香水蓮花花蕊醇提物對黃嘌呤氧化酶的抑制作用及其主要成分

張 靜， 侯北偉， 尹崢楨， 姜洪芳， 姚正穎， 孫力軍， 張俊杰，①

(1. 江蘇海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院， 江蘇 連云港 222005； 2. 南京野生植物綜合利用研究所， 江蘇 南京 211100)

痛風(fēng)是一種由尿酸鹽沉積引起的、與晶體相關(guān)的關(guān)節(jié)病。大量研究結(jié)果[1-3]表明：藥用植物的醇提物、水提物以及乙酸乙酯提取物等對黃嘌呤氧化酶(XOD)具有較高的抑制率，其中黃酮類、酚酸類和生物堿類等活性成分均對XOD有抑制作用，具有較強的降尿酸功能。

香水蓮花(Nymphaeasp.)為水生宿根草本植物，具有降血脂、抗氧化和抗衰老等功能[4-6]。香水蓮花富含黃酮、多糖和多酚類等活性成分，其花蕊水提物對XOD有抑制作用[7]，但其醇提物對XOD的抑制作用尚不明確。為此，作者以香水蓮花花蕊為研究材料，研究其醇提物對XOD的抑制作用，并采用液質(zhì)聯(lián)用法確定其醇提物的主要成分，為可調(diào)節(jié)尿酸水平的功能性食品開發(fā)提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

紫色香水蓮花的干燥花朵于2019年購于安徽蕪湖，由南京野生植物綜合利用研究所張衛(wèi)明研究員鑒定。取雄蕊和雌蕊，用粉碎機粉碎后過80目篩，密封保存、備用。

甲酸(色譜級)、甲醇(色譜級)、乙腈(色譜級)、黃嘌呤(X7375-10G)和黃嘌呤氧化酶(X1875-5UN)購于美國Sigma公司；陽性對照品別嘌醇片購于合肥久聯(lián)制藥有限公司；沒食子酸、鞣花酸和槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)均購于瑞士Adamas公司；其他試劑均為分析純，購于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 醇提物制備 稱取15 g樣品粉末，按料液比1∶10(m∶V)加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，浸提24 h后于60 ℃、40 kHz條件下超聲提取45 min，常溫下4 000 r·min-1離心15 min，濾渣重復(fù)提取1次；合并上清液，于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀，冷凍干燥后研磨，備用。

1.2.2 XOD抑制活性測定 XOD抑制活性的測定參照文獻(xiàn)[7，8]的方法并加以改進(jìn)。醇提物、別嘌醇片和3個標(biāo)準(zhǔn)品(沒食子酸、鞣花酸和槲皮苷)均用二甲亞砜(DMSO)溶解，配制成不同質(zhì)量濃度的樣品，其中醇提物的質(zhì)量濃度分別為0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25和2.50 mg·mL-1；別嘌醇質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0和3.0 μg·mL-1；3個標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0和2.0 mg·mL-1，均設(shè)置3個平行組。酶促反應(yīng)體系包括待測樣品200 μL(空白組為DMSO 200 μL)、1.5 mmol·L-1黃嘌呤溶液100 μL、5 U·mL-1XOD溶液3 μL，用磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)補充至10 mL；混勻后在室溫條件下于波長295 nm處測定吸光度，參照文獻(xiàn)[7]的方法計算不同質(zhì)量濃度醇提物以及陽性對照和標(biāo)準(zhǔn)品對XOD的抑制率；并以供試樣品的質(zhì)量濃度為自變量x、抑制率為因變量y擬合回歸方程，根據(jù)回歸方程計算供試樣品的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

在上述酶促反應(yīng)體系中固定XOD濃度不變，分別加入0.375、0.750、1.500和3.000 mmol·L-1黃嘌呤溶液以及0.00、1.75、2.00和2.25 mg·mL-1醇提物，按照上述方法測定吸光度，以反應(yīng)時間為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)作圖，并根據(jù)直線斜率計算反應(yīng)速率；采用雙倒數(shù)作圖法，以黃嘌呤溶液質(zhì)量濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)、反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，評價醇提物對XOD的抑制作用類型，并據(jù)此計算抑制動力學(xué)常數(shù)(Ki)。

1.2.3 醇提物主要成分分析 冷凍干燥后的醇提物和標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸、鞣花酸和槲皮苷用乙腈溶解并配制成1 mg·mL-1待測樣品，用0.4 μm有機系微孔濾膜過濾后備用。

采用Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)進(jìn)行HPLC分析。色譜柱為Eclipse XDB-C18分離柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，美國Agilent公司)。以體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-水溶液(流動相A)和乙腈(流動相B)進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序為：0～10 min，5%～13%B；10～15 min，13%～18%B；15～30 min，18%～23%B；30～40 min，23%～28%B；40～45 min，28%～33%B；45～50 min，33%～40%B；50～55 min，40%～100%B。流速0.8 mL·min-1；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量20 μL；醇提物檢測波長為260和360 nm，標(biāo)準(zhǔn)品檢測波長為360 nm。

采用Agilent 1290 Infinity LC/6460 QQQ MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)進(jìn)行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜條件： ESI離子源，噴霧電壓4 kV，霧化氣體N2，霧化壓力344.75 kPa，霧化氣流速10 L·min-1；碰撞氣體為He，碰撞電壓250 V，干燥溫度350 ℃；掃描方式為負(fù)離子，離子范圍m/z100～2 000；采用Qualitative DA Software B.08.00工作站對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，應(yīng)用回歸分析法計算IC50及Ki值；采用Origin 6.0軟件作圖。

2 結(jié)果和分析

2.1 香水蓮花花蕊醇提物對XOD的抑制活性

不同質(zhì)量濃度香水蓮花花蕊醇提物對XOD的抑制率見圖1；對XOD的抑制動力學(xué)分析結(jié)果見圖2。

由圖1可見：香水蓮花花蕊醇提物對XOD的抑制率隨其質(zhì)量濃度升高而增大，總體上差異顯著(P<0.05)。質(zhì)量濃度為0.50～1.25 mg·mL-1時，抑制率隨著質(zhì)量濃度的升高快速增大；質(zhì)量濃度為1.25～1.50 mg·mL-1時，抑制率增幅減?。毁|(zhì)量濃度為1.50～2.50 mg·mL-1時，抑制率增幅再次增大。此外，香水蓮花花蕊醇提物對XOD抑制作用的半數(shù)抑制濃度(IC50)為38.54 μg·mL-1(擬合方程y=3.91x+1.11，r2=0.994)，明顯大于陽性對照別嘌醇片的IC50值(0.015 μg·mL-1)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Different lowercases indicate the significant (P<0.05) difference.

： 0.00 mg·mL-1； ： 1.75 mg·mL-1； ： 2.00 mg·mL-1； ： 2.25 mg·mL-1.

由圖2可見：隨香水蓮花花蕊醇提物質(zhì)量濃度的提高，直線斜率和在縱軸上的截距均相應(yīng)增加，且圖中4條直線均相交于第2象限，說明香水蓮花醇提物對XOD抑制類型為混合型抑制，且該抑制反應(yīng)的動力學(xué)常數(shù)(Ki)為0.95 mg·mL-1。

2.2 香水蓮花花蕊醇提物的主要組成成分

液相色譜和質(zhì)譜分析結(jié)果表明：香水蓮花花蕊醇提物的主要成分為沒食子酸、鞣花酸和槲皮苷，且沒食子酸的吸收峰為主要峰。對這3種化合物進(jìn)行XOD抑制活性檢測，結(jié)果顯示：沒食子酸和槲皮苷對XOD均無明顯的抑制作用，而鞣花酸對XOD有較強的抑制作用，IC50值為7.56 μg·mL-1(擬合方程y=4.31x+6.81，r2=0.987)。

3 討論和結(jié)論

前期研究表明：香水蓮花花蕊水提物對XOD有抑制作用，抑制類型為競爭性抑制，半數(shù)抑制濃度(IC50)為145.80 μg·mL-1[7]。本研究結(jié)果表明：香水蓮花花蕊醇提物對XOD也有抑制作用，但抑制類型為混合型抑制，IC50值僅為38.54 μg·mL-1，說明同種植物的不同溶劑提取物對XOD的抑制類型存在差異。

研究結(jié)果表明：香水蓮花花蕊醇提物的主要成分為沒食子酸、鞣花酸和槲皮苷，其中鞣花酸對XOD的IC50值為7.56 μg·mL-1，沒食子酸和槲皮苷對XOD無抑制作用。桉(EucalyptusrobustaSmith)葉提取物中鞣花酸對XOD的IC50值為22.51 μg·mL-1[9]，與本研究結(jié)果存在差異，這可能與反應(yīng)體系及儀器設(shè)備造成的客觀誤差有關(guān)，但2個研究均證實鞣花酸對XOD具有一定的抑制作用。沒食子酸對XOD的抑制作用為特殊的混合型抑制，但抑制效果較弱，而VC可協(xié)同提高沒食子酸對XOD的抑制率[10]；鞣花酸對XOD的抑制作用為競爭性抑制[9]，而香水蓮花花蕊醇提物對XOD的抑制作用為混合型抑制，說明該醇提物中除了鞣花酸，沒食子酸及其他成分也對XOD的抑制作用有協(xié)同影響。且在香水蓮花花蕊醇提物中，沒食子酸的吸收峰為主要峰，因此，該醇提物中沒食子酸及其他成分對XOD的抑制作用有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，香水蓮花花蕊醇提物對XOD具有一定的抑制作用，且抑制率隨其質(zhì)量濃度升高而增大，抑制作用類型為混合型抑制；該醇提物中的主要成分為沒食子酸、鞣花酸和槲皮苷，其中鞣花酸對XOD具有一定的抑制作用，但醇提物中各成分之間的協(xié)同作用有待進(jìn)一步研究。