大多數(shù)患者在全身治療期間CTCs計數(shù)均減少，因此對CTCs計數(shù)水平進行持續(xù)性檢測有助于識別并篩選出對于當前治療反應不佳的患者，可以幫助患者規(guī)避低效且有副作用可能較大的藥物，或者改用其他有效的治療方案。SWOG S0500試驗[32]對此進行了論證。在這項研究中，在開始一線化療治療之前，取595例MBC患者的血樣測量了CTCs指標并記錄，在進行了第1個周期治療后取得了第2份血樣。持續(xù)高CTCs計數(shù)的患者被隨機分配至繼續(xù)治療，直至臨床進展期(標準組)或切換到另一種化療方案(對照組)。結(jié)果顯示CTCs數(shù)量較低的患者具有更好的臨床結(jié)果(中位OS為35個月)，但兩組CTCs數(shù)量持續(xù)較高的患者的預后相似。因此，一線化療1個周期后CTCs未減少的MBC患者改用替代化療方案既沒有改善OS，也沒有改善PFS。但是值得注意的是，在此研究中CTCs數(shù)量較低的患者預后良好，激素受體陽性和HER2陽性患者的中位OS超過3年。即使是三陰性乳腺癌患者，其中位生存期也接近2年[33]?？紤]到患者更有可能從免疫、靶向或試驗性治療中受益，筆者建議在1個化療周期后發(fā)現(xiàn)CTCs增加的患者，應在疾病進展期間積極考慮參加新型治療藥物的試驗，而不是繼續(xù)進行第2周期或者替代的化療。近期亦有一項研究(CirCe01試驗)旨在評估基于CTCs的監(jiān)測在MBC中的臨床效用[34]，雖然此研究規(guī)避了SWOG S0500試驗的不足以及局限性，并在這項隨機Ⅲ期研究中探索了三線方案，以避免重新選擇化療方案。但是該研究最終亦未能得到理想的結(jié)果，可能是因為基于CTCs的監(jiān)測組中的患者沒有獲得更長的OS，還有患者對于基于CTCs的治療轉(zhuǎn)換方案的接受度較低以及招募人數(shù)不足等。最近的一項研究證明了CTCs數(shù)據(jù)在臨床決策中的效用，不僅考慮了CTCs的數(shù)量，而且還考慮了CTCs的表型[9]。但是關于臨床上MBC患者如何從CTCs監(jiān)測中獲益，仍然需要進一步的研究證實。

3.2ctDNA在MBC診療中的應用及研究進展

2019年，在中國臨床腫瘤學會《乳腺癌診療指南》中首次指出CTCs和ctDNA可以作為循環(huán)腫瘤標志物預測早期和晚期乳腺癌預后的價值[35]。正如前文所述，多項大型研究及后期的薈萃分析均證實了CTCs在MBC中的預后意義，但是涉及到ctDNA在MBC中的診療價值尚需大量臨床數(shù)據(jù)支持。迄今為止，只有少數(shù)研究評估了ctDNA在MBC中的預后意義。Shaw等[36]比較了112例MBC患者的CTCs和ctDNA的突變譜，通過檢測磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亞基α(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinasecatalytic subunit alpha,PIK3CA)、鼠類肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS)、腫瘤蛋白53(tumor protein 53,TP53)和雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1)基因的突變與升高的ctDNA水平，發(fā)現(xiàn)二者均與MBC明顯縮短的OS相關，并且ctDNA和CTCs中的突變譜是一致的。Tan等[37]對10項試驗的薈萃分析僅包括1 127例患者，高水平的cfDNA和外周血中存在ctDNA與乳腺癌患者的不良預后顯著相關。而且與高水平的cfDNA相比，ctDNA的檢測可以更有效地預測生存結(jié)果。按樣本來源分類的進一步亞組分析表明，cfDNA可以作為乳腺癌患者的預測和預后標志物。按腫瘤分期分類的亞組分析表明，cfDNA適用于乳腺癌患者的早期和轉(zhuǎn)移期。在Fernandez-Garcia等[38]的研究中，對來自194例MBC患者的血液樣本進行了CTCs計數(shù)、cfDNA水平和腫瘤標志物癌胚抗原153(carcino-embryonic antigen 153,CA153)的分析。結(jié)果顯示高水平的cfDNA與較短的OS顯著相關，總體cfDNA水平與CTCs計數(shù)相關。有研究表明ctDNA水平實際上可能在治療開始后的最初幾天短暫增加，這可能是由于腫瘤細胞死亡增加導致ctDNA脫落增加。然而，在對治療有反應的患者中，ctDNA水平通常在1～2周后急劇下降[39]。還有研究證實，ctDNA水平的最終上升可能出現(xiàn)在影像學進展之前數(shù)周至數(shù)月，這表明ctDNA跟蹤可以作為一種潛在的臨床工具，用于評估患者發(fā)生耐藥的可能性，并且可以結(jié)合當前臨床監(jiān)測方法，為后續(xù)治療贏取更多的準備時間。2020年Pierga等[40]報道了前瞻性UCBG COMET試驗的結(jié)果，對196例HER2陰性MBC患者在化療前和第1周期結(jié)束后的ctDNA水平進行分析，并通過靶向重測序檢測了幾種體細胞突變，即TP53、PIK3CA、ESR1和HER2。結(jié)果顯示，血漿中的TP53突變會影響MBC患者的PFS和OS，而PIK3CA和ESR1突變對患者的生存預后沒有影響。此外，在第2周期化療前可檢測到ctDNA的患者OS顯著縮短?？傊絹碓蕉嗟淖C據(jù)表明ctDNA在MBC中具有預后影響。然而，由于各試驗的設計思路以及驗證方法不同，所以目前直接進行各試驗之間的比較和匯總還是有一定難度的。

4 小結(jié)及展望

近年來，液體活檢作為精準醫(yī)療的一種新方法，重視基于個人基因組、環(huán)境和生活習慣的個體化治療，尤其是當實體組織活檢不足或無法獲得時，液體活檢可以為惡性腫瘤的診療提供強有力的輔助。除了預測作用之外，液體活檢可能是全面的腫瘤基因分型、識別緊急耐藥機制、監(jiān)測微小殘留病灶、早期檢測和癌癥攔截的有用工具。隨著臨床上精準治療理念的深入，乳腺癌的治療方案亦逐年優(yōu)化。對于外科醫(yī)師來說，圍手術(shù)期循環(huán)腫瘤標志物的變動分析可以早于常規(guī)影像學診斷去指導臨床更快速地完善現(xiàn)行的乳腺癌治療方案，最終幫助患者得到更好的治療結(jié)果[41]。目前新循環(huán)生物標志物的發(fā)現(xiàn)和驗證仍處于起步階段，雖然多種生物標志物整合分析可以為臨床醫(yī)師提供更全面的診療思路，但是仍需要大量的循證醫(yī)學研究證據(jù)來支持。相信在不久的將來，隨著越來越多的相關研究結(jié)果的公開，液體活檢技術(shù)在MBC以及其他惡性腫瘤的診治中定能發(fā)揮出更大的作用。