炮制對(duì)硫熏白芍飲片檢控指標(biāo)的影響

丁 妍，孔 銘，徐亞運(yùn)，李松林

0 引 言

硫磺熏蒸是中藥材常用加工方法，然而，過(guò)度硫熏會(huì)導(dǎo)致藥材SO2等有害殘留物增加[1-2]，主要活性成分轉(zhuǎn)化，生成含硫衍生物[3-5]，藥效降低，存在安全隱患[6-7]。因此國(guó)內(nèi)外以SO2殘留量為檢控指標(biāo)用于控制硫熏藥材質(zhì)量，其中現(xiàn)版《中國(guó)藥典》規(guī)定白芍等10味中藥材及其飲片SO2殘留量不得超過(guò)400 mg/kg[8]。白芍為毛茛科植物芍藥(PaeonialactifloraPal1.)的干燥根，臨床常用大宗藥材，也是傳統(tǒng)采用硫熏加工的藥材。白芍的有效成分主要為芍藥苷、羥基芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等，統(tǒng)稱為白芍總苷(TGP)，其作為聯(lián)合用藥和輔助用藥，可增強(qiáng)其他藥物的療效[9]。中藥飲片是臨床方劑和中成藥的重要原料，其質(zhì)量直接影響中醫(yī)臨床療效。飲片經(jīng)過(guò)不同炮制加工過(guò)程，不論外觀性狀還是內(nèi)在品質(zhì)、藥性與藥材相比均發(fā)生了明顯變化。前期研究發(fā)現(xiàn)《中國(guó)藥典》SO2殘留測(cè)定方法在測(cè)定硫熏白芍藥材時(shí)存在假陰性和限量不客觀的不足[10]，而白芍硫熏特征衍生物的限量檢查可作為硫熏白芍藥材檢控的有效補(bǔ)充[11-13]，但硫熏特征衍生物結(jié)合SO2殘留能否作為硫熏白芍飲片的檢控指標(biāo)有待深入研究加以科學(xué)評(píng)估。本研究選擇《中國(guó)藥典》收載的白芍飲片法定品種炒白芍、酒白芍為研究對(duì)象，考察不同炮制方法對(duì)硫熏飲片SO2殘留量、硫熏特征標(biāo)志物及主要活性成分含量的影響，為硫熏白芍飲片檢控指標(biāo)的選擇提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料Waters 2695高效液相色譜儀(美國(guó)Waters)；Waters 2996紫外檢測(cè)器(美國(guó)Waters)；METTLER 萬(wàn)分之一及百萬(wàn)分之一電子天平(瑞士梅特勒公司)；KQ-250E型醫(yī)用超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Millipore Milli-Q 超純水制備儀(美國(guó)Millipore公司)。

對(duì)照品沒(méi)食子酸(購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110831-201605，純度>98%)；磺酸化芍藥苷自制，純度>98 %；芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酸(成都普菲德生物科技股份有限公司，批號(hào)分別為140518、PS000826、140807，純度均>98%)；五沒(méi)食子酰葡萄糖(四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)為140611，純度>98%)；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

生白芍飲片(批號(hào)150921)購(gòu)自亳州市萬(wàn)珍中藥飲片公司，經(jīng)李松林研究員鑒定為毛莨科植物芍藥PaeoniaLactifloraPall.干燥根的切制干燥飲片。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備①硫熏白芍飲片制備：取未硫熏白芍飲片400 g，加水40 mL，放置在自制硫熏裝置中，硫磺用量10 g/h，熏制2 h，取出，于50 ℃鼓風(fēng)干燥后，室外晾曬15 d，即為硫熏白芍飲片[12]。②炒白芍和炒硫熏白芍飲片制備：取未硫熏白芍飲片和自制硫熏白芍飲片200 g，置炒制容器內(nèi)，文火炒制18 min，至斷面呈微黃色，偶有焦斑為止[14]，各平行制備2份。③酒白芍和酒硫熏白芍飲片制備：取未硫熏白芍飲片和自制硫熏白芍飲片200 g，置于托盤(pán)容器內(nèi)，加入黃酒20 g，然后平鋪開(kāi)來(lái)，密閉2 h。取出，放于炒至容器內(nèi)，用文火炒制23 min，斷面呈黃色，偶有焦斑，有酒香氣[14]，即得酒炙硫熏白芍飲片樣品，平行制備2份。

1.2.2 硫熏特征衍生物和活性成分的含量測(cè)定采用HPLC法測(cè)定硫熏特征衍生物及芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、沒(méi)食子酸、五沒(méi)食子酰葡萄糖、苯甲酸5種活性成分含量。

色譜條件：根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道確定色譜條件[11]，Altima C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫(0～20 min，5%→10%A；20～40 min，10%→20%A；40～90 min，20%→30% A)；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積20 μL。

混合對(duì)照品溶液的制備：精密稱取沒(méi)食子酸、磺酸化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酸、五沒(méi)食子酰葡萄糖對(duì)照品適量，加甲醇制備成0.061、0.176、0.152、1.133、0.012、0.099 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：取白芍飲片粉末0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇溶液50 mL，超聲提取(250 W，50 kHz)30 min，用50%乙醇補(bǔ)足溶液，靜置，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾上清液[11]，即得炒白芍、炒硫熏白芍、酒白芍和酒硫熏白芍供試品溶液。

1.2.3 SO2殘留量測(cè)定采用《中國(guó)藥典》2015年版(四部)“二氧化硫殘留量測(cè)定法(酸堿滴定法)”測(cè)定硫熏白芍飲片[14]，炒硫熏白芍飲片及酒硫熏白芍飲片的SO2殘留量。

2 結(jié) 果

2.1 HPLC法測(cè)定硫熏特征衍生物和活性成分的含量HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。硫熏特征衍生物及芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、沒(méi)食子酸、五沒(méi)食子酰葡萄糖、苯甲酸5種活性成分測(cè)定結(jié)果顯示，炒硫熏白芍中芍藥苷含量略低于炒白芍，分別為28.00 mg/g和30.18 mg/g。白芍飲片硫熏后活性成分轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生磺酸化芍藥苷，含量為3.93 mg/g，而經(jīng)炒制和酒炙后，磺酸化芍藥苷含量分別為3.99 mg/g、3.92 mg/g，含量未見(jiàn)明顯變化。見(jiàn)圖2。

1:沒(méi)食子酸; 2:磺酸化芍藥苷; 3:芍藥內(nèi)酯苷; 4:芍藥苷; 5:苯甲酸; 6:五沒(méi)食子酰葡萄糖

圖2 不同白芍飲片中硫熏特征衍生物和活性成分的含量

2.2 SO2殘留量測(cè)定法測(cè)定白芍不同炮制品中SO2含量結(jié)果硫熏白芍飲片、炒硫熏白芍飲片及酒硫熏白芍飲片的SO2殘留量測(cè)定結(jié)果顯示，白芍飲片經(jīng)硫熏后SO2殘留顯著增加，本實(shí)驗(yàn)中白芍飲片熏蒸2 h后，SO2殘留量達(dá)861.08 mg/kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了《中國(guó)藥典》規(guī)定的400 mg/kg的限量標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)判為不合格白芍飲片。然而經(jīng)炒制后，SO2殘留量明顯降低，測(cè)得量為323.59 mg/kg，降低了62.42%，按《中國(guó)藥典》炒白芍的SO2殘留量限量要求，則屬于合格飲片。同樣，硫熏白芍酒炙后，SO2殘留殘留量為364.46 mg/kg，降低了57.67%，也可判斷為合格飲片。見(jiàn)圖3。

圖3 硫熏白芍飲片SO2殘留量

3 討 論

3.1 炮制對(duì)硫熏白芍飲片SO2殘留量的影響本研究表明，炮制可降低硫熏白芍SO2殘留量，但不能完全去除SO2殘留，不合格的硫熏飲片經(jīng)炮制后可使SO2殘留達(dá)到飲片標(biāo)準(zhǔn)。因此，SO2殘留無(wú)法體現(xiàn)飲片實(shí)際的硫熏程度，單一的SO2檢控指標(biāo)對(duì)硫熏飲片的檢控可能存在不足。

3.2 炮制對(duì)硫熏白芍飲片含硫衍生物的影響白芍飲片硫熏后活性成分轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生磺酸化芍藥苷，而經(jīng)炒制和酒炙后，含量未見(jiàn)明顯變化，表明炮制過(guò)程對(duì)硫熏白芍特征衍生物影響較小。研究顯示白芍藥材中磺酸化芍藥苷的含量與硫熏程度呈正相關(guān)[13]，是白芍藥材硫熏程度的真實(shí)反映。因此，我們認(rèn)為磺酸化芍藥苷同樣真實(shí)反映了白芍飲片的硫熏程度，可作為白芍飲片的硫熏檢控指標(biāo)。

3.3 炮制對(duì)硫熏白芍飲片整體質(zhì)量的影響未硫熏白芍飲片炒制后，芍藥苷和五沒(méi)食子酰葡萄糖含量稍有下降，苯甲酸含量升高，化合物總量降低；而酒炙后，沒(méi)食子酸、氧化芍藥苷，芍藥苷和五沒(méi)食子酰葡萄糖含量則均有所增加，化合物總量增加。炒硫熏白芍相比于炒白芍，化合物總量增加，化學(xué)成分組成及比例明顯改變；酒硫熏白芍相比于酒白芍，與炒硫熏白芍相比于炒白芍含量變化趨勢(shì)相同。硫熏白芍飲片炮制前后與未硫熏白芍飲片炮制前后含量變化趨勢(shì)相同，炒制后化合物總量略有下降，而酒炙后化合物總量略有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。總之，白芍炮制前后化合物整體質(zhì)量變化較小，硫熏導(dǎo)致的化學(xué)成分轉(zhuǎn)化是導(dǎo)致飲片質(zhì)量改變的主要因素。

3.4 硫熏白芍飲片安全性檢控指標(biāo)評(píng)估研究發(fā)現(xiàn)白芍硫熏后化學(xué)成分改變，且已在硫熏白芍中發(fā)現(xiàn)6個(gè)含硫衍生物[15]，同時(shí)硫熏導(dǎo)致白芍活性和體內(nèi)吸收代謝改變，存在腎毒性的隱患[16]，需加強(qiáng)對(duì)硫熏白芍的質(zhì)量控制。當(dāng)前單一的SO2殘留指標(biāo)在檢控硫熏白芍藥材存在不足。綜合本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，炮制可降低飲片SO2殘留量，但磺酸化芍藥苷受炮制影響較小。單一SO2殘留指標(biāo)不能客觀體現(xiàn)硫熏白芍飲片內(nèi)在質(zhì)量變化，磺酸化芍藥苷可直接反映硫熏白芍飲片內(nèi)在質(zhì)量，因此，SO2殘留量結(jié)合磺酸化芍藥苷可以作為硫熏白芍飲片的安全性檢控指標(biāo)。