核桃內種皮不同形態(tài)酚酸類化合物的溶劑提取率比較

沈丹玉，竇立耿，劉毅華，湯富彬，趙振東，畢良武*

1(中國林業(yè)科學研究院林產化學工業(yè)研究所，生物質化學利用國家工程實驗室，國家林業(yè)和草原局林產化學工程重點實驗室， 江蘇省生物質能源與材料重點實驗室，江蘇 南京，210042)2(南京林業(yè)大學,江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心， 江蘇 南京，210042)3(中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州，311400)4(連云港市南云臺林場管理處， 江蘇 連云港，222062)

核桃(JuglansregiaL.)，胡桃科植物，含有豐富的蛋白質、不飽和脂肪酸、維生素E、維生素B族以及鎂、鉀、鐵等多種礦質元素，具有“長壽果”的美譽，與扁桃、腰果、榛子并稱為世界“四大干果”[1-2]。同時，核桃仁尤其是核桃仁上包裹的內種皮富含酚類、黃酮類物質等抗氧化成分[3-4]。大量流行病學研究顯示，經(jīng)常食用核桃可以有效降低多種疾病的發(fā)生率，核桃中富含酚類物質是重要原因[5]。酚類物質具有抗氧化、抗炎、抗癌、提高免疫力等生物活性[6-7]。酚酸是酚類物質中的一類，約占植物源食品中酚類化合物的三分之一，多為苯甲酸和肉桂酸的羥基化衍生物，還有少量縮合酚酸[8]。研究表明酚酸與采后運輸、貯藏、誘導抗性及果實色澤和風味等品質指標密切相關[9]。酚酸的種類和含量因地理環(huán)境、氣候條件、栽培措施、提取方法等的不同有所差異[10-13]。

酚酸存在形式復雜，有可溶性游離態(tài)、可溶性酯化態(tài)和不溶性結合態(tài)3種不同的存在形式[14]。其中，可溶性酯化態(tài)和不溶性結合態(tài)酚酸大多通過酯鍵或醚鍵與多肽、蛋白質、纖維素和糖等其他大分子物質相結合，需經(jīng)水解釋放出來才能被測定[15]。不同植物中酚酸的種類和含量均有所不同。目前已有核桃中酚酸含量的報道，但研究多集中于可溶性游離型酚酸[16]。不同形態(tài)的酚酸在多種水果、谷物麩皮和核桃仁等中得到鑒定[8,17-19]，但對核桃內種皮中酚酸關注較少，尤其對于酯化態(tài)酚酸和結合態(tài)酚酸鮮見相關報道[20]?？扇苄杂坞x態(tài)酚酸在體內外實驗中均被證明有較強的抗氧化活性[7,21]，另有研究表明可溶性酯化態(tài)和不溶性結合態(tài)酚酸可以與細胞壁相結合，作用于消化道，經(jīng)酶解并釋放出生物活性物質，可以預防結腸癌等慢性疾病[22]。因此，全面分析核桃內種皮中酚酸的形態(tài)分布具有重要意義。

酚類化合物常用的萃取溶劑為甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯等，其中甲醇或乙醇水溶液被認為是提取核桃仁多酚的有效溶劑。由于氧原子電負性比氫原子大，電子云偏向氧，所以H表現(xiàn)出酸性。比較三者酸性強弱就是比較對H原子的束縛能力，也就是電子云偏向。比較三者結構，乙醇比甲醇多1個甲基，由于甲基的給電子效應，分散了原本偏向O原子的電子云密度，所以對H原子的束縛能力減弱，酸性降低。同理可得甲醇酸性比水低。水適合提取極性化合物，而甲醇、乙醇適合提取極性較小的化合物，不同比例的甲醇水溶液和乙醇水溶液是否也適用于從核桃內種皮中提取多酚，是我們要研究的問題。

酚酸化學結構相似，具有相似的物理化學性質，色譜保留時間相近，紫外可見及熒光光譜相似[14]。本研究利用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法對核桃內種皮中的可溶性游離態(tài)、可溶性酯化態(tài)和不溶性結合態(tài)3種形態(tài)的羥基苯甲酸類、羥基肉桂酸類和縮合酚酸三類14種酚酸含量進行分析，以期為核桃和其他堅果內種皮中的酚酸類化合物的生物活性研究提供數(shù)據(jù)支持與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料與試劑

1.1.1 儀器

1290 Infinity-6460 QQQ液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜儀，美國Agilent公司；FreeZone 6L真空冷凍干燥機，美國LABCONCO公司；CPA225D十萬分位分析天平，德國Sartorius公司；SB-5200 DTD大功率超聲波水浴，寧波新芝生物科技公司；Biofuge Stratos高速冷凍離心機，美國Thermo公司。

1.1.2 試劑與材料

甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙腈、甲酸(均為色譜純)，德國Merck公司；超純水(電阻率18～25 MΩ·cm)，實驗室超純水儀制備；14種酚酸標準品(表1，純度均大于98%)，美國Sigma-Aldrich公司；核桃樣品，新疆葉城。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理

核桃去掉青皮和外殼后，用液氮急凍將內種皮從核桃種仁表面分離出來，真空冷凍干燥12 h(含水量小于6%)，干燥后的核桃內種皮用粉碎機磨成細粉，過40目篩，并貯存于-20 ℃冰箱中，備用。

1.2.2 不同形態(tài)酚酸的提取制備

在本課題組前期核桃仁方法的基礎上進行改進[23]。精確稱取0.5 g核桃內種皮置于15 mL離心管里，加入10 mL溶劑，40 ℃超聲提取30 min，10 000 r/min離心5 min。再分別用5 mL溶劑重復2次進行上述提取和離心操作。合并3次上清液，并蒸發(fā)掉有機溶劑。用6 mol/L HCl調節(jié)濃縮濾液pH值為2，用等體積乙酸乙酯萃取6次，合并乙酸乙酯相，將乙酸乙酯相真空濃縮(30 ℃)，去除有機溶劑后用甲醇定容至10 mL，即得到核桃內種皮可溶性游離態(tài)酚酸。

將上述萃余水相加入10 mL 4 mol/L NaOH，30 ℃水浴2 h，用6 mol/L HCl調節(jié)反應液pH值為2，用等體積乙酸乙酯萃取6次，合并乙酸乙酯相，將乙酸乙酯相真空濃縮(30 ℃)，去除有機溶劑后用甲醇定容至10 mL，即得到核桃內種皮可溶性酯化態(tài)酚酸。

離心后的殘渣中加入10 mL 4 mol/L NaOH，30 ℃水浴2 h，用6 mol/L HCl調節(jié)反應液體pH值，用等體積乙酸乙酯萃取6次，合并乙酸乙酯相，將乙酸乙酯相真空濃縮(30 ℃)，去除有機溶劑后用甲醇定容至10 mL，即得到核桃內種皮不溶性結合態(tài)酚酸。

1.2.3 標準溶液的配制

精密稱取酚酸標準品，用甲醇分別配成單標溶液，用于儀器建立各個酚酸的離子對信息；把單標配成質量濃度為10 μg/mL的混合標準儲備液，再將儲備液逐級稀釋成質量濃度范圍為0.01～1 μg/L的混合標準工作液。所有標準溶液均置于-20 ℃避光貯存，恢復到室溫上機。

1.2.4 儀器工作條件

直接使用本課題組前期建立的儀器方法[23]。液相色譜條件：色譜柱為 Agilent Poroshell 120 EC-C18column (100 mm × 2.1 mm, 1.9 μm)，柱溫40 ℃；流動相A為0.05%(體積分數(shù))甲酸水溶液，流動相B為甲醇-乙腈(體積比1∶4)，梯度洗脫程序為0 min 85% A，1 min 80% A，12 min 50% A，15 min 40% A，17 min 5% A(均為體積分數(shù))。流速0.3 mL/min，進樣量5 μL。

質譜條件：AJS電噴霧電離源(electrospray ionization，ESI)源，正負離子掃描模式(ESI+，ESI-)，動態(tài)多反應監(jiān)測(dynamic multiple reaction monitoring，DMRM)模式，霧化器壓力為45 psi，干燥氣體流速為11 L/min，離子源溫度為300 ℃，毛細管電壓為3 500 V。各物質離子對優(yōu)化后參數(shù)及其保留時間如表1所示。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有實驗處理重復3次，數(shù)據(jù)使用SPSS 17 Duncan進行顯著性方差分析，P<0.05 表示具有顯著性差異，P<0.01表示具有極顯著差異；采用Origin 2017進行繪圖分析。

2 結果與分析

2.1 十四種酚酸的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜分析

14種酚酸在液相條件下有多處出峰時間發(fā)生重合，如原兒茶酸(1.210 min)和闊馬酸(1.223 min)、綠原酸(1.443 min)、丁香酸(1.447 min)和咖啡酸(1.476 min)、芥子酸(2.128 min)和阿魏酸(2.180 min)。基于質譜選擇優(yōu)化，這些酚酸的離子對不同，具有各自的離子通道(圖1)，即使出峰時間相同也不影響各自準確定量。

2.2 可溶性游離態(tài)酚酸

如圖2所示，隨著甲醇或者乙醇比例(體積比)的提高，可溶性游離態(tài)香草酸、綠原酸沒食子酸和丁香酸提取率呈緩慢下降趨勢，其中50%甲醇對可溶性游離態(tài)綠原酸和沒食子酸提取率高于其他比例溶劑，甲醇組可溶性游離態(tài)綠原酸提取量為乙醇組的近2倍，50%甲醇達到提取峰值(30.67 μg/g)；50%乙醇對可溶性游離態(tài)香草酸和丁香酸提取率高于其他比例溶劑，且不同溶劑對可溶性游離態(tài)香草酸和綠原酸提取率差異顯著(P<0.05)，對可溶性游離態(tài)丁香酸提取效率差異極顯著(P<0.01)；而可溶性游離態(tài)原兒茶酸則相反，隨著甲醇或者乙醇比例的提高，其提取率升高，純乙醇提取率顯著高于含水乙醇和不同比例甲醇。

隨著甲醇或乙醇比例的提高，其余9種可溶性游離態(tài)酚酸均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在70%或80%達到峰值，其中80%甲醇對可溶性游離態(tài)單寧酸(22.32 μg/g)和肉桂酸提取率顯著高于其他比例溶劑(P<0.01)，70%乙醇對可溶性游離態(tài)對羥基苯甲酸提取率高于其他比例溶劑(P<0.05)；甲醇組對可溶性游離態(tài)肉桂酸的提取率顯著高于乙醇組(P<0.01)，對可溶性游離態(tài)芥子酸提取率略高于乙醇組，對可溶性對羥基苯甲酸提取率略低于乙醇組，而對于可溶性游離態(tài)咖啡酸、闊馬酸、鞣花酸和阿魏酸提取率與乙醇組無差異(P>0.05)，不同比例的甲醇組和乙醇組溶劑對于可溶性游離態(tài)鞣花酸的提取率接近，為402.27～471.90 μg/g。鞣花酸是沒食子酸的二聚衍生物，對如結腸癌、食管癌、肝癌、肺癌、舌及皮膚腫瘤有明顯的抑制作用[24]。由于鞣花酸含量占14種酚酸里的80%左右，所以不同比例溶劑對可溶性游離態(tài)酚酸總量的提取率表現(xiàn)為與可溶性游離態(tài)鞣花酸趨勢一致。

圖2 可溶性游離態(tài)酚酸的溶劑提取率比較Fig.2 Comparison of solvent extraction efficiency of soluble free phenolic acids

2.3 可溶性酯化態(tài)酚酸

如圖3所示，除了可溶性酯化態(tài)丁香酸和綠原酸外，其余12種可溶性酯化態(tài)酚酸的提取率隨著甲醇或乙醇比例的提高呈現(xiàn)出先升后降，其中甲醇組對可溶性酯化態(tài)對羥基苯甲酸、阿魏酸、闊馬酸、肉桂酸和咖啡酸均顯著高于乙醇組(P< 0.01)，80%甲醇達到提取峰值[(1.12±0.099) ～ (17.13±2.03)μg/g]；60%乙醇和70%乙醇分別對可溶性酯化態(tài)沒食子酸[(496.75±39.85) μg/g]和芥子酸[(7.22±0.68) μg/g]提取率達到峰值，極顯著高于其他組(P<0.01)；70%乙醇和80%乙醇分別對可溶性酯化態(tài)香草酸[(19.15±2.12) μg/g]、原兒茶酸[(49.85±5.16) μg/g]、和單寧酸[(163.00±17.08) μg/g]提取率達到峰值，顯著高于其他組(P<0.05)；可溶性酯化態(tài)丁香酸和綠原酸隨著甲醇比例提高先升后降，而隨著乙醇比例提高則顯著下降，70%甲醇和80%甲醇分別對可溶性酯化態(tài)丁香酸和綠原酸的提取率最高，為(37.02±3.91) μg/g和(273.58±30.06) μg/g。同一比例的甲醇水溶液或乙醇水溶液，對可溶性酯化態(tài)對香豆酸的提取率差異不顯著(P>0.05)。

可溶性酯化態(tài)酚酸以鞣花酸、沒食子酸、綠原酸和單寧酸為主(占比總和90%)，綠原酸是一種重要的生物活性物質，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用[24]。單寧酸能抑制蛇毒蛋白的活性，對眼鏡蛇等毒素有很強的解毒作用，能治療腸道細菌傳染病，并可抑制突變，對防止UV誘發(fā)的皮膚癌和皮膚老化有效果[24]。14種可溶性酯化態(tài)酚酸的總量提取率為80%甲醇>70%甲醇>70%乙醇>80%乙醇>90%甲醇=60%乙醇>90%乙醇=100%甲醇>50%甲醇=100%乙醇，不同溶劑差異顯著(P<0.05)。

2.4 不溶性結合態(tài)酚酸

如圖4所示，甲醇和乙醇比例從50%提高到80%，不溶性結合態(tài)香草酸的提取率無顯著變化，比例提高到90%和100%時提取率顯著上升，乙醇組提取率為甲醇組的1.5倍；而其他13種不溶性結合態(tài)酚酸隨著甲醇和乙醇比例的提高，其提取率均表現(xiàn)為先升后降；甲醇組對不溶性結合態(tài)芥子酸和肉桂酸的提取率極顯著高于乙醇組(P<0.01)，而對于不溶性結合態(tài)香草酸、原兒茶酸、咖啡酸和丁香酸提取率顯著低于乙醇組(P<0.05)；甲醇組對不溶性結合態(tài)對羥基苯甲酸、阿魏酸和單寧酸的提取率顯著高于乙醇組(P<0.05)，80%甲醇達到提取率峰值，分別為(9.32±0.88) μg/g、(7.99±0.55) μg/g和(121.60±10.61) μg/g。

圖3 可溶性酯化態(tài)酚酸的溶劑提取率比較Fig.3 Comparison of solvent extraction efficiency of soluble esterified phenolic acids

圖4 不溶性結合態(tài)酚酸的溶劑提取率比較Fig.4 Comparison of solvent extraction efficiency of insoluble bound phenolic acids

不同比例的甲醇提取不溶性結合態(tài)沒食子酸差異不顯著[(381.80±40.12) ～ (618.37±60.17)μg/g]，而70%乙醇提取率最高[(1 070.26±99.36)μg/g]，且與其他比例乙醇的提取率差異極顯著(P<0.01)。沒食子酸具有抗炎、抗突變、抗氧化、抗自由基等多種生物學活性，同時具有抗腫瘤作用，可以抑制肥大細胞瘤的轉移[24]。不同比例的甲醇和乙醇對不溶性結合態(tài)對香豆酸、綠原酸、鞣花酸和闊馬酸的提取率差異不顯著(P>0.05)。不溶性結合態(tài)酚酸以沒食子酸和鞣花酸為主，占比均大于40%，故70%乙醇對14種不溶性結合態(tài)酚酸的提取率高于甲醇組和其他比例乙醇(P< 0.05)，為(2 320.34±187.53)μg/g。

3 結論

綜合以上，80%甲醇和70%乙醇適合提取核桃內種皮中大部分可溶性游離態(tài)酚酸、可溶性酯化態(tài)酚酸和不溶性結合態(tài)酚酸?？扇苄杂坞x態(tài)香草酸、綠原酸、沒食子酸的提取率隨著甲醇或乙醇比例的提高而降低；60%甲醇可以獲得較高的不溶性結合態(tài)芥子酸；乙醇組溶液尤其是50%乙醇可以提取到更多的可溶性游離態(tài)丁香酸；60%乙醇能從核桃內種皮提取到較多的可溶性酯化態(tài)沒食子酸；100%乙醇有利于提取可溶性游離態(tài)原兒茶酸和不溶性結合態(tài)香草酸。不同比例的甲醇和乙醇溶液對核桃內種皮中不同形態(tài)酚酸的提取率比較，可以直接應用于核桃內種皮各種酚酸的提取、純化，不僅有利于核桃廢棄物的綜合開發(fā)利用，也完善了核桃內種皮次生代謝產物研究。