橫經席提取物降血脂功效評價的實驗研究

蒙永明 呂林艷 朱運銳 黃源春 梁云飛 鄭志遠

橫經席提取物降血脂功效評價的實驗研究

蒙永明1,2呂林艷1,2朱運銳1,2黃源春1,2梁云飛1,2鄭志遠1,2

（1.廣西梧州制藥（集團）股份有限公司，廣西 梧州 543000；2.廣西藥物提純工程技術研究中心，廣西 梧州 543000）

目的：研究和評價橫經席提取物的降血脂功效。方法：建立高血脂斑馬魚模型，制備橫經席根莖、枝葉和種子的提取物，并以高、中、低三種濃度分別處理高血脂斑馬魚，觀察和比較橫經席不同部位提取物對高血脂斑馬魚甘油三脂、膽固醇、血流速度和血管壁厚度的影響。結果：橫經席根莖、枝葉和種子的提取物均能降低高血脂斑馬魚的甘油三酯水平和膽固醇水平，并改善高血脂引起的血流速度和血管壁厚度異常。結論：橫經席提取物對實驗的動物模型具有降血脂功效。

橫經席提取物；降血脂；功效評價

引言

橫經席，又名薄葉紅厚殼、跌打將軍、獨角風等，其植株多個部位含有香豆素類、呫噸酮類、黃酮類、萜類等多種類化合物[1]，藥用前景廣闊，具有祛風濕、強筋骨、止痛、治療跌打損傷等功效。已有文獻公開了橫經席的抗炎鎮(zhèn)痛作用，并且驗證了其急性與毒性小的特點[2]。

橫經席的種植周期長，多數源自于野生采摘[3]。隨著市場需求的增長，橫經席藥材資源的供給相對緊張。鑒于橫經席藥材的珍貴，如何進一步開發(fā)更多的藥用功能、實現橫經席藥材資源的綜合利用，是需要探討的技術問題。有關橫經席的藥效學研究并不多見，目前未見有橫經席其他藥用用途的報道。本文通過建立高血脂斑馬魚模型來開展實驗，觀察比較橫經席根莖、枝葉和種子的提取物對高血脂斑馬魚甘油三脂、膽固醇、血流速度和血管壁厚度的影響，以評價橫經席提取物的降血脂功效。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗動物

黑色素等位基因突變型半透明Albino品系斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進行，年齡為受精后5天（5 dpf）的斑馬魚用于降血脂功效最大檢測濃度（maximum test concentration，MTC）測定及其功效評價。轉基因血管綠色熒光斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進行，年齡為受精后5天（5 dpf）的斑馬魚用于改善血管壁厚度功效評價。

以上所述的實驗用斑馬魚均飼養(yǎng)于28 ℃的養(yǎng)魚用水中（水質：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導率為450 μS·cm-1～550 μS·cm-1；pH為6.5～8.5；硬度為50 mg·L-1～100 mg·L-1CaCO3），由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司養(yǎng)魚中心繁殖提供，實驗動物使用許可證號為SYXK（浙）2022-0004，飼養(yǎng)管理符合國際AAALAC認證（認證編號：001458）的要求。

1.2 實驗儀器、耗材與試劑

解剖顯微鏡（SZX7，日本OLYMPUS公司）；顯微注射儀（IM300，日本Narishige公司）；拉針儀（PC-10，日本Narishige公司）；CCD相機（VertA1，上海土森視覺科技有限公司）；電動聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡（AZ100，日本Nikon公司）；精密電子天平（CP214，美國OHAUS公司）；6孔板（中國Nest Biotech公司）；心跳血流分析系統(tǒng)（ZebraBlood 3.4，法國ViewPoint Life Sciences公司）；激光共聚焦顯微鏡（A1R，日本Nikon公司）。

二甲基亞砜（DMSO，批號BCCD8942，瑞士Sigma公司）；甲基纖維素（批號B2006074，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；膽固醇探針CholEsteryl BODIPY?542/563 C11（批號2291600，美國invitrogen公司）；油紅O（批號SHBM5455，美國Sigma公司）；1.2-丙二醇（批號20211117，國藥集團化學試劑有限公司）；純蛋黃粉（批號20200809，浙江艾格生物科技股份有限公司）；D-(+)-葡萄糖（批號20201105，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.3 藥物制備

取橫經席根莖、枝葉和種子分別粉碎，各自稱取10 g所得藥粉加入50 mL純化水提取，保持微沸30 min，過濾，藥渣加入20 mL～30 mL純化水繼續(xù)提取，保持微沸20 min，再次過濾，合并兩次提取液，然后加入純化水定量至50 mL，即得含量為0.2 g·mL-1（每毫升提取液相當于0.2 g生藥）的橫經席提取物，以此作為樣品母液，并于-20 ℃分裝儲存，使用時稀釋。

陽性對照藥物：阿托伐他汀鈣片（以下簡稱阿托伐他汀鈣），白色片劑，批號202105219C，樂普醫(yī)療，陰涼避光儲存。用DMSO配制成11.6 mg·mL-1母液，-20 ℃分裝儲存，使用時稀釋。

2 實驗方法

2.1 MTC測定

隨機選取5 dpf黑色素等位基因突變型半透明Albino品系斑馬魚于燒杯中，每燒杯30尾。分別水溶給予橫經席根莖、橫經席枝葉和橫經席種子提取物高、中、低三種濃度的樣品溶液，同時設置正常對照組和模型對照組，每杯容量為25 mL。除正常對照組外，其余各實驗組均水溶給予高脂飼料（純蛋黃粉+葡萄糖）喂飼斑馬魚，建立斑馬魚高血脂模型。樣品與高脂飼料共同處理15 h（每天共同處理7.5 h）。在樣品處理期間，每天需統(tǒng)計各實驗組的斑馬魚死亡數量并及時移除。28 ℃處理48 h后，測定橫經席樣品對高血脂模型斑馬魚的MTC。

2.2 降甘油三酯功效評價

斑馬魚高血脂模型建立如“2.1”節(jié)所述，增加陽性對照阿托伐他汀鈣11.6 μg·mL-1濃度，樣品與高脂飼料共同處理15 h（每天共同處理7.5 h）。28 ℃處理48 h后，給予油紅O進行整體脂肪染色。染色結束后，每個實驗組隨機選取10尾斑馬魚在解剖顯微鏡下拍照，用NIS-Elements D 3.20高級圖像處理軟件分析并采集數據，分析斑馬魚尾部血管染色強度，以該指標的統(tǒng)計學分析結果評價橫經席樣品降甘油三酯功效。

2.3 降膽固醇功效評價

斑馬魚高血脂模型建立如“2.1”節(jié)所述，增加陽性對照阿托伐他汀鈣11.6 μg·mL-1濃度，樣品與高脂飼料共同處理15 h（每天共同處理7.5 h）。28 ℃處理32 h時，注射膽固醇探針。繼續(xù)處理16 h后，每個實驗組隨機選取10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下拍照，用NIS-Elements D 3.20高級圖像處理軟件分析并采集數據，分析斑馬魚尾部血管膽固醇熒光強度，以該指標的統(tǒng)計學分析結果評價橫經席樣品降膽固醇功效。

2.4 改善高血脂血流功效評價

斑馬魚高血脂模型建立如“2.1”節(jié)所述，增加陽性對照阿托伐他汀鈣11.6 μg·mL-1濃度，樣品與高脂飼料共同處理15 h（每天共同處理7.5 h）。28 ℃處理48 h后，每個實驗組隨機選取10尾斑馬魚置于心跳血流分析系統(tǒng)下錄制斑馬魚血流視頻，分析統(tǒng)計斑馬魚血流速度，以該指標的統(tǒng)計學分析結果評價橫經席樣品改善高血脂血流功效。

2.5 改善血管壁厚度功效評價

隨機選取5 dpf轉基因血管綠色熒光斑馬魚于燒杯中，每燒杯30尾。分別水溶給予橫經席根莖、橫經席枝葉和橫經席種子高、中、低三種濃度的樣品溶液，陽性對照阿托伐他汀鈣11.6 μg·mL-1濃度，同時設置正常對照組和模型對照組，每杯容量為25 mL。除正常對照組外，其余各實驗組均水溶給予高脂飼料，建立斑馬魚高血脂模型。樣品與高脂飼料共同處理15 h（每天共同處理7.5 h）。28 ℃處理48 h后，每個實驗組隨機選取3尾斑馬魚置于激光共聚焦顯微鏡下拍照，以斑馬魚眼部血管壁厚度定性評價橫經席樣品改善血管壁厚度功效。

2.6 數據處理

實驗數據結果均采用（均數±標準差，`c±SD）表示，運用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析，＜0.05表明差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果與討論

3.1 MTC

從表1可看出，當橫經席根莖提取物和橫經席枝葉提取物濃度均為250 μg·mL-1時，斑馬魚的表型較模型對照組狀態(tài)均開始嚴重。因此在本實驗條件下，橫經席根莖和橫經席枝葉降血脂功效的MTC均為125 μg·mL-1，橫經席種子降血脂功效的MTC為2000 μg·mL-1。

表1 橫經席樣品降血脂功效濃度摸索實驗結果（n = 30）

3.2 降甘油三酯功效評價

斑馬魚的血脂構成、脂質吸收和代謝與人類高度一致。實驗中采用高脂食物（純蛋黃粉+葡萄糖）喂飼斑馬魚，使斑馬魚血漿中的脂肪含量快速升高[4]。研究表明，碳水化合物、脂質、凝血因子等平衡的改變，可造成血管內皮損傷、紅細胞聚集（變形能力受損）及血小板異常粘附，進而造成甘油三酯和膽固醇在血管壁沉積、炎癥細胞滲出和遷移、血流動力學改變等，最終引起組織、器官壞死[5]。油紅O是一種強脂溶劑和染脂劑，可特異性地與甘油三酯等中性脂肪結合而呈橘紅色，該顯色反應常用于甘油三酯染色和定量評價[6]。在圖1的分析部位示意圖中，本實驗選取箭頭所指的斑馬魚尾部靜脈作為分析部位。

如表2和圖1所示，在本實驗條件下，與正常對照組比較，模型對照組尾部靜脈甘油三酯染色強度顯著增加，具有統(tǒng)計學差異（＜0.001），表明模型建立成功；與模型對照組比較，陽性藥阿托伐他汀鈣可顯著降低尾部靜脈甘油三酯染色強度，具有統(tǒng)計學差異（＜0.001）；橫經席根莖125 μg·mL-1濃度組尾部靜脈甘油三酯染色強度較模型對照組顯著降低，具有統(tǒng)計學差異（＜0.001）；橫經席枝葉31.2 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1和125 μg·mL-1濃度組的尾部靜脈甘油三酯染色強度均較模型對照組降低，具有統(tǒng)計學差異（＜0.05 &＜0.01 &＜0.01）；橫經席種子1000 μg·mL-1和2000 μg·mL-1濃度組尾部靜脈甘油三酯染色強度較模型對照組降低，具有統(tǒng)計學差異（均＜0.05）。

降甘油三酯功效評價中，三個橫經席樣品同濃度比較：（1）在31.2 μg·mL-1條件下，橫經席枝葉尾部靜脈甘油三酯染色強度顯著低于橫經席根莖（＜0.01）；（2）在62.5 μg·mL-1條件下，橫經席枝葉尾部靜脈甘油三酯染色強度顯著低于橫經席根莖（＜0.05）；（3）在125 μg·mL-1條件下，甘油三酯染色強度無顯著差異，但橫經席根莖尾部靜脈甘油三酯染色強度絕對值低于橫經席枝葉。由于尾部靜脈甘油三酯染色強度越低則降甘油三酯功效越佳，因此，本實驗提示橫經席枝葉的降甘油三酯功效最優(yōu)，橫經席根莖次之。

表2 橫經席樣品降甘油三酯功效評價實驗結果（`c±SD，n = 10）

注：與正常對照組比較，###＜0.001；與模型對照組比較，*＜0.05，**＜0.01，***＜0.001。

圖1 橫經席樣品處理后斑馬魚尾部靜脈甘油三酯染色強度典型圖

3.3 降膽固醇功效評價

膽固醇熒光探針CholEsteryl BODIPY?542/563 C11專門與膽固醇親和，在細胞中進行運輸和代謝，是有效的脂質運輸示蹤劑，其熒光強弱與血中膽固醇的含量高低成正比關系[7]。本實驗選取同“3.2”節(jié)所述斑馬魚尾部靜脈作為分析部位。

如表3所示，在本實驗條件下，與正常對照組比較，模型對照組尾部靜脈膽固醇熒光強度顯著增加，具有統(tǒng)計學差異（＜0.001），表明模型建立成功；與模型對照組比較，陽性藥阿托伐他汀鈣可以顯著降低尾部靜脈膽固醇熒光強度，具有統(tǒng)計學差異（＜0.01）；橫經席根莖125 μg·mL-1濃度組的尾部靜脈膽固醇熒光強度較模型對照組顯著降低，具有統(tǒng)計學差異（＜0.001）；橫經席枝葉125 μg·mL-1濃度組尾部靜脈膽固醇熒光強度較模型對照組降低，具有統(tǒng)計學差異（＜0.05）；橫經席種子1000 μg·mL-1和2000 μg·mL-1濃度組尾部靜脈膽固醇熒光強度較模型對照組顯著降低，具有統(tǒng)計學差異（＜0.01 &＜0.001）。

降膽固醇功效評價中，三個橫經席樣品同濃度比較：（1）在31.2 μg·mL-1條件下，橫經席枝葉尾部的靜脈膽固醇熒光強度顯著低于橫經席根莖（＜0.05）；（2）在62.5 μg·mL-1條件下，橫經席根莖尾部的靜脈膽固醇熒光強度絕對值與橫經席枝葉相似，無顯著差異；（3）在125 μg·mL-1條件下，膽固醇熒光強度無顯著差異，但橫經席根莖尾部靜脈膽固醇熒光強度絕對值低于橫經席枝葉。因為尾部靜脈膽固醇熒光強度越低則降膽固醇的功效越佳，故本實驗提示降膽固醇功效橫經席根莖最優(yōu)，橫經席枝葉次之。

表3 橫經席樣品降膽固醇功效評價實驗結果（`c±SD，n = 10）

注：與正常對照組比較，###＜0.001；與模型對照組比較，*＜0.05，**＜0.01，***＜0.001。

3.4 改善高血脂血流功效評價

如表4所示，在本實驗條件下，與正常對照組比較，模型對照組血流速度顯著降低，具有統(tǒng)計學差異（＜0.001），表明模型建立成功；與模型對照組比較，陽性藥阿托伐他汀鈣可以顯著增加血流速度，具有統(tǒng)計學差異（＜0.01）；橫經席根莖62.5 μg·mL-1和125 μg·mL-1濃度組血流速度較模型對照組顯著增加，具有統(tǒng)計學差異（均＜0.001）；橫經席枝葉31.2 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1和125 μg·mL-1濃度組血流速度較模型對照組增加，具有統(tǒng)計學差異（＜0.05 &＜0.05 &＜0.001）；橫經席種子500 μg·mL-1、1000 μg·mL-1和2000 μg·mL-1濃度組血流速度較模型對照組顯著增加，具有統(tǒng)計學差異（均＜0.001）。

在改善高血脂血流功效中，三個橫經席樣品同濃度比較情況如下：（1）在31.2 μg·mL-1條件下，血流速度無顯著差異，但橫經席枝葉血流速度絕對值高于橫經席根莖；（2）在62.5 μg·mL-1條件下，橫經席根莖血流速度顯著高于橫經席枝葉（＜0.001）；（3）在125 μg·mL-1條件下，血流速度無顯著差異，但橫經席根莖血流速度絕對值高于橫經席枝葉。血流速度越高，則改善高血脂血流功效越佳，因而本實驗提示改善高血脂血流功效橫經席枝葉最優(yōu)，橫經席根莖次之。

表4 橫經席樣品改善高血脂血流功效評價實驗結果（`c±SD，n = 10）

注：與正常對照組比較，###＜0.001；與模型對照組比較，*＜0.05，**＜0.01，***＜0.001。

3.5 改善血管壁厚度功效評價

實驗中選取圖2箭頭所指區(qū)域作為橫經席樣品處理后斑馬魚眼部血管壁厚度分析部位。如圖3所示，與正常對照組比較，模型對照組的血管壁厚（即圖中亮區(qū)）明顯增大。與模型對照組比較，陽性藥阿托伐他汀鈣可以顯著改善血管壁的厚度。觀察圖3結果可知，經橫經席樣品處理后的斑馬魚眼部血管內的亮區(qū)區(qū)域顯著縮小，因此在本實驗條件下，橫經席根莖、橫經席枝葉和橫經席種子均具有改善血管壁厚度的功效。

圖2 橫經席樣品處理后斑馬魚眼部血管壁厚度分析部位示意圖

圖3 橫經席樣品處理后斑馬魚眼部血管典型圖

4 結論

綜上所述，在本實驗條件下，橫經席根莖、橫經席枝葉和橫經席種子均具有降血脂功效，具體表現為降甘油三酯水平、降膽固醇水平、改善高血脂引起的血流速度和血管壁厚度異常。結合降甘油三酯功效、降膽固醇功效和改善高血脂血流功效評價的實驗結果，提示橫經席枝葉的降血脂功效最優(yōu)，橫經席根莖次之。

本文提供了一種橫經席提取物的制備方法，并通過建立高血脂斑馬魚模型評價了橫經席的降血脂功效，為進一步開發(fā)和利用橫經席中藥材提供了可行途徑。

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Experimental Study on the Evaluation for Hypolipidemic Effect of Calophylli Herba Extracts

Objective: To study and evaluate the hypolipidemic effect of Calophylli herba extracts. Methods: A hyperlipidemic zebrafish model was established and the extracts of the rhizomes, branch, leaves and seeds of Calophylli herba were prepared. The hyperlipidemic zebrafish were treated with high, medium and low concentrations respectively. The effects of the extracts from different parts of the Calophylli herba on the triglyceride, cholesterol, blood flow velocity and vessel wall thickness of the hyperlipidemic zebrafish were observed and compared. Results: The extracts from the rhizomes, branch, leaves and seeds of Calophylli herba can reduce the triglycerides level and cholesterol level of hyperlipidemic zebrafish, and improve the abnormal blood flow velocity and vessel wall thickness caused by hyperlipidemia. Conclusion: The extracts of Calophylli herba have hypolipidemic effect in the experimental animal models.

Calophylli herba extracts; hypolipidemic; effect evaluation

R282

A

1008-1151(2022)12-0119-05

2022-09-21

梧州市科技計劃項目（2022A04021）。

蒙永明（1987－），男，廣西梧州制藥（集團）股份有限公司工程師，從事藥用材料研究相關工作。

鄭志遠（1967－），男，廣西梧州制藥（集團）股份有限公司高級工程師，從事藥物研究相關工作。