血小板活化水平與慢性阻塞性肺疾病急性發(fā)作相關(guān)肺動(dòng)脈高壓的臨床研究

張書茵， 姜 儉， 邵榮海， 湯文夏， 李 響， 趙益明， 張宇航， 劉國濤， 朱靜亞， 陸士奇

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病，其特征是持續(xù)存在的呼吸系統(tǒng)癥狀和氣流受限[1]。我國40歲以上人群中COPD的患病率高達(dá)8.2%[2],嚴(yán)重影響患者的生命質(zhì)量，給社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。隨病情進(jìn)行性發(fā)展，會(huì)引起肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension, PH),最終發(fā)展為肺源性心臟病[3]。因此，早期診斷及預(yù)防COPD相關(guān)PH成為該疾病研究的重點(diǎn)。

目前臨床評估PH的方法中，胸部CT、超聲等影像學(xué)檢查手段因其便利、無創(chuàng)傷且操作性強(qiáng)逐漸在臨床普及[4-5]。同時(shí)，部分血清學(xué)標(biāo)志物也被研究證實(shí)與PH有密切聯(lián)系。其中血小板活化導(dǎo)致的患者體內(nèi)明顯的高凝狀態(tài)及肺小動(dòng)脈內(nèi)微血栓形成，是COPD患者病情進(jìn)展并導(dǎo)致PH的主要原因之一，因此，血小板活化標(biāo)志物CD61及CD62P受到關(guān)注[6-8]。

本研究擬通過心臟超聲檢查結(jié)果判斷患者是否存在PH及病情嚴(yán)重程度,用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD62P/CD61雙陽性(CD62P+/CD61+)血小板百分比及其平均熒光強(qiáng)度，用以了解血小板活化比例及活化程度，從而探索血小板活化水平與AECOPD患者PH病情及嚴(yán)重程度的相關(guān)性，并初步檢驗(yàn)CD62P+/CD61+血小板百分比在臨床評估COPD急性發(fā)作(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease, AECOPD)相關(guān)PH的可行性和應(yīng)用潛力。

1 資料與方法

1.1研究對象 回顧性收集并分析2019年1月至2020年12月在太倉市第一人民醫(yī)院住院診斷為AECOPD的患者共計(jì)122例,年齡49～93歲，平均年齡74.8歲。入組標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)均遵循STROBE規(guī)范[9]。入組標(biāo)準(zhǔn)：在24 h內(nèi)入院并符合COPD急性發(fā)作診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，患者本人或家屬同意參加本次研究。排除既往合并其他心血管疾病，存在其他呼吸系統(tǒng)疾病、特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓、慢性血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓、結(jié)締組織病、甲狀腺功能亢進(jìn)、人類免疫缺陷病毒感染、門脈高壓及血吸蟲病等的患者；排除患有痛風(fēng)、血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤，肝腎功能不全，脾切除，長期使用抗凝劑及抗血小板藥物的患者；排除患者本人或家屬未簽署知情同意或不能配合行相關(guān)檢查的患者。本研究得到太倉市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[太倉科技局審批號：(2019)倫研批第(KY-2019-26)號]。

1.2研究方法

1.2.1 AECOPD及COPD相關(guān)PH定義 COPD診斷符合2017 GOLD慢性阻塞性肺疾病全球倡議[1]。急性加重期標(biāo)準(zhǔn)為患者具有明確COPD病史，就醫(yī)時(shí)臨床表現(xiàn)為咳嗽、咳痰加重，或咳出物為膿性痰液，呼吸困難，超出日常變異范圍，或有發(fā)熱、胸悶氣喘及咳黃痰，或是需要改變平時(shí)的用藥方案，病情較穩(wěn)定期加重或需住院進(jìn)行治療,診斷為AECOPD。COPD相關(guān)PH患者診斷指標(biāo)符合2009年歐洲心臟病學(xué)會(huì)PH診斷和治療指南相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[10-11]。根據(jù)心臟彩色多普勒超聲檢查結(jié)果計(jì)算肺動(dòng)脈收縮壓(PASP)，PASP≥36 mm Hg，且三尖瓣反流速度>2.8 m/s，在對其他引起PH的原因進(jìn)行排除后，可擬診斷為COPD相關(guān)的PH。

1.2.2 相關(guān)臨床資料收集 收集患者臨床相關(guān)數(shù)據(jù)，包括一般情況、病史、入院24 h內(nèi)心臟超聲結(jié)果、入院24 h內(nèi)血?dú)夥治鰯?shù)據(jù)、入院24 h血液學(xué)相關(guān)指標(biāo)，檢測CD62P+/CD61+血小板活化比例等。

1.2.3 超聲心動(dòng)圖檢查 由同一名醫(yī)學(xué)影像專業(yè)技術(shù)人員對入組患者進(jìn)行檢查。使用GE Vivid E9彩色多普勒超聲診斷儀，M5S探頭，探頭頻率1.7～3.4 MHz。測量參數(shù)及測量方法符合之前文獻(xiàn)報(bào)道[12-13]。

1.2.4 流式細(xì)胞檢測CD62P+/CD61+血小板活化比例及膜蛋白表達(dá)熒光強(qiáng)度 抽取入組患者靜脈血2 mL，激活血小板(ADP+全血)。在對照管中加入PE同型對照、CD61 PerCP各20 μL，在試驗(yàn)管中加入CD62-PE、CD61 PerCP各20 μL。在對照管和試驗(yàn)管中各加入未激活或激活的血標(biāo)本5 μL并混勻，室溫暗處孵育 15～20 min。各管中加入1 mL 冷的固定液(2～8 ℃)，充分混勻，2～8 ℃陰暗處放置30 min，24 h內(nèi)上機(jī)分析。記錄CD62P+/CD61+血小板百分比及熒光強(qiáng)度。

1.2.5 AECOPD患者分組 AECOPD患者根據(jù)入院24 h心臟超聲結(jié)果計(jì)算PASP，分為單純AECOPD組(n=45)及AECOPD合并PH組(n=77)[14]。按照PASP將入組患者分為無PH組(PASP<36 mm Hg,n=45)、輕度PH組(36 mm Hg≤PASP≤50 mm Hg，n=42)、中重度PH組(PASP>50 mm Hg,n=35)[12, 15]。

2 結(jié)果

2.1臨床指標(biāo) 單純AECOPD組平均患病時(shí)間短，吸煙人數(shù)占比及吸煙支數(shù)明顯低于合并PH組(P均<0.05)。AECOPD合并PH組血清學(xué)炎癥指標(biāo)明顯高于單純AECOPD組，主要表現(xiàn)為以下三個(gè)指標(biāo)：血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、C-反應(yīng)蛋白(C-reaction protein，CRP)及白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)。見表1。

表1 單純AECOPD與AECOPD合并PH患者一般情況

2.2心臟超聲及血小板活化指標(biāo) 合并PH組患者血小板百分比及CD62P+/CD61+熒光強(qiáng)度均明顯高于單純AECOPD組患者(P<0.01)。見表2。

表2 單純AECOPD與AECOPD合并PH患者心臟超聲及血小板活化指標(biāo)

2.3AECOPD患者合并PH的獨(dú)立影響因素 根據(jù)單因素Logistic回歸分析得到,COPD患病時(shí)間(年)、吸煙與否、吸煙支數(shù)、WBC、CRP、IL-6、CD62P+/CD61+血小板百分比、熒光強(qiáng)度、RV內(nèi)徑、RA內(nèi)徑及TAPSE等11個(gè)指標(biāo)是對AECOPD患者合并PH診斷具有意義的自變量。見表3。

表3 AECOPD合并PH影響因素的單因素回歸分析結(jié)果

2.4多因素回歸分析 以單因素分析結(jié)果為基礎(chǔ)，結(jié)合臨床實(shí)際，將吸煙與否、WBC、CRP、IL-6、CD62P+/CD61+血小板百分比、性別進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，納入標(biāo)準(zhǔn)為0.05，剔除標(biāo)準(zhǔn)為0.10，分析方法為進(jìn)入。由多因素回歸分析結(jié)果可知，對變量進(jìn)行調(diào)整后，男性吸煙患者隨IL-6升高，CD62P+/CD61+血小板百分比增加、CRP增加，AECOPD患者合并PH的可能性增加。該模型擬合優(yōu)度P=0.984(Hosmer and Lemeshow檢驗(yàn))，能正確分類90.2%的研究對象。見表4。

表4 AECOPD合并PH影響因素的多因素回歸分析結(jié)果

2.5CD62P+/CD61+血小板百分比聯(lián)合血清學(xué)指標(biāo)與AECOPD合并PH患者病情的相關(guān)性 IL-6的ROC曲線AUC為0.718，預(yù)測AECOPD患者合并PH的切點(diǎn)為29.6 pg/mL，敏感度為54.5%，特異度為80.0%。CRP的ROC曲線AUC為0.760，預(yù)測AECOPD患者合并PH的切點(diǎn)為47.5 mg/L，敏感度為59.7%，特異度為86.7%。CD62P+/CD61+血小板百分比ROC曲線的AUC為0.901，預(yù)測AECOPD患者合并PH的切點(diǎn)為11.6%，敏感度為70.0%，特異度86.7%。IL-6、CRP、IL-6及CD62P+/CD61+血小板百分比三者聯(lián)合預(yù)測AUC為0.972，高于單一指標(biāo)預(yù)測AECOPD患者合并PH的診斷能力。見圖1。

圖1 IL-6、CRP、CD62P+/CD61+血小板百分比預(yù)測AECOPD患者合并PH的ROC曲線

2.6CD62P+/CD61+血小板百分比與AECOPD合并PH患者嚴(yán)重程度的關(guān)系 隨PASP增加，CD62P+/CD61+血小板百分比逐漸升高，Spearman線性相關(guān)系數(shù)為0.822，Pearson線性相關(guān)系數(shù)為0.719，P<0.01。中重度PH患者CD62P+/CD61+血小板百分比及相應(yīng)熒光強(qiáng)度較輕度PH患者更高。中重度PH患者CD62P+/CD61+血小板百分比及相應(yīng)熒光強(qiáng)度較無PH患者更高(P<0.05)。見圖2、表5。

圖2 PASP與CD62P+/CD61+血小板百分比的線性關(guān)系

表5 不同嚴(yán)重程度的AECOPD合并PH患者基本情況

3 討論

PH是COPD患者主要的心血管并發(fā)癥之一，并且是COPD病程進(jìn)一步發(fā)展到肺源性心臟病的核心環(huán)節(jié)[16]。國內(nèi)外研究[16-17]均顯示，PH是COPD患者死亡及不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。

COPD合并PH的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，一般認(rèn)為，COPD所致的PH在組織病理學(xué)上的主要變化：低氧及炎癥引起的肺小血管異常收縮，平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞增殖，血管內(nèi)膜纖維化及管壁增厚，最終導(dǎo)致血流動(dòng)力學(xué)紊亂，肺動(dòng)脈壓力增高。而早期評估、及時(shí)確診、對癥緩解是目前主要的臨床措施。因此，更為及時(shí)方便的臨床診斷指標(biāo)對幫助臨床醫(yī)生判斷患者病情并采取相應(yīng)治療手段有較大意義。

目前臨床常用評估PH病情的影像學(xué)手段為多普勒超聲心動(dòng)圖。研究[18]證實(shí)，超聲檢查與右心導(dǎo)管測量結(jié)果無明顯差異，兩者相關(guān)性良好。

本研究122例入組患者中，吸煙患者占76.2%，年平均吸煙數(shù)為588.9支，男性普遍吸煙比例高于女性，這一結(jié)果符合臨床實(shí)際情況。本研究中患者的BMI較低，平均為21.8，推測是由于年齡偏大、納差、長期低氧呼吸困難、反復(fù)感染及用藥所致。這一結(jié)果與國外研究[19-20]結(jié)果一致。因此，正確勸導(dǎo)患者戒煙，并維持健康良好的生活方式有助于患者延緩病情進(jìn)展。

本研究將患者分為單純AECOPD組及AECOPD合并PH組，單純AECOPD患者PASP為(30.4±5.3)mm Hg，而AECOPD合并PH患者的PASP為(51.2±12.6)mm Hg，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。PH發(fā)病率為63.1%，略高于文獻(xiàn)[21]報(bào)道(35%～40%)，推測是由于本院收治的患者年齡較大，患病平均時(shí)間為15.9年，因此PH發(fā)生率較高。

對兩組患者數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素及多因素Logistic回歸分析，結(jié)果提示，男性、吸煙、IL-6、CRP和CD62P+/CD61+血小板百分比是AECOPD患者合并PH的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

血小板活化直接參與了PH形成的病理過程。AECOPD患者常合并感染、缺氧等并發(fā)癥，會(huì)直接導(dǎo)致肺血管內(nèi)膜損傷，導(dǎo)致血小板活化?；罨难“屦じ骄奂趽p傷處，形成附壁血栓，導(dǎo)致肺小動(dòng)脈管腔堵塞，增加肺血管壓力。另外，活化的血小板釋放多種物質(zhì)參與PH形成，具體如下：①釋放血小板4因子，對抗組胺的抗凝血作用；②釋放血栓素A2，直接促進(jìn)血小板的聚集和二磷酸腺苷的釋放；③血小板活化因子、二磷酸腺苷、5-羥色胺和凝血酶敏感蛋白促進(jìn)血小板聚集，引起肺血管痙攣、收縮，促進(jìn)肺血管平滑肌增殖；④釋放血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、血小板源性生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子β等多種生長因子，刺激血管修復(fù)損傷及內(nèi)皮細(xì)胞增生，同時(shí)刺激成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增生形成結(jié)締組織，導(dǎo)致肺血管重構(gòu)。CD62P是一種血小板活化特異性糖蛋白，表達(dá)于血小板內(nèi)含的α顆粒膜、致密體顆粒膜及溶酶體顆粒膜表面，能夠反映血小板活化狀態(tài)[22-24]，是臨床上判定血小板活化狀態(tài)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

本研究結(jié)果提示，相關(guān)炎癥因子也與PH的發(fā)生、發(fā)展具有密切聯(lián)系。在COPD相關(guān)PH發(fā)病最初階段，存在于肺動(dòng)脈外膜的成纖維母細(xì)胞在長期缺氧暴露及肺動(dòng)脈壓力增加的刺激下被激活，導(dǎo)致了促炎因子的大量激活[25]。其中IL-6是COPD相關(guān)PH發(fā)病初期最重要的促炎因子之一[26]。IL-6 通過多個(gè)途徑參與PH的形成：①IL-6為代表的炎性細(xì)胞因子聚集在肺血管內(nèi),刺激肺血管內(nèi)皮細(xì)胞(PVEC)、人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMC)遷移，導(dǎo)致血管重構(gòu)發(fā)生[26]；②IL-6阻止了肌肉中的胰島素信號傳遞，減弱了胰島素誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈舒張功能，同時(shí)誘導(dǎo)彈力纖維層增生，肺血管管壁增厚,管腔狹窄[27]；③IL-6促進(jìn)T淋巴細(xì)胞聚集，進(jìn)一步刺激PVEC產(chǎn)生趨化因子,誘導(dǎo)PASMC遷移及增殖。

CRP是機(jī)體受到炎癥性刺激時(shí)合成的一種急性時(shí)相蛋白。研究證明，CRP能夠參與PH形成的病理生理過程，并且其含量與肺動(dòng)脈壓力呈正相關(guān)。其參與疾病病理生理的機(jī)制主要有：①CRP在PVEC表層發(fā)揮黏附分子效應(yīng)，誘導(dǎo)單核細(xì)胞黏附，使之分泌更多的內(nèi)皮素-1、血管性假血友病因子等，促使肺血管重構(gòu)；②CRP激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號通路，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，增加肺血管管壁厚度；③CRP促進(jìn)PASMC增殖，增加PASMC的數(shù)量；④CRP誘導(dǎo)原癌基因低聚果糖基因的轉(zhuǎn)錄增加，上調(diào)多種基因的轉(zhuǎn)錄功能，從而促進(jìn)肺血管細(xì)胞增殖及重構(gòu)[28]。

眾多研究[29]表明，炎癥與凝血系統(tǒng)之間存在大量相互交叉關(guān)聯(lián)的反應(yīng)。炎癥反應(yīng)可通過多種途徑直接或間接導(dǎo)致血小板活化，進(jìn)一步加重炎癥，促使PH的發(fā)生。首先，COPD患者長期反復(fù)的肺部炎癥導(dǎo)致肺血管損傷，直接導(dǎo)致血小板活化；其次，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷激活肺部環(huán)氧化酶及啟動(dòng)血小板內(nèi)血栓烷合成酶，抑制前列環(huán)素(PGI2)合成酶，從而導(dǎo)致肺組織血栓素A2(TXA2)合成增多，PGI2合成減少，TXA2-PGI2平衡失調(diào)，導(dǎo)致血小板再聚集，促進(jìn)血小板活化；再次，患者體內(nèi)白細(xì)胞活化增多，同時(shí)激活血小板，并與活化的血小板結(jié)合形成血小板-白細(xì)胞聚集體(PLAs)，進(jìn)一步促進(jìn)PH形成；另外，IL-6可通過促進(jìn)腫瘤壞死因子(TNF)-α釋放，活化中性粒細(xì)胞，導(dǎo)致大量氧自由基釋放，損傷血管內(nèi)皮，激活外源性凝血系統(tǒng)，促使血小板活化。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，CD62P+/CD61+血小板活化百分比在臨床評估AECOPD患者合并PH方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值及應(yīng)用潛力。本研究具有一定局限性：采用心動(dòng)超聲結(jié)果作為本研究臨床診斷PH的依據(jù)而非右心導(dǎo)管，此為受臨床條件限制。右心導(dǎo)管檢查為創(chuàng)傷性檢查，且對技術(shù)要求高，在基層醫(yī)院難以開展；同時(shí)患者對有創(chuàng)檢查接受程度低。本研究為單中心隊(duì)列研究，樣本量相對不足，且研究人群局限于AECOPD患者人群，并未設(shè)置健康對照組進(jìn)行對照驗(yàn)證。進(jìn)一步的研究應(yīng)增加樣本量，設(shè)置健康人群對照組以進(jìn)行更深層次的研究及探索。