不同噪聲暴露次數(shù)對(duì)C57小鼠聽(tīng)功能影響的研究

韓曙光 杜政德 龔樹生 柳柯

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(北京 100050)

耳聾是耳科常見(jiàn)的疾病之一，嚴(yán)重的耳聾可對(duì)病人生活質(zhì)量產(chǎn)生重大的影響，明確聾病發(fā)生的原因和機(jī)制不僅可提高聾病治療效果，對(duì)聾病的預(yù)防也有著重要意義。而這其中，噪聲對(duì)整個(gè)人類的影響都是顯而易見(jiàn)的，而且隨著人類社會(huì)生產(chǎn)力的不斷提高，工業(yè)，交通，娛樂(lè)等各行各業(yè)所產(chǎn)生的噪聲也隨之增多，這些潛伏在人類周邊的噪聲無(wú)時(shí)不刻不在影響人們的聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)，造成聽(tīng)覺(jué)損害[1]。而這其中，隱匿性聽(tīng)力損失動(dòng)物模型逐漸成為學(xué)者的研究熱點(diǎn)。本課題組通過(guò)不同的噪聲暴露方式，研究對(duì)C57小鼠聽(tīng)力的影響，構(gòu)建C57小鼠不同程度的耳聾模型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

本課題組所用小鼠均為5周齡的C57BL/6J小鼠，雄性，體重15-18g。先于動(dòng)物房進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境噪聲控制在40dB以內(nèi)。所有小鼠觀察活動(dòng)性及營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)良好，耳廓反射靈敏，實(shí)驗(yàn)所納入小鼠均排除外耳異常及中耳炎。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被隨機(jī)分為對(duì)照組（A）、一次噪聲暴露組（B），二次噪聲暴露組（C）和三次噪聲暴露組（D），每組6只小鼠。

1.2 噪聲暴露

實(shí)驗(yàn)采用Cool Edit Pro合成白噪聲，放大后通過(guò)音響進(jìn)行釋放，強(qiáng)度100dBSPL，暴露時(shí)間2小時(shí)，鼠籠置于兩個(gè)音響正中，聲級(jí)計(jì)監(jiān)測(cè)暴露過(guò)程中噪聲強(qiáng)度變化不超過(guò)1dB。對(duì)照組不進(jìn)行噪聲暴露。B組于day1進(jìn)行噪聲暴露一次；C組于day1，day3進(jìn)行兩次噪聲暴露；D組于day1，day3，day5進(jìn)行三次噪聲暴露（見(jiàn)圖1）。

圖1 動(dòng)物分組及噪聲暴露和ABR檢測(cè)Fig.1 Animal grouping,noise exposure and ABR test

1.3 聽(tīng)功能檢測(cè)

對(duì)小鼠進(jìn)行ABR測(cè)試，均進(jìn)行左耳測(cè)試。對(duì)照組A分別于day1和day14測(cè)試聽(tīng)力。噪聲暴露組分別于噪聲暴露前、最后一次噪聲的當(dāng)天，暴露后第7天和第14天測(cè)試ABR。ABRI波振幅在最后一次噪聲暴露的第14天測(cè)試，于click聲90dBSPL刺激條件下，基線由系統(tǒng)軟件自動(dòng)識(shí)別，辨認(rèn)I波波峰及波谷并定標(biāo)，軟件自動(dòng)計(jì)算I波振幅。

1.4 耳蝸形態(tài)學(xué)觀察

聽(tīng)力學(xué)檢查后處死小鼠，取雙側(cè)耳蝸固定，脫鈣，蔗糖梯度脫水后進(jìn)行包埋，于冰凍切片機(jī)內(nèi)以層厚10μm進(jìn)行組織切片，近蝸軸處留片備用，風(fēng)干后梯度脫水，HE染色后進(jìn)行耳蝸基底膜毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)。毛細(xì)胞計(jì)數(shù)：每個(gè)耳蝸標(biāo)本中軸處連續(xù)留片10張，以細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)完整為存活標(biāo)志進(jìn)行毛細(xì)胞計(jì)數(shù)。螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)則間隔3張取片以避免細(xì)胞重復(fù)計(jì)數(shù)，每只耳蝸可挑選出3張切片。螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞以底轉(zhuǎn)起始段，終末段，及中轉(zhuǎn)段三處進(jìn)行網(wǎng)格法計(jì)數(shù)。以對(duì)照組計(jì)數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行試驗(yàn)組存活率計(jì)算，統(tǒng)計(jì)三次取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

記錄各個(gè)時(shí)間點(diǎn)ABR閾值及I波振幅，內(nèi)耳毛細(xì)胞及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活率，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。噪聲暴露前后不同時(shí)間點(diǎn)ABR閾值，暴露后第14天ABRI波振幅，及耳蝸細(xì)胞存活率均進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 單次噪聲暴露小鼠聽(tīng)力學(xué)及內(nèi)耳形態(tài)學(xué)改變

首先對(duì)照組進(jìn)行聽(tīng)力測(cè)試，day1和day14聽(tīng)力分別為17.08±2.46，17.28±2.86dBSPL，I波振幅分別為3.31±0.37和3.28±0.26μV，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。B組單次噪聲暴露后day1聽(tīng)力明顯升高，且以24k和32k聽(tīng)力損失最為嚴(yán)重。day7聽(tīng)力部分恢復(fù)，day14時(shí)click及各個(gè)頻率聽(tīng)力閾值均與day1無(wú)明顯差異（表1），但ABRI波振幅降低（圖2），為2.23±0.36μV，與暴露前振幅統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯（P<0.01）。耳蝸毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)均與對(duì)照組無(wú)明顯差異（圖3）。

表1 噪聲暴露組各時(shí)間點(diǎn)ABR閾值Table 1 ABR threshold at each testing time among group B～D

2.2 二次噪聲暴露小鼠聽(tīng)力學(xué)及內(nèi)耳形態(tài)學(xué)改變

C組噪聲暴露后第一天聽(tīng)力明顯升高，以24k最為明顯，噪聲暴露后第7天聽(tīng)力沒(méi)有出現(xiàn)恢復(fù)趨勢(shì)，反而進(jìn)一步加重，其中16k的聽(tīng)力損失加重最為明顯。而暴露后第14天，聽(tīng)力部分恢復(fù)，但仍與噪聲暴露前有明顯降低（表1），ABRI波振幅為2.13±0.34μV（圖2），較對(duì)照組明顯降低（P<0.01）。耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)保持穩(wěn)定，但是外毛細(xì)胞可見(jiàn)丟失，排列不齊等，且外毛細(xì)胞存活率（95.45%）較對(duì)照組下降（P<0.01，圖3）。

2.3 三次噪聲暴露小鼠聽(tīng)力學(xué)及內(nèi)耳形態(tài)學(xué)改變

D組小鼠噪聲暴露后第一天聽(tīng)力明顯升高，24k受損明顯，噪聲暴露后第7天聽(tīng)力損失亦進(jìn)一步加重，其中16k的聽(tīng)力損失加重最為明顯。而暴露后第14天，聽(tīng)力部分恢復(fù)，但仍與噪聲暴露前有明顯損失（表1），ABRI波振幅為1.82±0.47μV（圖2），較對(duì)照組明顯降低（P<0.01）。耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)仍無(wú)明顯變化，外毛細(xì)胞丟失則更為顯著，外毛細(xì)胞存活率（90.45%）較對(duì)照組明顯下降（P<0.01，圖3）。

圖2 各組day14ABR I波振幅Fig.2 ABR wave I amplitude

圖3 各組耳蝸切片及細(xì)胞計(jì)數(shù)（耳蝸中軸切片內(nèi)毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)各組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，外毛細(xì)胞單次噪聲暴露后變化不大，隨著暴露次數(shù)增加丟失嚴(yán)重。紅色箭頭示外毛細(xì)胞丟失部位）Fig.3 Cochlear sections and cells count(inner hair cells and spiral ganglion cells count had no statistical difference com‐pared with group A,outer hair cells kept stable in group B,and decreased with the increasing number of noise exposure.B:t=0.229,P=0.828;C:t=-9.783,P=0.000;D:t=18.407,P=0.000.**P<0.01.Red arrows showed the fragmentary outer hair cells)

3 討論

聽(tīng)力損失一般定義為聽(tīng)覺(jué)對(duì)聲刺激的敏感度下降，即聽(tīng)覺(jué)閾值升高。但是近年來(lái)，隨著人們對(duì)聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)研究的深入，發(fā)現(xiàn)一部分患者在噪聲暴露之后，雖然在噪聲環(huán)境下出現(xiàn)了言語(yǔ)識(shí)別困難的現(xiàn)象，但是常規(guī)的聽(tīng)力檢測(cè)手段并不能發(fā)現(xiàn)異常。同時(shí)在深入的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，人們發(fā)現(xiàn)噪聲暴露之后，耳蝸毛細(xì)胞的損傷在特定強(qiáng)度的噪聲暴露之后會(huì)出現(xiàn)可逆性恢復(fù)，但是內(nèi)毛細(xì)胞與螺旋神經(jīng)節(jié)纖維之間的突觸在不同程度上是不可逆損失的，同時(shí)電生理檢測(cè)結(jié)果同樣顯示了未累及聽(tīng)力閾值。因此，把這種不易被察覺(jué)的聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)損害稱之為隱匿性聽(tīng)力損失[2]，而噪聲誘導(dǎo)的隱匿性聽(tīng)力損失現(xiàn)在是耳科的基礎(chǔ)研究熱點(diǎn)。

CBA或豚鼠小鼠用來(lái)構(gòu)建噪聲誘導(dǎo)的隱匿性聽(tīng)力損失是國(guó)外各實(shí)驗(yàn)室常規(guī)采用的辦法，但是大家所采取的噪聲暴露模式并不相同。Liberman[3]實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)較低強(qiáng)度的窄帶噪聲短時(shí)暴露后（106dBSPL，2h)，小鼠的ABR閾值在一周內(nèi)恢復(fù)正常，但ABR和聽(tīng)神經(jīng)復(fù)合動(dòng)作電位的幅度卻未能恢復(fù)到噪聲暴露前的水平。Kujawa[3,4]等采用100dBSPL強(qiáng)度的倍頻帶噪聲（8-16kHz）暴露2h，發(fā)現(xiàn)在高頻區(qū)，在噪聲暴露之后2h就可以檢測(cè)到最大40dB的閾移，而這些閾移在14天均基本都能夠恢復(fù)正常。尹彥波[5]，Shi[6]等人采用CBA/CaJ小鼠也可以得到NIHHL動(dòng)物模型。

在C57小鼠中尚沒(méi)有肯定的隱匿性耳聾的動(dòng)物模型。Kevin D.Brown[7]采用C57小鼠來(lái)研究煙酰胺核糖對(duì)聽(tīng)力的保護(hù)作用，使用90dB的倍頻噪聲作為暴露條件，進(jìn)行2h的噪聲暴露，發(fā)現(xiàn)噪聲暴露24h之后，出現(xiàn)了明顯的聽(tīng)力下降，聽(tīng)力閾值改變一直持續(xù)到了噪聲暴露后的第14天，并沒(méi)有隨著時(shí)間延長(zhǎng)而徹底恢復(fù)，因?yàn)檎J(rèn)為C57小鼠對(duì)噪聲敏感，對(duì)于特定條件下的噪聲暴露產(chǎn)生了永久性閾移，不能認(rèn)為是隱匿性聽(tīng)力損失。有意思的是，他們實(shí)驗(yàn)室也采用了CBA小鼠來(lái)進(jìn)行同樣噪聲模式的暴露，發(fā)現(xiàn)最終也有部分不可逆的聽(tīng)力損失，這與其他實(shí)驗(yàn)室采用CBA小鼠進(jìn)行噪聲誘導(dǎo)的隱匿性聽(tīng)力損失模型的構(gòu)建有所沖突。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者開(kāi)始嘗試使用C57小鼠來(lái)進(jìn)行噪聲暴露，試圖構(gòu)建隱匿性聽(tīng)力損失，其中，柳柯[8]等學(xué)者采用100dB的白噪聲來(lái)進(jìn)行聽(tīng)力暴露，認(rèn)為可以獲得較為穩(wěn)定的隱匿性聽(tīng)力損失模型。雖然噪聲強(qiáng)度甚至比Kevin D.Brown等實(shí)驗(yàn)室還要強(qiáng)，但噪聲方式為寬頻白噪聲，這種噪聲可能在頻率的能量分配上，相對(duì)于倍頻噪聲在特定頻率范圍內(nèi)集中作用于耳蝸，對(duì)內(nèi)耳的損失更小。本實(shí)驗(yàn)試圖重復(fù)并驗(yàn)證這種動(dòng)物模型的構(gòu)建情況，并給于多次噪聲暴露，來(lái)觀察聽(tīng)力的進(jìn)一步損失情況。

在我們的研究中，多次噪聲暴露均產(chǎn)生了不可逆恢復(fù)的永久性閾移，即認(rèn)為是噪聲性耳聾模型，并觀察到內(nèi)耳形態(tài)學(xué)的損傷。在首次噪聲暴露的基礎(chǔ)上，給予多重噪聲暴露，小鼠聽(tīng)力進(jìn)行性下降，并在14天后僅可觀察到部分的聽(tīng)力恢復(fù)，這種未能恢復(fù)的聽(tīng)力閾移稱之為永久性閾移。有意思的是，與單次噪聲暴露不同，多次噪聲暴露在第7天，聽(tīng)力損失仍然呈現(xiàn)進(jìn)行性加重趨勢(shì)，而不像單次噪聲暴露，在第7天就已經(jīng)開(kāi)始了聽(tīng)力的恢復(fù)階段，而是在day7-14階段才開(kāi)始有聽(tīng)力的部分恢復(fù)。這可能與噪聲對(duì)聽(tīng)力損害的累積作用有關(guān)，提示過(guò)強(qiáng)噪聲對(duì)小鼠聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的損傷時(shí)間和程度更為嚴(yán)重。通過(guò)對(duì)頻率特異性的ABR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，噪聲對(duì)高頻區(qū)的聽(tīng)力影響更為嚴(yán)重，24k及32k聽(tīng)力損失在噪聲暴露后第一天最為明顯，同時(shí)16k聽(tīng)力損失相對(duì)較輕。而在此基礎(chǔ)上遭受再次噪聲暴露，16k聽(tīng)力閾移最為明顯，到14天時(shí)恢復(fù)程度也相對(duì)較大。同樣在耳蝸切片上也觀察到，相對(duì)于頂轉(zhuǎn)Corti氏器，底轉(zhuǎn)Corti氏器外毛細(xì)胞的損傷更為明顯。

接下來(lái)，我們?cè)u(píng)估ABR I波振幅的變化。I波起源于內(nèi)毛細(xì)胞與螺旋神經(jīng)纖維之間的突觸動(dòng)作電位，代表了與IHCs接觸的聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)纖維的總和活動(dòng)。我們發(fā)現(xiàn)單次噪聲暴露后第14天，雖然暫時(shí)性閾移已經(jīng)完全恢復(fù)正常，但I(xiàn)波振幅并不能恢復(fù)，因此證明噪聲對(duì)聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)仍有一定程度不可逆的損害。多次噪聲暴露后，I波振幅也有不同程度降低。因此C57小鼠采用特定的噪聲暴露可以成功的構(gòu)建噪聲誘導(dǎo)的隱匿性聽(tīng)力損失的動(dòng)物模型。

對(duì)耳蝸切片觀察可以發(fā)現(xiàn)，單次噪聲暴露于對(duì)照組，并無(wú)明顯差異，但隨著噪聲暴露次數(shù)的增加，外毛細(xì)胞丟失逐漸加重，內(nèi)毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞則基本保持穩(wěn)定，說(shuō)明外毛細(xì)胞對(duì)于噪聲性損傷更為敏感，而螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡則是繼發(fā)于毛細(xì)胞損傷后的延遲反應(yīng)，一般在數(shù)月后才會(huì)發(fā)現(xiàn)。我們的研究采用C57小鼠，構(gòu)建了穩(wěn)定的噪聲誘導(dǎo)的隱匿性聽(tīng)力損失模型，并通過(guò)多次噪聲暴露構(gòu)建噪聲性耳聾模型。根據(jù)目前的安全標(biāo)準(zhǔn)，隱匿性耳聾的臨床影響對(duì)人群的影響更大，這些人群暴露在被認(rèn)為是安全的噪音中[9]，而這些噪聲對(duì)人的聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)仍是有危害的。穩(wěn)定的動(dòng)物模型對(duì)于進(jìn)一步研究隱匿性耳聾機(jī)制及應(yīng)對(duì)保護(hù)措施提供了良好的基礎(chǔ)。