lncRNA UCA1抑制miR-503減輕缺氧誘導的心肌細胞損傷機制研究

孝 俊，柴曉莉，李 念，李 瓊

目前心血管疾病是世界上發(fā)病率和死亡率最高的疾病。急性心肌梗死(AMI)是心血管疾病的常見類型，已對人類健康構成巨大威脅。冠狀動脈粥樣硬化血管狹窄引起心肌缺血和缺氧，長期缺血甚至導致心肌細胞死亡，最終導致AMI[1-2]。然而，AMI發(fā)病機制并未完全闡明。非編碼RNA(ncRNA)是一類缺乏蛋白質(zhì)編碼能力的RNA，最初被認為是“垃圾DNA”。近年研究[3]發(fā)現(xiàn)，人類基因組約98%為ncRNA，長鏈非編碼RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)是ncRNA的重要類型，參與細胞增殖、周期進展、遷移和凋亡等多種細胞過程，具有強大的基因調(diào)控功能。此外，lncRNA還可與miRNA相互作用防止目標mRNA被miRNA降解[4]。研究[5]顯示，AMI病人血漿中l(wèi)ncRNA尿路上皮癌相關1(UCA1)表達顯著降低，是急性心肌梗死潛在的診斷標志和治療靶點。生物信息學數(shù)據(jù)庫在線分析發(fā)現(xiàn)，UCA1與miR-503之間存在結合位點。miR-503高表達已被證實與糖尿病心肌梗死邊緣區(qū)組織內(nèi)血管新生能力的下降有關[6]。然而，lncRNA UCA1能否靶向miR-503在AMI中發(fā)揮作用尚未完全闡明。本研究在缺氧條件下培養(yǎng)H9c2心肌細胞以誘導細胞損傷，探討UCA1在預防缺氧引起的心肌損傷中作用和可能機制?，F(xiàn)作報道。

1 材料與方法

1.1 材料 人心肌細胞株AC16購自中國科學院上海細胞庫；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；空載體質(zhì)粒(pcDNA)、UCA1過表達質(zhì)粒(pcDNA-UCA1)、miRNA抑制物陰性對照(anti-miR-NC)、miR-503抑制物(anti-miR-503)、雙熒光素酶報告基因載體購自上海生工生物工程有限公司；Trizol試劑、放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解緩沖液、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、核糖核酸酶A(RNase A)、兔抗Ki67抗體、兔抗激活型半胱氨酸酶3(Cleaved-caspase3)抗體、兔抗磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體、山羊抗兔IgG購自上海碧云天生物研究所；cDNA合成試劑盒、miRNA反轉錄試劑盒、SYBR green混合物試劑、Taqman Universal混合物試劑購自大連Takara生物；膜聯(lián)蛋白-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和實驗分組 AC16采用添加10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基置于含5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照1∶3比例傳代，每周3次。取2×105個對數(shù)期AC16細胞接種24孔板，置于缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(5% CO2、1% O2、94% N2、37 ℃)的缺氧培養(yǎng)箱48 h，記為模型(Model)組。同時設置對照組不做缺氧處理。收集細胞進行后續(xù)實驗。為證實lncRNA UCA1、miR-503在缺氧誘導的AC16細胞損傷中的作用，將AC16細胞分為pcDNA組、pcDNA-UCA1組、anti-miR-NC組、anti-miR-503組，即利用脂質(zhì)體轉染法將pcDNA、pcDNA-UCA1、anti-miR-NC、anti-miR-503分別轉染AC16細胞，轉染48 h檢測轉染效率合格后進行缺氧處理。

1.2.2 RT-qPCR檢測lncRNA UCA1和miR-503表達 Trizol試劑提取細胞總RNA。分別使用cDNA合成試劑盒、miRNA反轉錄試劑盒進行逆轉錄反應，分別使用SYBR green混合物試劑、Taqman Universal Master Mix Ⅱ進行RT-qPCR，2-△△CT法分析lncRNA UCA1(內(nèi)參為GAPDH)和miR-503(內(nèi)參為U6)表達量。miR-503引物F:5′-CCT ATT TCC CAT GAT TCC TTC ATA-3′，R：5′-GTA ATA CGG TTA TCC ACG CG-3′，擴增片段長度為159 bp；UCA1引物F：5′-TTT GCC AGC CTC AGC TTA AT-3′，R：5′-TTG TCC CCA TTT TCC ATC AT-3′，擴增片段長度為320 bp；U6引物F：5′-GTG ATC ACT CCC TGC CTG AG-3′，R：5′-GGA CTT CAC TGG ACC AGA CG-3′，擴增片段長度為201 bp；GAPDH引物F：5′-CCG CAT CTT CTT GTG CAG TG-3′，R：5′-CCC AAT ACG GCC AAA TCC GT-3′，擴增片段長度為450 bp。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞活力 取5×103個細胞接種96孔板，培養(yǎng)24 h后每孔添加10 μL的CCK-8溶液，培養(yǎng)箱再孵育2.5 h，酶標儀在450 nm處測定各孔吸光度(A)。細胞存活率=對照組A/實驗組A×100%。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡、周期分布 凋亡檢測：采用結合緩沖液將LPS處理24 h的各組細胞調(diào)整為1×105/mL單細胞懸液。取100 μL細胞懸液加入到流式管，按照凋亡檢測試劑盒說明書加入Annexin V-FITC和PI試劑進行染色，避光反應15 min，1 h內(nèi)上機檢測細胞凋亡。

周期分布檢測：常規(guī)消化各組細胞，離心棄去上清液，用預冷的PBS洗滌細胞2次。用預冷的70%乙醇室溫固定1 h。離心收集細胞，PBS洗滌細胞2次。向細胞中加500 μL RNase A(10 μg/mL),室溫孵育30 min。再加500 μL PI(100 μg/mL),室溫孵育30 min。流式細胞儀檢測各時相細胞比例。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?應用lncRNABase在線預測顯示lncRNA UCA1與miR-503存在結合位點?；陬A測結合位點合成UCA1野生型(WT)和突變型(MUT)序列，將上述序列分別克隆pmirGLO熒光素酶載體構建WT-UCA1、MUT-UCA1。將miR-503 mimics、miR-NC與WT-UCA1或MUT-UCA1分別共轉染至A549細胞48 h后，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定相對熒光素酶活性。將pcDNA-UCA1、pcDNA分別轉染AC16細胞，轉染48 h RT-qPCR法檢測miR-503表達水平。

1.2.6 蛋白質(zhì)印記檢測Ki67和Cleaved-caspase3蛋白表達 實用RIPA裂解緩沖液提取細胞總蛋白，BCA試劑盒分析蛋白質(zhì)濃度。將蛋白樣品加至聚丙烯酰胺凝膠加樣孔分離蛋白，并進行濕法轉膜。用含5%脫脂牛奶的緩沖液封閉膜1 h，將抗Ki67抗體、抗Cleaved-caspase3抗體、抗GAPDH抗體按照1∶1 000比例稀釋，4 ℃孵育膜過夜。洗膜緩沖液沖洗3次，用1∶1 000稀釋的二抗溶液孵育膜1 h。洗膜緩沖液再次沖洗3次。將膜與化學發(fā)光顯色底物孵育1 h，Image LabTM軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白與GAPDH灰度值比值表示目的蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用t檢驗、方差分析和q檢驗。

2 結果

2.1 UCA1、miR-503在缺氧處理的AC16中的表達 相對于對照組，模型組AC16細胞中UCA1表達降低，miR-503表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(見表1)。

表1 UCA1、miR-503在缺氧處理的AC16細胞中的表達

2.2 轉染UCA1及干擾miR-503后其表達水平的檢測 相對于pcDNA組(0.12±0.01)，pcDNA-UCA1組(0.63±0.04)AC16細胞中UCA1表達顯著升高(t=21.42，P<0.01)。相對于anti-miR-NC組(2.68±0.13)，anti-miR-503組(1.16±0.06)AC16細胞中miR-503表達顯著降低(t=18.39，P<0.01)。

2.3 UCA1對缺氧處理的AC16增殖凋亡的影響 相對于對照組，模型組AC16細胞存活率、Ki67蛋白表達、S期細胞比例降低，細胞凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達、G0～G1期細胞比例升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；相對于pcDNA組，pcDNA-UCA1組AC16細胞存活率、Ki67蛋白表達、S期細胞比例升高，細胞凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達、G0～G1期細胞比例降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖1、2和表2)。

表2 UCA1對缺氧處理的AC16細胞增殖凋亡的影響

2.4 UCA1與miR-503靶向關系 靶基因預測數(shù)據(jù)庫在線分析顯示，UCA1與miR-503之間存在特異性結合位點(見圖3)。雙熒光素酶報告實驗顯示，與轉染miR-NC比較，轉染miR-503 mimic可降低WT-UCA1的相對熒光素酶活性(P<0.01)，而對MUT-UCA1的相對熒光素酶活性影響無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表3)。RT-qPCR檢測顯示，與pcDNA組(0.96±0.10)比較，pcDNA-UCA1組(0.26±0.02)AC16細胞miR-503的表達水平降低(t=11.89，P<0.01)。

表3 雙熒光素酶報告實驗驗證UCA1和miR-503的靶向關系

2.5 干擾miR-503對缺氧處理的AC16增殖、凋亡的影響 相對于Model組、anti-miR-NC組，anti-miR-503組AC16細胞存活率、Ki67蛋白表達、S期細胞比例顯著升高，細胞凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達、G0～G1期細胞比例顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖4、5和表4)。

表4 干擾miR-503對缺氧處理的AC16增殖凋亡的影響

3 討論

lncRNA作為心血管疾病進展的重要調(diào)節(jié)劑，與AMI、缺血性心臟病等缺氧誘導的心肌細胞損傷性疾病有關[8]。探討lncRNA UCA1在缺氧誘導的心肌細胞損傷中的作用，有望為缺氧引起的AMI防治提供有效策略。

研究[9]顯示，血漿UCA1較高的慢性心力衰竭(CHF)病人的生存率較低，UCA1低表達對CHF病人生存具有預測作用。UCA1通過與miR-184競爭性結合增強沉默同源盒A9表達從而促進了心臟肥大進程[10]。UCA1通過與miR-206相互作用加劇氧化低密度脂蛋白誘導的巨噬細胞氧化應激和細胞凋亡，對動脈粥樣硬化進展具有潛在促進作用[11]。本研究探討UCA1在AMI中作用發(fā)現(xiàn)，缺氧可誘導AC16細胞凋亡和G0～G1期阻滯，抑制細胞存活，誘導AC16細胞損傷。缺氧誘導后AC16細胞中UCA1表達降低，提示UCA1低表達可能與缺氧誘導的細胞損傷有關。轉染pcDNA-UCA1上調(diào)UCA1表達后，缺氧誘導的AC16細胞凋亡率、G0～G1期細胞比例顯著降低，細胞存活、S期細胞比例顯著升高。Ki67是一種僅表達增殖期細胞的核內(nèi)蛋白，與細胞增殖密切相關，是評價細胞增殖能力的常用指標[12]。Cleaved-caspase3為細胞凋亡發(fā)生的最終執(zhí)行因子，在多種凋亡信號刺激下，caspase3裂解為Cleaved-caspase3，促進細胞凋亡[13]。本研究顯示，上調(diào)UCA1表達可降低缺氧誘導的AC16細胞中Cleaved-caspase3表達水平，提高Ki67表達水平，與功能實驗結果一致，說明上調(diào)UCA1能夠減輕缺氧誘導的AC16細胞損傷。

miR-503是心臟功能和心血管疾病的重要表觀遺傳調(diào)控因子。在患有糖尿病的急性缺血性中風的病人中miR-503明顯表達增加[14]。miR-503通過靶向Apelin-13促進結締組織生長因子和轉化生長因子表達，促進膠原蛋白產(chǎn)生，進而促進血管緊張素Ⅱ誘導的心臟纖維化[15]。miR-503低表達還與炎癥介導的血管生成有關[16]。此外，lncRNA肺腺癌轉移相關轉錄本1(MALAT1)可能通過抑制miR-503表達抑制內(nèi)皮細胞黏附和促炎因子分泌，對動脈粥樣硬化形成具有抑制作用[17]。本研究通過雙熒光素酶報告基因證實，UCA1對miR-503具有靶向調(diào)控作用，上調(diào)UCA1可降低miR-503的表達水平。此外，缺氧誘導后AC16細胞中miR-503表達升高，轉染anti-miR-503下調(diào)miR-503表達可提高缺氧條件下AC16細胞存活率、S期細胞比例、Ki67表達水平，降低Cleaved-caspase3表達水平，減輕缺氧誘導的細胞凋亡和G0～G1期阻滯，改善缺氧誘導的AC16細胞損傷，與上調(diào)UCA1表達對缺氧誘導AC16細胞損傷的保護作用一致。以上研究提示UCA1可能靶向miR-503保護缺氧誘導的AC16細胞損傷。

綜上所述，lncRNA UCA1可能通過靶向下調(diào)miR-503表達保護心肌細胞免受缺氧誘導的損傷，提示UCA1是防治缺氧引起的AMI的重要靶點。