基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)策略探討四君子湯治療癌性惡病質(zhì)的潛在機(jī)制

陳江鋒 林芝嫻 郭 勇

癌性惡病質(zhì)被國(guó)際共識(shí)小組定義為一種多因素綜合征，其特征是骨骼肌質(zhì)量持續(xù)下降（伴或不伴脂肪減少），不能通過(guò)常規(guī)營(yíng)養(yǎng)支持完全逆轉(zhuǎn)，導(dǎo)致進(jìn)行性損害[1]。50%～80%的癌癥患者最終會(huì)發(fā)展為惡病質(zhì)，進(jìn)一步加速了癌癥患者的死亡。因此，癌性惡病質(zhì)的治療一直是惡性腫瘤綜合治療中的重要組成部分。四君子湯被廣泛應(yīng)用于治療癌性惡病質(zhì)，其對(duì)疲勞、食欲不振、體重減輕等癥狀有較好的療效[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，四君子湯可以顯著降低血清中白細(xì)胞介素-1（interleukin 1，IL-1）、白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、胰島素樣生長(zhǎng)因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）的水平，減緩癌性惡病質(zhì)骨骼肌萎縮的發(fā)生，改善癌性惡病質(zhì)患者的營(yíng)養(yǎng)狀況，延緩疾病的進(jìn)一步發(fā)展[4-6]。然而目前四君子湯對(duì)癌性惡病質(zhì)的具體作用機(jī)制尚不清楚，鑒于中醫(yī)治療的整體觀念和中藥方劑多化合物、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的特點(diǎn)，本研究采用四個(gè)連續(xù)模塊（靶點(diǎn)預(yù)測(cè)、網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、分子對(duì)接、GO 和KEGG 富集分析）組成的綜合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討四君子湯治療癌性惡病質(zhì)的潛在機(jī)制。

1 方 法

1.1 靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

1.1.1 四君子湯的化合物 查詢中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）和中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMID，http://bidd.group/group2017/index.html），參照TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中常用的標(biāo)準(zhǔn)：口服生物利用度（OB）≥30%，藥物相似性（DL）≥0.18，Caco-2≥0，通過(guò)Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索每個(gè)活性化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，剔除沒(méi)有結(jié)構(gòu)信息的化合物。最終共搜索到105 個(gè)活性化合物。

1.1.2 四君子湯的復(fù)合靶點(diǎn) Pharmmapper server（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）是一個(gè)持續(xù)更新的綜合藥效基因匹配平臺(tái)。將105 種化合物的mol2 格式文件上傳至Pharmmapper server，generate confomers 設(shè)置為No，maximum generated conformations 設(shè)置為300。在高級(jí)選項(xiàng)中，選擇Druggable Pharmacophore Models（v2017，16159）作為靶點(diǎn)集，其他選項(xiàng)設(shè)置為默認(rèn)，獲得預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)。將搜索到的靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://stitch.embl.de），選擇的物種為Homo sapiens，去除重復(fù)、非人、非標(biāo)靶，通過(guò)檢索和轉(zhuǎn)化，最終得到四君子湯中活性化合物的450 個(gè)靶基因。

1.1.3 癌性惡病質(zhì)的靶點(diǎn) 通過(guò)DrugBank database（https://www.drugbank.ca），Online Mendelian Inheritance in Man database（OMIM，https://omim.org），Human gene database（GeneCards，https://www.genecards.org）和Therapeutic Target Database（TTD，https://db.idrblab.org/ttd/）搜集癌性惡病質(zhì)的相關(guān)靶點(diǎn)。以“Cancer cachexia”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，刪除重復(fù)靶點(diǎn)，最終搜集到1189 個(gè)靶點(diǎn)。

1.1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 用Venny 2.1 軟件（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）將四君子湯的活性化合物靶點(diǎn)與癌性惡病質(zhì)相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，選擇重疊靶點(diǎn)作為四君子湯治療癌性惡病質(zhì)的靶點(diǎn)，使用String（https://string-db.org/）對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行處理，蛋白類型設(shè)置為Homo sapiens，minimum required interaction score 設(shè)置為“medium confidence”（>0.4），其他參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)，獲得最終的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

1.2.1 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的方法 Cytoscape 是一個(gè)開放性平臺(tái)，用于可視化復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)并能將其與任何屬性的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。將化合物和蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)輸入到Cytoscape 中，并構(gòu)建不同的網(wǎng)絡(luò):復(fù)合靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.2.2 拓?fù)浞治?通過(guò)拓?fù)鋮?shù)分析，對(duì)復(fù)合靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析篩選。通過(guò)度中心性（degree centrality，DC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、介度中心性（betweeness centrality，BC）三個(gè)參數(shù)對(duì)重要靶點(diǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。這三個(gè)參數(shù)的大小代表了網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的重要性。重要節(jié)點(diǎn)表示網(wǎng)絡(luò)中輸出值高。篩選標(biāo)準(zhǔn)為DC、CC、BC 大于1 倍中位數(shù)。最后，篩選出重要靶點(diǎn)。

1.3 分子對(duì)接 通過(guò)分子對(duì)接驗(yàn)證四君子湯中化合物與重要靶點(diǎn)的結(jié)合活性，篩選出潛在的活性成分。我們之前搜集到的105 個(gè)化合物的小分子結(jié)構(gòu)都是從Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取的，并保存為mol2 格式文件。所有具有重要靶點(diǎn)蛋白晶體結(jié)構(gòu)的蛋白配體均從RCSB 蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org/）中獲得。SystemsDock（http://systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index）是一個(gè)基于網(wǎng)絡(luò)藥物學(xué)預(yù)測(cè)和分析的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，使用高精度的對(duì)接模擬和分子通路圖來(lái)充分表達(dá)配體的選擇性，揭示配體在復(fù)雜分子網(wǎng)絡(luò)中的作用。因此，我們將這兩種數(shù)據(jù)導(dǎo)入SystemsDock 中進(jìn)行分子對(duì)接，并以對(duì)接得分作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 GO 和KEGG 富集分析 將用于治療癌性惡病質(zhì)的四君子湯的相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入到DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)中（DAVID，http://david.abcc.ncifcrf.gov/）。所有的靶基因都被導(dǎo)入到基因列表中，物種被定義為人類。通過(guò)上述數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和轉(zhuǎn)換，進(jìn)行GO 生物過(guò)程和KEGG代謝通路富集分析。P<0.05 為顯著的生物過(guò)程。使用在線作圖網(wǎng)站Omishare Tools（http://www.omicshare.com/tools/index.php/）將結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 經(jīng)過(guò)篩選和刪除，在TCMSP 和TCMID 數(shù)據(jù)庫(kù)中搜集到105 個(gè)四君子湯的化合物。其中黨參16 個(gè)，白術(shù)2 個(gè)，茯苓13 個(gè)，甘草74 個(gè)。通過(guò)Pharmmapper server 對(duì)105 個(gè)化合物的靶點(diǎn)進(jìn)行搜索，經(jīng)UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)處理后得到450 個(gè)潛在化合物靶點(diǎn)。通過(guò)檢索DrugBank、OMIM、GeneCards 和TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)，共獲得1189 個(gè)癌性惡病質(zhì)的相關(guān)靶點(diǎn)。最后，通過(guò)Venny 2.1 軟件獲得藥物化合物與疾病的52 個(gè)交集靶點(diǎn)（見(jiàn)圖1）。

圖1 四君子湯作用靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的Venny 圖

2.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件，以確定靶蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。圖中的節(jié)點(diǎn)表示靶蛋白，邊表示靶蛋白之間的相關(guān)性。剔除相關(guān)性較低的節(jié)點(diǎn)，包括50 個(gè)節(jié)點(diǎn)和140條邊。拓?fù)浞治龅闹饕獏?shù)為度、接近中心性和介度中心性。初次篩選度為3.5，介度中心性為0.007233，接近中心性為0.404986，得到17 個(gè)節(jié)點(diǎn)、54 條邊。第二次篩選度是6，介度中心性為0.030593，接近中心性為0.445491，最后得到了8 個(gè)節(jié)點(diǎn)和25 條邊（見(jiàn)圖2）。在蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中，根據(jù)度的大小，INS（25），ALB（25），VEGFA（16），CCND1（15），CTNNB1（14），CYCS（13），AR（12）和ACTA1（8）被認(rèn)為是重要的靶點(diǎn)（見(jiàn)圖3）。以這8 個(gè)重要靶點(diǎn)為基礎(chǔ)，構(gòu)建化合物-重要靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖4），這個(gè)網(wǎng)絡(luò)包括96 種化合物，其中ZINC00519174（PubChem CID：928837）、Gancaonin H（PubChem CID：5481949）、Frutinone A（PubChem CID：441965）和DFV（Pub－Chem CID：114829）與5 個(gè)重要靶點(diǎn)均相關(guān)。

圖2 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浜Y選

圖3 四君子湯治療癌性惡病質(zhì)的潛在靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖4 化合物-重要靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 分子對(duì)接

2.3.1 結(jié)合活性驗(yàn)證 選取8 個(gè)重要靶點(diǎn)（INS、ALB、VEGFA、CCND1、CTNNB1、CYCS、AR 和 ACTA1），導(dǎo)入SystemsDock，與105 個(gè)四君子湯的化合物進(jìn)行對(duì)接分析。超過(guò)7.0 分的化合物有168 個(gè)（20%），5.0～7.0 分的化合物有502 個(gè)（59.8%），4.25～5.0 分的化合物有68 個(gè)（8.1%）。共有102 種化合物（12.1%）的對(duì)接分?jǐn)?shù)小于4.25。對(duì)接分?jǐn)?shù)大于7.0 說(shuō)明該化合物對(duì)靶點(diǎn)具有較強(qiáng)的結(jié)合活性，大于5.0 說(shuō)明該化合物對(duì)靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性，大于4.25說(shuō)明該化合物對(duì)靶點(diǎn)具有一定的結(jié)合活性。因此，四君子湯的活性化合物與8 個(gè)重要靶點(diǎn)具有良好的結(jié)合活性。

2.3.2 核心化合物的篩選 對(duì)接結(jié)果表明，與8 個(gè)靶點(diǎn)對(duì)接得分最高的化合物為ergosterol peroxide（PubChem CID：5351516，和CYCS），glyasperin B（PubChem CID：480784，和VEGFA），dehydroeburicoic acid（PubChem CID：15250826，和 ALB），glyasperin F（PubChem CID：392442，和INS），ergosterol peroxide（PubChem CID：5351516，和AR），taraxerol（PubChem CID：92097，和ACTA1），7，9（11）-dehydropachymic acid（PubChem CID：15226717，和CCND1）和 5' -prenylbutein（PubChem CID：11267805，和CTNNB1）。使用PyMOL 軟件對(duì)這8 對(duì)靶點(diǎn)化合物進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)接的特異性蛋白配體相互作用如圖5 所示。8 個(gè)靶點(diǎn)得分均在6 分以上的化合物為7，9（11）-dehydropachymic acid（PubChem CID：15226717），taraxerol（PubChem CID：92097），Cerevisterol（PubChem CID：10181133），hederagenin（Pub-Chem CID：73299），polyporenic acid C（PubChem CID：9805290），16 alpha-hydroxydehydrotrametenolic acid（PubChem CID：10743008），pachymic acid（Pub-Chem CID：5484385）和poricoic acid C（PubChem CID：56668247）。滿足上述兩個(gè)條件的化合物[7，9（11）-dehydropachymic acid 和taraxerol]被認(rèn)為是可能通過(guò)作用于重要靶點(diǎn)而影響癌性惡病質(zhì)的核心化合物。

圖5 蛋白質(zhì)-配體的對(duì)接模擬

2.4 GO 和KEGG 富集分析

2.4.1 GO 富集分析 用DAVID 工具對(duì)四君子湯治療癌性惡病質(zhì)的52 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析，進(jìn)一步明確交集靶點(diǎn)的可能作用。生物過(guò)程（biological process）、分子功能（molecular function）和細(xì)胞組分（cellular component）的比對(duì)條目見(jiàn)圖6。

圖6 四君子湯治療癌性惡病質(zhì)潛在靶點(diǎn)的生物學(xué)功能分析

2.4.2 KEGG 通路富集分析 通過(guò)KEGG 通路富集分析篩選出四君子湯對(duì)癌性惡病質(zhì)中36 條生物通路有顯著影響（見(jiàn)表1）。其作用機(jī)制主要涉及pathways in cancer，HTLV-I infection，viral carcinogenesis，human cytomegalovirus infection，PI3K-Akt signaling pathway，human papillomavirus infection 和thyroid hormone synthesis 等（見(jiàn)圖7）。對(duì)36 條信號(hào)通路進(jìn)行分析和整合，繪制出最終的通路圖（見(jiàn)圖8）。

表1 四君子湯靶點(diǎn)的通路分析

圖7 四君子湯治療癌性惡病質(zhì)的KEGG 富集關(guān)鍵靶點(diǎn)氣泡圖

圖8 四君子湯治療癌性惡病質(zhì)的潛在機(jī)制

3 討論

在臨床實(shí)踐中，四君子湯對(duì)癌性惡病質(zhì)的治療有顯著作用，可以減輕化療引起的毒性或肌肉萎縮[5，7-9]。本文從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度探討了四君子湯治療癌性惡病質(zhì)的潛在機(jī)制。

3.1 調(diào)節(jié)代謝 惡性腫瘤可通過(guò)自身代謝產(chǎn)生的有毒物質(zhì)或通過(guò)改變機(jī)體代謝而引起惡病質(zhì)，主要表現(xiàn)為葡萄糖代謝，脂質(zhì)代謝和蛋白質(zhì)代謝三個(gè)方面的異常。四君子湯通過(guò)其化合物如glycitein（Pub－Chem CID：5317750），isorhamnetin（PubChem CID：5281654），quercetin（PubChem CID：5280343），11-hydroxyrankinidine（PubChem CID：5318332）和AC1LCTJ1（PubChem CID：637112），可刺激INS 與其受體結(jié)合，調(diào)控PI3K-Akt 信號(hào)通路，上調(diào)Akt2 的表達(dá)，影響下游靶點(diǎn)，抑制PCK2 的表達(dá)，最終抑制胰島素抵抗[10-11]，調(diào)節(jié)糖代謝，抑制癌性惡病質(zhì)的發(fā)展。在四君子湯中，影響FABP3 的活性成分包括5 alpha-stigmastan-3，6-dione（PubChem CID：13992092），Ergosta -7，22 e -dien -3beta -ol（PubChem CID：5283628），poricoic acid C（PubChem CID：56668247），glyasperin C（PubChem CID：480859），gancaonin A（PubChem CID：5317478），和licocoumarone（Pub－Chem CID：503731），這些活性成分通過(guò)影響FABP3來(lái)調(diào)控PPAR 信號(hào)通路，進(jìn)而下調(diào)下游靶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，抑制脂質(zhì)分解和脂肪酸氧化，從而降低機(jī)體能量消耗[12]。此外，四君子湯中的Taraxerol（Pub－Chem CID：92097）、perlolyrine（PubChem CID：160179）、Stigmasterol（PubChem CID：5280794）等成分可能通過(guò)調(diào)控mTOR 下游信號(hào)通路磷酸化4EBP1，增加eIF4E 和eIF4G 的結(jié)合活性，最終促進(jìn)骨骼肌蛋白合成[13]。化合物如11-hydroxyrankinidine（PubChem CID：5318332）和AC1LCTJ1（PubChem CID：637112）作用于INS，Quercetin 作用于SKP1，進(jìn)一步調(diào)控PI3K/Akt/mTOR 通路[14]，從而抑制蛋白分解。

3.2 抑制腫瘤 惡性腫瘤可通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤血管生成等途徑導(dǎo)致癌性惡病質(zhì)的發(fā)生發(fā)展。四君子湯的活性成分licochalcone B（PubChem CID：5318999）、isorhamnetin（PubChem CID：5281654）、calycosin（PubChem CID：5280448）等可能通過(guò)影響Wnt 和JAK-STAT 信號(hào)通路，抑制CCND1、CTNNB1、STAT5A 的表達(dá)[15-17]，調(diào)控細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖，發(fā)揮其抗腫瘤作用。7，9（11）-dehydropachymic acid（PubChem CID：15226717）、poriferasta-7，22 e-dien-3beta-ol（Pub-Chem CID：5283663）、luteolin（PubChem CID：5280445）等活性成分可能作用于IL6ST 和AR[18-19]，調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終抑制腫瘤細(xì)胞增殖。在四君子湯中，licochalcone B（PubChem CID：5318999）作 用 于STAT5A 和CYCS[20-22]，抑制JAK-STAT 等信號(hào)通路下游表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。licochalcone B（Pub－Chem CID：5318999）對(duì)STAT5A 和CYCS 的調(diào)控可能是四君子湯對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡調(diào)控的關(guān)鍵部分。此外，四君子湯可能通過(guò)calycosin（PubChem CID：5280448）作用于VEGFA，調(diào)控PI3K-Akt、HIF-1、VEGF 信號(hào)通路下游基因的表達(dá)，最終抑制腫瘤血管生成[23-24]。

4 結(jié)論

運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法預(yù)測(cè)四君子湯治療癌性惡病質(zhì)的化合物、靶點(diǎn)和通路。其潛在機(jī)制可能主要集中在調(diào)節(jié)代謝和抑制腫瘤兩個(gè)方面，調(diào)節(jié)代謝包括調(diào)節(jié)葡萄糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的代謝，抑制腫瘤包括防止細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制血管生成。特異性信號(hào)通路分析表明，四君子湯主要通過(guò)PI3K-Akt 和Wnt 信號(hào)通路發(fā)揮治療癌性惡病質(zhì)的作用。因此，四君子湯通過(guò)多個(gè)化合物、多個(gè)靶點(diǎn)、多個(gè)通路的直接或間接協(xié)同作用，能夠有效地對(duì)抗癌性惡病質(zhì)。然而，本研究?jī)H是基于數(shù)據(jù)分析，尚需要進(jìn)一步的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。